La técnica del pinzamiento de membrana Un procedimiento sencillo para aislar canales iénicos de las membranas celulares, Sus autores, ganadores del premio Nobel por tal descubrimiento, explican lo que la técnica ha revelado sobre la sefalizacién celular a transmisiOn de seftales entre I células, y en el interior de éstas, se halla _mediada por canales idnicos, proteinas formado- ras de pores ‘incrustadas en las membranas plasmiticas de casi to- das las células, En cl organism, os canales iGnicos producen los desietlos de Ta actividad eléetrica que excita neusonas y células mus- culares. En los rganos de los sen- tidos, los canales trasforman los ¢s- timulos fisicos © quimicos en sefia- Hes eléctricas dirigidas al sistema nervioso. Incluso células sin cone~ xién con el sistema nervioso cen tral (las de Ia sangre, del sistema inmunitario, del higada y otros 6r- ganos) usan canales iénicos en pro- esos de sefializacién. Desde los aiios cincuenta los bié- Togos han podido estudiar, en un i vel macroscépico, las corrientes eléc- tuicas que se originan a partir de estos flujos inicos. Pero hbo que es- porar a los aflos setenta para que el ‘examen aislado de los canales de iones se convirtiera en realidad. La técnica ERWIN NEHER y BERT SAK- MANN reciieron conjuntamente en 1991 el premio Nobel de fistlogta por su deseripelén de les canes idnicos mediante $0 tecnica del pinzamiento Je membrana. Neher ex director del depar Tamenta de biofisicn de Ine membranas del Tasticuto Max Planck do Quimica Biofibica de Gouingen. Cursé la eaters ‘de fisieas en el Poiiteenico de Munich, ‘donde se doctors, tras uma etapa de pro: fundizaci6n en’ Estados Unidos, en 1970, Sakmana es directo del Jeparta- mento de fisiologia celular del lastturo Max Planck de Investigaciones Médicas dde Heidelberg. Terminé sus estudios ‘medicos en 1969 en In Universidad de Munich, Entte. 1970 y- 1973, gracias @ tuna beea del Consejo Britinico, estudio biotisica en Londres con Bernard Katz, premio Nobel ambien, 4 Erwin Neher y Bert Sakmann del pinzamiento, por euyo descubri- rmiento acabamos de recibir el premio Nobel de fisiologia y medicina, per- mitié acceder a estos detalles. ‘Aunque su desarrollo y_perfeccio. namiento se ha prolongado durante affos, Ia técnica es bastante. simple: una pipeta de vidrio muy fino y con tun disesio adecuado se apoya firme- mente contra una membrana celular, queda asf aislada una zona pequetia de la membrana_con los cavales i6- nicos que contiene. Estos canales pueden manipularse por procedimien tos quimicos © eléctricos y de ello obtener datos que permitan deducir sus propiedades. El investigador pue- de extraer un fragmento de la mem- brana 0 abrir con cuidado una ven~ tana en la célula para modificer sus constituyentes citoplasmaticos. En to das esas aplicaciones, Ia tCenica det pinzamiento ha facilitado el examen de la influencia de los canales ini feos en el potencial de membrana, en Ia secrecién y en la contraecién, en- tte otros procesos. ‘Centenares de laboratorios de todo el mundo han adoptado y extendi- do el uso de Ia técnica del pinza- miento desde que Ia introdujimos en 1976, Cuanto aqui exponemos sobre o que este procedimiento ha revela- do acerca de los canales iGnicos y sus funciones se basa no s6lo en nues- tras aportaciones, sino también en las de’ muchos otros investigadores. Nest, intends por tos onates nicos nacis de la Iectura de dos amticulos fascinantes que apare~ cieron en 1969 y 1970, cuando py pparibamos la tésis de’ doctorado y nos dedicabamos al estudio de la binfisica de las membranas en el de- partamento de psiquiatria del Insti- tuto Max Planck de Munich, Los ar- ticulos estaban relacionados con el tema de las membranas lipidieas ar- tificiales, que en su forma pura son aisladores eléetricos. Ross C. Bean ¥y sus colaboradores, de la empresa Ford Aerospace, y Steven Hladky y Denis Haydon, dé la Universidad de Cambridge, demostraban en ellos que, si se insertaban en las membra- nas’ trazas de ciertos. antibiéticos 0 proteinas, se hacian conductoras de electricidad. Los cambios discretos fen la corriente que discurre a través de las membranas sugerfan que las proteinas creaban canales semejantes @ pores que se abrieran y cerraran luo a uno. Los jones cargados po- ddrfan asf atravesar la membrana por los canales.abjertos. Resullaba claro, para muchos, que las sefiales eléetrieas en las neuronas yen otras células debian estar me- iadas por protefnas semejantes en las membranas plasmétieas de natu- raleza lipfdica que las rodean, Allan L, Hogdkin y Andrew F. Husley, de Cambridge, habfan invocado antes el concepto de canales iGnicos en su anilisis elisico de las comientes a través de las membranas de los ner Nobel en 1963, Quienes trabaidba- mos en biofisica de membranas veia- ‘mos que, en cuanto se perfecciona- sen las ‘técnicas de medida para conseguir Ia resolucién adecuada, se deseubrirfa todo un microcosmes de moléculas de sefalizacién, En los afios siguientes continuaron acumubindose datos acerca de los ca- rales inicos de _membranas