128
Chapite 6
Une fois qu'un RFLP a ééaffecté& un groupe de
liaison, on peu le locals sur la carte géndtique, et
‘éterminer la distance génétique qui le spare des mar-
aqueurs adjacens. Une étude intensive des RFLP de
homme etd la souris a permis d'éablir les cartes de
Tiison des deux génomes. La carte humaine conient
plus de 5000 marqueurs, séparés par une distance
‘moyenne de 1,6 ceniMorgan: la cate de la souris
contient plus de 7000 marquewtsdistans en moyenne
ut tester I liaison ds sits qui n'ont
pas encore Et identifiés avec les sites commu, ce qui
perme ensuite dels placer rapidement sur la arte.
Les cartes de RFLP de "homme font apparafre des
caratéristiquesinéressantes. Les taux de recombinai-
son son différents cele hommes et les femmes. La
carte d'un autosome donné est 1.9 fois plus longue
chez une femme que chez un homme, ce qui signifie
Wil y a environ deux fois plus d'événements de
recombinaison dans les ovocytes que dans les sperma
tozaids. Il y a done environ 1.2 x 107 pb par uni
génétique che? les hommes, contre environ 7.10% pb
par unit génétique chez les femmes (voir Tableau
6.1. La longueur génétique de chaque chromosome
(en unités génétiques) est proportionnelle& sa lon
ueur physique (ce qui démontre que la relation que
‘nous avons vue dans la Figure 3.8 pour D. melanogas-
ter existe pour dates espces et pour un nombre de
chromosomes plus importand Cette relation n'est pas
parfaitementuniforme cependant, ti existe des df=
{erences locales dans les frequences de recombinaison
pour chaque sexe. Il y @ une augmentation du poly-
sso
oxverz [100
at
"
go
rovoce
rec ewe) oxsise smoophisme et de la recombinaison aux extémités des
‘chromosomes.
De grands progres ont é1é accompli dans la tech-
nologie de cartographie, pour identifier les genes de
rnombreuses maladies humaines. Par exemple, la
Figure 6.11 presente une carte de Faison du chromo-
some X humain, d'environ 184 Mb et qui mesure
(chez la femme) environ 220 eM. L7idéogramme cen-
tral monte la structure physique du chromosome dans
laquelle sont figurées les bandes qui peuvent étre
visualisées dans certaines conditions (Ia technique qui
permet de fare apparaitre ces handes sera tratée au
Chapitre 26). La carte de gauche présente le limites
des emplacements des gines connus. (La hauteur du
triangle reliant le gene aw chromosome montre la limi-
te dela localisation du gene). Lacarte de droite montre
Jes positions relatives des polymorphismes de restic-
tion, La distance indiquée 2 c0té des