celula- res. Recordemos, en particular, el anilisis estadistico de las Muctuacio- res de potencial en la unidn neuro- muscular (sinapsis entre una neurona ‘motora y una fibra muscular) que en el University College de Londres le= varon a cabe Remand Katz y Ricar- do Miledi, en 1972; llegaron a Ia conclusion de que las sefales sindp- ticas consistian en pequeiios fenéme- nos eléctices, iuales en magnitud a los relacionados con cansles artificiles Ivreescios y Cave, mayo, 1992Pero Katz y Miledi slo pudieron inferie 1as propiedades de los canales fa partir de su andlisis, y éste depen- dia de varias hipétesis. No se dispo- rnfa entonces de métodos que permi- tiosen Ia mediciGn directa de los fenémenos unitarios que constituyen Ja sefal sinfptica. Bl ruido de fondo de las téenicas habitwales de medida de Ia corsiente eléctrica que pasa a tra- vés de una membrana era de s6lo la diezbillonésima de ampere, valor, sin embargo, que centuplicaba todavia el correspondiente a una sefal unitaria, Jo que bastaba para ahogaria sraansvcnaey Cnn tA mye, 1902 demos estudiar lor canal exterior. La pipeta, que mide eu fwulutas le didmeteo, asta Fisica y eléctricamente los eanales En 1973 decidimos abordar Ia re- duecién del sida de fondo. Sabi mos que, con los componentes clec- trénicos disponibles, se podia con- seguir la resolucién necesaria para la medida, a condicién de que se logra- se aislar del resto un pequefio frag- mento de la membrana. Aplicamos tuna micropipeta de vidrio a la super- ficie de fibras musculares, sometidas a previa limpieza enzimética. Nos fuiaba la esperanza de que la pipeta de vidrio no conductora aislarfa al- gunos canales iénicos, y que con ello obtendriamos una sefal clara, Vinicos atrapades, Gracias a esa téenica de pinzamiento de torama celular podemos registrar la apertura y el cierre de los canales iGnicos. Se esti yo empleando para adentrarse en as tees de sefalizacin del interior celular. No resultaba nada féeil conseguir un cierre perfecto entre Ia pipeta de vidrio mensuradora_y la membrana, Lo mismo que muchos otros que nos hhabfan precedido en el uso de pipetas extracelulares, tuvimos que enfrentar- nos con las fugas eléctricas que co- nectaban cl liquido extracelular con el interior de Ia pipeta. Sin embargo, gracias a Ja limpieza exhaustiva de Ia superficie celular y a [a optimiza~ cién de la forma y el tamano de Ia pPipeta, logramos registrar corrientes de canales individuales que se pro- ducfan en repuesta a la acetileolina,Triple forma det pinzamiento de membrana esionando con una pipeta de Pires hs pte de tina celal, previa limpiera oi Zimética de estar y aplicando una re de un gigaohm alrededor de tna zona mintiseula de la membrana celular y los canales ionicos. que ontiene (0) Fosemos aplicar enone ces diversosestimulos desde el inte Mor de ls pipets'y metre comporta: miento dd los canals atrapades, © ben, podemos arrancar de la clu la zona atrapada de ln membrana, dejar. dio expuesta la boce ctoplisinica de Jos canales (8) Sh arancamon esa fe gién sin perder cl sello de un ge frohm (0), podremos alters es coh bbtuyentes del citoplasma celular. el transmisor (Sustancia quimica in- ductora de sefiales) de Ja unién neu- romuscular, Esos_primeros experi- mentos confirmaron Io que ya se sospechaba acerea dela existencia de cortientes elementales a wavés de los. canales iénicos, y en. particular Ja idea de que se trataba de fenéme- ‘nos pulsatiles de amplitnd constante y duracion vasiable La baja calidad del ciere entre Ix pipeta y la membrana, con el consi uiente ruido de fondo, nos impidié realizar re ‘Gnicos que no fuesen los que se encontraban en la unién neuromuscu- lar, Unos aftos después descubrimos por azar, que, al aplicar una ligera svccion a través dela pipeta, jinto con otras modificaciones de la técni- ca, Se clevaba la resistencia hasta mas de un billon de obms, una me ora de virios. Grdenes de magnicud Si tirdbamos suavemente de la. pipe= 1a, comprobamos, podiamos rebanar fragmentos microseépicos de mem- bana para su estudio por separado. Desde entonces, el registro de cana- Jes iénicos ajslados se convintié en tuna técnica de alta resolucién, Los experimentos sobre Ja unin neuromuscular del miseulo esqucleti- co han aportado abundante informa- ign det papel que los canales i6ni cos. desempenan on 1a. transmision sindptica. Las neuronas.presindpticas de esa zona liberan acetilcolina en ‘cantidades muitimoleculares discretas (Paquetes multimoleculares) que reci- ben el nombre de “cuantos”. Las moléculas de acetileolina se unen transitoriamente a canales receptores de acetilcolina, constituidos por pro: teinas especializadas de la membrana postsinéptica, y provocan una co- riente que fluye a través de la mem- brana de la placa terminal, Esta co: smiemte de la placa terminal es la suma de las cocrientes elementals que fluyen por cientos de miles de canales, Pres meats estas corienteselemen- tales una a una, se presiona Ia punta de una pipeta de pinzamicnto sobre la placa terminal de una fibra muscular. Esta regién de la super~ ficie muscular contiene el canal ze- ceptor de acetilcolina. Cuando en Ia solucién de la pipeta esta pre: sente la acetileolina a baja concen- tracién, Ia corriente que se registra alterna’ entre dos niveles, A un ni- vel, no fluye corriente alguna, por- que todos los canales iGnicos del fragmento de membrana estin ce- mmados, Cuando una molécula del canal pasa al estado abierto, como consecuencia de la aplicacién de un voltaje a la membrana, fluye de ma nnera abrupta a través de ella una comriente de unos 2,5 picoampéres ‘Tras un perfodo variable, la molécula pasa de nuevo al estado cerrado, y [a corriente se interrampe. La apertura del canal del receptor se pone en marcha con la vnién de ste a Ia acetileolina; su separacién provoca de nuevo el cierre del canal. La gran variabilidad del periodo de iempo que el canal permanece abier- to 0 cerrado refleja la naturaleza probabilistica de las interacciones en- fre las moléculas de acotilcolina y sus receptores. La ampliuud de Ios saltos de comriente representa Ia ca pacidad del canal para transportar jones, como los de sodio © potasio en el caso del canal receptor de ace Uileolina, Al comparar las amplitudes de la coriente y la distribucion de la duracién con las. predicciones de las diversas hipstesis, podemos determinar c6mo interactian 10s io- nnes con una molécula del canal y de qué modo Ja interaccién entre teans- misor y receptor controla la apertura y el clerre del canal, En las sinapsis del sistema nerviow so central, los aminoscides.glicina, ficido gamma-aminobutirics (GABA) y L-glutamato constituyen los princi pales clementos de seftalizacién para el establecimiento de comunicaciones ripidas. La forma pulsstil de las co- rmientes registradas sobre los canales que se ligan con estos transmisores indica que también se abren y se cierran al azar. Los canales dé los reeeptores pueden, por tanto, funcio- har a la manera de los canales del receptor de acetilcolina en la placa terminal. A pesar de lo cual, los ca- nales dependientes de transmisores en el sistema nervioso central pre~ semtan a menudo complejidades adi- cionales, como la de que algunos podrfan' hallarse slo parcialmente abiertos o cerrados, y lade que pue= ddan existir subtipos diferentes en las diversas regiones del cerebro, La transmisién de. informacién desde el sistema nervioso central a Ta placa neuromuscular tiene que ser extremadamente ripida. En Ios axo- nes neuronales eubiertos de mielina que ttansportan esas sefiales en los vertebrados, la conduccién no esté mediada por canales dependientes de Isvasget¥ Cenc, mayo, 1992ransmisores con compuerta c: que acabamos de describir, sino que Jo est por canales més répidos, que responden a cambios del voltaje de la membrana, a Ia diferencia de potencial eléctrico entre el interior y el exterior de la célula, La’ canales de iones de sodio de- pendientes de voltaje son los respon- Sables de la elevacion rapida del po- tencial de acci6n de las neuronas. Bl anilisis de las corrientes elementales de sodio indica que los canales sen- sibles al voltaje altervan entre dos estades y tienen una gean proba. bilidad de abricse poco después del inicio de un cambio de voltaje. Las corrientes que apoyan el impulso nervioso se generin por Ia superpo- sieion de decenas de millares de 1a les corrientes elementales de sodio, Los canales para otros jones, como los del potasio y del calcio, depen ientes de voltaje, parecen fencionar 4 la manera de los canales de sodio, ¥ comparten con ellos muchos rasgos structurales, La técnica del pinzamiento de membrana aplicada a los canales de= pendientes de transmisores y de vole {aje ha revelado mecanismos molecu lures dingmicos de un nivel de etalle:raucho mas fina que el aqui ‘expueste, En casi todos los canales vinivos estudiados, se nos manifiesta aque el fendmeno elemental no es un pulso de eorriente, sino una serie de pulses teansitorios y- separados por hreves intervalos, Cuando un canal ie receptor en la placa terminal de wna nién neuromuscular se engar 2a en [a acetileolina, por ejemplo, se vee y Se cierra varias veces antes Wer sro Ennead. my, 1992 de que la acetilcolina se disocie rnalmente de él. Pies nvestizn ta esuctra de estas transiciones de los canales de la placa terminal en colaboracién con David Colquhoun, del University College de Londres. Haciendo uso e Ia teoria de probabilidades hemos ealculade el mimero de estados que tun canal de acetilcolina adapta du- rante uma sucesion de aperturas y cis ses, asf como la frecuencia de transi ciéa de un estado a otro. Tales estu- dios nos indicaban que cada receptor posefa dos lugares de unin para la acetilcolina. Cuando ambos lugares estin ocupades por moléculas de ace- tileolina, [a probabilidad de que el ca nal se abra es cercana al 100 por cin. Dada tn concentracién elevada de ace- tileolina en la hendicnra sindptica, los canales de la placa terminal pueden actuar como interruptores. de corriente cotrolados quimicamente Los canales de membrana se_nos smuestran heterogéneos. En un mismo fragmento de membrana aparecen ac~ tivadas dos 0 mas clases de canales estrechamente emparentadas. Los far~ macélogos conocen, desde hace alos, Ja existencia de diferentes. subtipos de receptores; ahora bien, gracias a Jas hertamientas mucho ‘més finas hoy disponibles, verbigracia el ADN recombinante, se ha visto que la di versidad de subtipos es muy superior a la imaginada, Para cada tipo de ‘canal, est mediado por transmisor 0 por voliaje, existen varias versiones © subtipos con distinta conduetancia © propiedades referentes al control de su compuerta que forman una fa- milia de canales. Los estimulos ex- femos y la etapa de desarrollo de un organismo pueden alterar el mosaico REGISTRO DE LA CORRIENTE CANALES open ootacs — iT f aed 2. CANALES RECEPTORES de lé placa terminal nouromuseul (Merron FLU, ses (CANAL ABIERTO se abrem en res- puesta al (ransmisor acetleolina. Ba ausencia de acetilelina, no pasa la corriente a través del canal. Cuando la acetilelh Se liga al receptor, se produce una corriente elemental de unos pocos picoampéres. La duracion de estas corrientes y el intervalo aIseACION e ae R APARATO DE GOL! 3. HUEVOS DE RANA MANIPULADOS POR INGENIERIA GENETICA, una he- ‘ramienta itil para el estudio del comportamiento de los canales idnicos. Se pueden Inyectar secuencias de ARN que codifican subunidades de los € BI huevo sintetizard entonces 1us proteinas del eanal y las ra en la superficie de su membrana, dejéndolas asi accesible a la pipeta es para experimentos de pinzamiemto (6). terior de wn bev de subtipos de canales gue se en. cuentran en las membraas celulares. MisiGn primera en toda investiga” cidn de los canales de membrana es la de averiguar a relacién entre las propicdades funcionales de esos p. 10s. y sus estructuras_tridimensiona- les. ‘Para cumplir ese objetivo hay que localizar y cambiar secuencias ctiticas de aminofcidas en la protes- ppa del canal, a fin de observar luego el efecto de dichas alteraciones en el funcionamiento del canal, Pudo acometerse ese tipo de expe- rimentos una vez se consiguié clonar y_secuenciar el ADN de cada subu inidad del receptor de acetilealina. En esa linea, junto con Shosaku Numa ¥ sus colsboradores, de In Universi- dad de Kioto, hemos trabajado con canales del receptor de acetilcolina, normales y genéticamente alterados, cn las membranas de las células hhuésped, tales como los huevos de Ia ana de ufias africana Xenopus. A partir de las copias de ADN que codifican ef receptor de acetilcolina hhemos sintetizado, en el tubo de en= sayo, moléculas de ARN mensajero complementario. Bstas secuencias de ARN pudieron inyectarse en las. cé- Inlas del huevo, que tradujeron en tonces la informacion genética en pro- feinas del receptor y las insertaron en las membranas celulates. Las pro- piedades funcionales de estos canales de receptor recombinantes son seme- Jantes a las de los canales de Ta placa terminal en Ia wnién neuromuscular, Esta combinacién de téenicas nos permitié descubrir las diferencias es- tructurales entre Ios subtipos de los 18 es ianicos en el canales de la placa terminal en el muisculo. El registro de la corriente elemental de Ja placa terminal ha re- velado que el misewlo de maméfero produce dos subtipos de canales de placa terminal: un subtipo de baja Conductancia, que aparece _predomi- nantemente en el misculo fetal y en cl del neonato, y un subtipo de cone ductancia elevada con propiedades diferentes de compuerta, que se ex- presa en los misculos’ del adulto. Durante el desamollo postnatal, el subtipo fetal desaparece gradual- mente y se sustituye por el subtipo adulto. ‘Como han revelado los expe- imentos con técnicas de ADN Te- combinante, el cambio de los. tipos de canales se genera por cambios en Ia expresion de genes que codifican lias subunidades de los canales, 1¢ ha reeurrido a técnicas similares para localizar las secvencias de aminoscidos en Ia proteina del recep- tor de acetileotina que forman la pa red intema del canal de la membra- nna. El anilisis de las secuencias de aminodcidos en las subunidades har bia sugeride que cada una constaba de cuatro segmentos que atraviesan la membrana, y que Tlevan Ia desig- macién de MI a Md. El canal del receptor de acetileolina parecia estar secubierto por varios segmentos que atraviesan Ta membrana, como las dduelas de un tonel; habria una subu- nnidad para cada segmento, Con téenicas de ADN recombinan- te hemos conseguido genes de canta les quiméricos, constituides por sub- tunidades de especies (vaca y raya cléctrica) cuyos canales tienen pro- piedades conductoras diferentes. AL analizar las propiedades de estos ca- nales quiméricos, descubrimos que el segmento M2 y Sus regiones vecinas ‘encerraban determinantes importantes del transporte iGnico. La induecién ‘de mutaciones que provocsban susti- tuciones de aminodcides en esas re- giones nos permitis perfeceionar el mapa y precisar la localizacién de esos determinantes. Hemos visto que tres cimulos de aminoscidos cargados negativamente pueden formar anillos en las bocas extracelular e intracelular del canal; tun anillo semejante de aminoacidos polares esti presente en la poreién (que atraviesa la membrana junto a la boca intracelular. (Los amiinodeides polares poseen estructuras eléetrica- ‘mente polarizadas, aunque carecen de carga neta) Estos anillos carga- dos negativamente influyen de mane m decisiva en la velocidad del flujo de la comiente y pueden seleccionar jones particulares para su transporte a través de la membrana; se permite el paso de jones sodio y potasio, ccargados positivamente, mientras que se impide el paso de iones cloruto, cargados negativamente, Nuestros te- sultados sugerfan que los aminodei- dos polares, situados también junto a Ja parte intracelular del segmento de M2 que atraviesa la membrana, for- ‘maban la parte més estrecha del ca- nnal det receptor de acetilcolina. Lsytéenica det pinzamiento no se limita a revelar los pormenores moleculares de Ie funcién del canal; podemos valernos de las pipetas para cl estudio de mecanismas de sefali- zacién celular, un procedimiento de- hominado andlisis por pinzamiento de voltaje. Esta ténica aventaja a los microelectrodes convencionales en la medicién de fenémenos en eélulas pequetias, El anélisis por pinzamiento de voltaje por medios convencionales contsibuy6 decisivamente al esclare- ccimiento de los procesos de sefali- zacién en el sistema nervioso. Lo introdujo en 1949 Kenneth S, Cole, del Laboratorio de Biologia Marina de Woods Hole. Hodgkin y Huxley Jo usaron para desentrafiar los meca- nnismos bésicos de la excitabilidad del nervio, La técnica implicaba, en pala- bras de Cole, Ta “doma del axsn”: forzar un potencial transmembrana so: bre el axén de una neurona. Las co- rientes. de membrana resultantes pue~ den entonces medirse e interpreta, Por desgracia, la mayoria de las técnicas de pinzamiento de voltaje requiere que ambos cables axiales 0 al menos dos microelectrodos. se in- vesticact¥ Cai, mayo, 1992serten en una célula, lo que general- mente sélo es posible con los tipos mayores de células animales 0 veze- tales, Las células de mamfferos, euyo didmetro varia de 10 a 30 mix crometios, a duras penas toleran el impalamiento con. un microelectrode estindar, Antes de que se hubiera Mesarrollado Ia tSeaica del pinza- miento de la membrana se conocia mucho mejor el potencial de accion en el axon del nervio gigante del ccalamar que los impulses nerviosos el cerebro humano; en el mbito de las células vegetales se conocian me jor las senales de algas gigantes, que las del maiz, Ins del trigo o las de 1a remolacha, 2. posiblidad tograda de un cere L'itin gigaotin ente one peta de’pinamiento yuna membratia = Tule puso aca aleance eh min: Go de las, ceulas de os mamifexos Yel'de tras celulas pequetas, No Solo nos facatana para modir_Tos Ganales de. membranky sno ‘ambien para plier el pinzamiento de volta Jes eelulas pesuesas, Con sn poco de suerte se puede desprender ol re tazo de membrana pineado sin ror. per el cere 0 sll de la ppeta con Ir membrana cievadanteabriendo asian acceso. al itoplamna Esta Contiguracién, que recibe et nombre Ge registo con sella enters, 88 3 imcj a elisicosmpalamiento con mi crocletrodo, Con el afaddo de que fo ole eéulas macho més peque- fas 9 prdporcions un control tcho Imejor sobre el medio atacetul I repisto con cflula enters me- diane este tipo de pipeta se oventa Javene los procesesrutinaror dela hvestigachn en cultivos celulares de imamifers. Las. props plagues. y Rematies homnanos “eels dunes focor micrometer de diimero— han Fosido someterse a pinzamienios de Nota con este rpo de pipet, Ast, Invmayorta de los tipas cellees de imate clinico so han hecho asses bies a un andisisbioisco, yen iuchas enfermedades, como ta fio sis quisica, se ha podidoestablecer tna Telacign con et Tuncionamiento leticteme de dichos canalee a. precisidn.alcansadn recente mente el registro con cells ent Th tenia aeogida muy favo ‘able por parce de ques investigan ths sone elétricns en el sistema nervioso cental, Por culpa ‘des CSmpljidd las tWonicns de. pina: nieifo de voltae que venfan at ivando s6lo podian spice a neu. onus asada. El ines, bildgico Ui"los resultados ‘obtenidos. con Novellas es Lilado, porgue Tes ius no extn en contacto con Sus Ivsmeacion'y Crier, mayo, 1992 veeinas naturales, Puede darse que los canales estudiados en eélulas en cultive no presentaran idénticas pro- piedades cuando se allen en el r- ano del que proceden. Incégnitas que resultan preocupantes si habla- mos de células del sistema nervioso ‘central, que poseen una especificidad muy elevada y una arguitectura muy celaborada, ‘Asi las cosas, disefiamos_una ¢s- trategia para aplicar el méodo de registro con célula entera al tejido cerebral respetando el entorne natu- ral de Ins neuronas. Per Anderson, de la Universidad de Oslo, y Tomo Takahashi, de Ia Universidad de Kio- to, habian ideado un procedimiento para obtener una pequefia rebanada ‘CANAL FETAL de tejido cerebral de un centimetro de ancho. La superficie de Tas neu- ronas se limpia de células de glia y de otras tejidos adherentes. proyec- tando con gran cuidado, sobre le superficie de Ia rebanada, solucién de lavado, Luego, se presiona con la punta dea pipeta de-pinzamiento Sobre la superficie de una de as reuconas expuestas hasta perforar Ia ‘membrana para realizar el registro de uuna cstula, Semejante procedimiento ‘no permite medit las corrientes si- nnépticas con una resolucién que su pera en 10 a 50 veces In que se consigue con los microelectrodos in- tracelulares. ‘Cuando una de las neuronas libera glutamato de sus estructuras. presi- (CANAL RDULTO SSECCION TRANSVERSAL EGISTRO, (DE LA CORRIENTE DEL CANAL FETAL REGISTRO DE LA CORRIENTE DEL CANAL ADULTO so maeaUNCCS 4. ESTRUCTURA de los eanales reeeptores de acetleolina, estructura que guarda in. Cada canal consta de cinco subunidades; cada subunidad con- membrana. El segmento M2 do cada sul ‘mado de duela en un tonel EL fero de los dre iferos produce wn receptor de acetileolina en las placas terminsles newromusculares. que ifiere del_que posce el adulto en una de I corrientes elementales sean menores ‘subunidades. La diferencia de esta 19ndpticas, induce cortientes excitado- as postsindpiicas (CEP) o corrientes inhibidoras -postsinépticas (CIP) en tuna neurona vecina. (Las CEP aumen- tan la probabilidad de que se genere tun potencial de accién y se Liberen transmisores propios; las CIP rebajan esa probabilidad.) En el registro con célula entera, las amplitudes de! pico de las CEP y de las CIP fluctian al azar en pruebas sucesivas. Esta ob- servacion sugiere que las CEP y las CIP son el resultado de la superpo- sicidn casi simultinea de fenémenos “eudntices”, de manera semejante a lo que gcurre con los fenémenos “cusn- tieos” que dan rigen a las corrientes, de Ia placa terminal en 1a unién new- romuscular. Con sorpresa por nuestra parte comprobamos que slo unos 20 0 30 canales de receptores postsinapticos parecen abrirse en respuesta aun ‘cuanto’ © paquete de moléculas de transmisores liberadas. por una nica vesicula presinaptica. Este niimero es menor, en varios Ordenes de magni- tud, que el de una sinapsis neuromus- cular. En el sistema nervioso, esa respuesta limitada permite, a buen seguro, afinar el grado de exeitacién © de inhibicién provocado por tas sefiales que aetiian sobre una neurone La resolucién de tales fenémenos “cuiiuticos” en el sistema nervioso central nos faculta para distinguir los factores presindpticos y postsinspti- 0s que subyacen en los cambios de rendimiento sindptico. Tales cambios se han observado a raiz del uso 0 de la ejercitacidn de una neurona, La Ccomprension de la eficiencia sinspti= ca puede, por tanto, ayudamos a en- tender ef sustrato biolégico del apren- dizaje y de la memoria, Li secanates ions forman parte de una red compleja de mecanis- ‘mos de sefalizacién en la que inter- vienen también segundos mensaje- ros: moléculas capaces de transportar seflales desde la superficie de Ins o&- Iulas hasta sw interior, en su difusin a través del citoplasma, Las activida- des de muchos tipos de canales que responden primariamente a transini- sores extemos 0 a cambios de volta- je estan influidas © moduladas. por ‘esas. sustancias intracelulares. Los ccanales idnicos ejercen, asimismo, un efecto reciproco sobre’ las funciones de las moléculas del segundo mensa- jero: casi todos los segundos mensa- Jeros conocidos interactian con cier- tos canales inicos, directamente 0 a twavés de otras molgeulas, incluidas las quinasas (enzimas que fosforilan ‘moléculss) y las proteinas G_ (que acoplan receptores a enzimas que ca- talizan Ia formacin de muchos. se- ‘gundos mensajeros). Buena parte de los canales i6nicos de potasio, de las neuronas, se hallan condicionades por el potencial de membrana y por la concentracién in tracelular de los iones de calcio, Si esta concentracién es baja, no. se abririn los canales de potasio, salvo que las despolarizaciones (cambios fen el potencial de membrana) sean muy grandes; cuando la concentra cién de calcio es alta, comienzan a abrirse con despolarizaciones mode- radas © incluso con el potencial de repose, Los canales que especificamente controlan la entrada de iones caleio fen Ia célula estén, a su vez, regu: lados pot las eoncentraciones det ion calcio, Estos canales se abren en Fespuesta a despolarizaciones, si bien algunos tipos los desactivan los jones calcio que penetran en la cé lula, Podemos ver en ello un meca- nnismo de retroinhibiciOn que regu- la Ios niveles de ealeio, que es, @ su vez, un segundo mensajero im- portante para muchas actividades celulares, NeURONA, PRESIAPTICA Ee PIPETA NEURONA POSTSINATICA, Na Un scuaNTo" EstiauLo 008 “custo ‘2uSEaiN0s | rns “cuanTos' REGISTRO CON CELULA ENTRRA, en cl que wna pic peta de pinzamiento ocupa cl lugar del microelectrodo conven- Clonal, ha revolicionado el estudio de las célnlas de mamiferos, yen particular de las neuronas. Los clemificos pueden trabajar hors con pequefios cortes de tejido nervies® que contienen cidas en 20 sensible, detecta eorrientes de excitacin y de 1 entorno natural, La técnica, muy iio ide por paquctes (“ewantos”) Individuales de ula presinaptica (recua- Invesmicnci ¥ Clases, may, 19926, LA CELULA CEBADA (a fa érquierde) segrega histamina y biros compuestos en respuesta a un estimulo aplicado 2 través tle una pipeta de pinzamiento (centro). La téeniea de pinzs- para medir Tos cambios de la eapa- rilento de membrana No debiera, pues, sorprendemnos si result6 dificil resolver una red de tal complejidad de interacciones muttuas, con sinergismos y Iazos de retrocon= trol. E] registro de la setividad elée trica desencadenada por Ja estimula- cidn de células no bastaba para deshacer los nudos de Is red. Haba que someter a control algunos de 10s reguladores intracelulares. Fl método de la célula eaters proporciond ese control al dejamos manipular el con- tenido de una célula, ‘AL ser bastante amplia 1a zona de cconexién entre el interior de a pipe- tay el espacio intracelular, las mo- Ieoulas se difunden rapidamente de nino a igo, lo que entorpecta el de- sarrollo de ln experimentacién. En los trabajos primeros sobre célula cetera, los investigadores comproba- Fon que los mecanismos sutiles de contol se perdian por culpa de su ‘ifusién hacia el exterior. Muchas de Jas moléeulas controladoras solubles se dilufan en el volumen relative ‘casi infinite de la pipeta de medida Solo permaneefan intactos los cans les_muy robustos, En el transcurso de estos affos, muchos laboratories han ido descu- Iwiendo gradualmente las concentra cciones preeisas de las sustancias que iieben estar presentes en Ia pipeta ppara salvar la funcién propia de los liversos canales. As{ se nos ha ido fmanifestando la red de interacciones jentre receptores, segundos mensaje tos y canales idnicos; y, con ello, se nox ha concedido Ia posibilidad’ de teconstituir algunas de las vias de se- ialiacion, Ei mens, Jos onnaon nie ransmiten a las ¢élulas implica tomy menudo un cambie del calcio iniacelaar, A nosotras nos interes thy averiguar e6me Mega est seiial a respuesta celuky. Decidi- tear nests teneidn Ionian Cnc, aye, 8 sobre el papel del calcio en la secre ida. En teorfa, esos estudios demandan la medicign simulténea de las co tients inicas, Ia sefal de calcio y Ta sectecién en’ una misma eéiula, A euye ideal se aproxima bastante la combinacién del registro con célula eantera y un método de determinacién de calcio desarrollado por Roger Y. Tsien eft la Universidad de California cen Berkeley. La técnica de Tsien uti~ liza fora-2, un colorante que cambia sus propiedades fluorescentes cuando se une al calcio. La medida de la Fluorescencia del colorante permite caleular la concentracion de los ioues de caleio libre. ‘Mediante la técnica del pinzamien- to podiamos seguir las corrientes de jones y In secrecion de la manera siguiente. Las eéhulas segregan mate- riales a través de 1a exocitosis, pro- ceso en cl que las vesiculas de al macenamiento se funden con Ia membrana plasmatica y expulsan su contenido. El proceso comporta la fusion de las membranas vesiculares con la membrana plasmética, cuya superficie aumenta en consecuencia Este aumento se detecta Lacilmente en el cambio de Ia capacitancia de la membrana, que es proporcional a Ja superficie de ésta. Aunque el cam- bio sea a veces transitorio o peque- fio, Ia medida de la capacitancia es Io’ suficientemente sensible como para detectar la fusién de vesiculas ‘con Ja membrana plasmétiea En mu- ‘chos pos de células, estas semiales sirven para correlacionar la secrecién con Ia concentracién de calcio ints celular y con los fenémenos electro- fisioléuicos. Hemos estudiado las células oro: mafines de la glindula suprarsenal, {que segregan as hormonas adrena- fina y meradeenalina en momentos de esirés, Nuesttos primeros estudios hhabian puesto de manifiesto que las cltancia de Ia membea ‘secretara com sion se traduce en un salto en el registro de la capacitancia derecha). Fotografias de Julio M. Fernandes, 03 FIGOFARADS 10 SEGUNDOS ‘correspondon a la fusion de una membrana plasmatica. Cada fe 4 células cromafines poseen canales de calcio dependientes del voltaje, de ma nnera parecida a lo que ocurre con las cclulas nerviosas, Cuando las eélulas se estimulan eléctricamente 0 con aceticolina, se abren los canales de calcio y sube Ta concentracién de cal cio, fenémeno éste que puede medir- se fécilmente a través de la fluores- cencia del fura-2. La capacitancia de la membrana también aumenta, seal de_exocitosis, Si un quelante de caleio —un compuesto que liga iones calcio— esté presente en la pipeta, tanto Ia elevacién de la concentraciéa del calcio intracelular como la sefial de Ta capacitancia se suprimen en las ccélulas cromafines. Si la pipsta con- tiene un nivel alto de calcio, se indu- fee entonces un aumento del calcio intracelular y un aumento de Ta ca~ pacitancia, Estos resultados sugieren que la seereeién por parte de las células cromafines obedece a los mismos prineipios que Katz y Miledi vieron que eran aplicubles a ta libe- racién de acetilcolina en la uniGn neuromuscular. (vanes sepertinamos eso sata: ‘dios a eélulas secretoras no ex- citables, quedamos sorprendidos ante la relacién entre calcio y secrecién, Nuestuo tipo celular favorito en esta categoria es Ia eélula cebada, que se encuentra en el tejida conjuntivo. Es- timuladas con hotmonas 0 antigenos (mmoléculas de otros organismos), las ccélulas cebadas segregan histamina y otros compuestos gue median res- pucstas inflamatorias o inmunitarias. Bl interés de esas células para nues- tro trabajo residia en su abundancia de grandes grinulos de secreci6n, 0 vesiculas. Después de la estimulacién se produce en estas células una vi- ‘orosa exocitosis: su superficie aumen- ta entre dos y cuatro veces al cabo de 10 a 20 segundos. 2PLS CELESTRON Merri tsartrern (emer er ne tty rue tea ove, Conptadr, rsmilees. telescopios terrestres KOWA ¢ OBygyIV0S Dr FLUOr ura icoente inrnnocr brn CIENCIA, S.A. Durante el proceso de exocitosis fen que tiene lugar la liberacion de los grinulos de almacenamiento, 1a capacitancia de una célula cebada rece de manera esealonada, repre sentando cada salto la fusion’ de una vesicula, No se trata, empero, de sal- tos uniformes, Su amplitud oscila al- rededor de valores cercanos a un va lor medio, y la vatiacidn refleja ta distribucién de los tamatios de los sgranulos, Nos sorprendié ver que, al elevar la concentracién de calcio en el in terior de las eélulas cebadas, no se iniciase la secrecién, como sucedia con las células excitables. Durante algun tiempo legamos a pensar que ello obedecia a la difusion y pérdida de moléculas esenciales. Después su pimos que estas células requerian folzos estimules. Ciertas hormonas y anifgenos, cuando se aplicaban extra celularmente, provocaban una secre cién_vigorosa, por si solos 0 en si- nergismo con una sefal intracelular de caleio, Todos ios estimulos conduct variablemente a una sefial prominen- te de calcio —un aumento moments- neo de Ja concentracién intracelulan de calcio en més de un orden de magnitud—, después de cuya apari- ion acontecia Ia secrecién. E) pico transitorio de calcio se debia a la liberacién de iones almacenados. in teacelularmente. Se producfa también tina entrada abundante de calcio ex terior por vias no dependientes del voltaje, pero con escasa reperensién sobre la respuesta secretora. Aun cuando la concentracign de ealeio de la célula quedara fijada dentro de niveles bajos por haber incluido una ‘mezela quelante en Ja pipeta, In des- ‘granulacién procedta a un ritmo mé- Ximo después de la estimulaciin ex- tera 'No obstante, Ja concentracién de calcio influye Sobre las células cobs das. Si aguélla es muy alta, Ia seere- ci6n se produce con cierto retraso, hecho que podria explicar la base de muchas comunicaciones en Ins que se afirma que la secrecién inducida por calcio se ha oblenido con inyec- clones de calcio 0 de oiras moléet las que permiten que dicho ion po- netre en las células. También, porque después de Ia estimulaciéa, hormonal ‘© de otra tipo, la céhula parece ad- quirir una mayor sensibilidad hacia cl calcio: Ia elevacién subsiguiente del nivel de calcio acelera la desera- ulacion ya iniciada. En estas celu- las, pues, el calcio viene a ser une mas entre los. diversos. reguladores de la secrecién, ‘Todos los hallazgos recientes indi- can que el proceso secretor esta bajo control de una red de yias de sefiales ccon relaciones entre sf, semejantes a Jas que modulan los canales iGnicos Los componentes de esta red parecen ser los mismos: y de manera muy prominente, el calcio (particularmen. fe en las neuronas y en otros tipos celutares), segundos mensajeros, qui rnasas y probablemente proteinas G. Nuestros conacimientos acerca de las interacciones que regulan Ia se- cerecién se encuentran todavia en su fase incipiente, mionteas que tene mos perfilada ‘le red que controla los canales idnicos, buena parte a la zamicnto. Br conclusion, la extraordinaria sensibilidad de la técnica del. pin- zamiento de membrana nos ha leva- do hasta el funcionamiento molecular de los canales. Merced 2 esa técnica, potente y sencilla a la vez, nos es Gado también estudiar las eélulas mi niisculas de los tejidos de los mam feros y seguir la pista de las sefiales mediante el control del medio intea- celular. A medida que aumenta el niimero de investigadores que la adoptan, se afianza nuestra esperanza de que Seguira siendo un instrumento fica para desvelar secretos que [a eélula avin guarda celosamente en su BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA, Iurroven Pater CLAM TecinQues FoR HIGH-RESOLUTION CURRENT RECORDING ROM CHIL AND CELL-FREE MEMRANE Patexts.O. P. Hamill A. Marty, E.Ne-~ her, B. Sakmann, FJ Sigworth en Pi gers Archiv: European Journal of Phy ology, vol. 391, a2 3, pags. 85-100; agosto de 1981 THE PATCH-CLA@ TECHNIQUE. 1 THE 'SiDY OF SEEREMON. Reinhold Penner win Nebo en Trond dn Neurosciences, vol 12, m2 4, pigs. 159-163; abil de roR8, AVTwt Suice PREPARATION FOR PATCH ‘CLAMP RECORDINGS FROM NEURONES OF TM, MAMMALIAN CENTRAL NERVOUS Svsreu. F.A. Edwards, A. 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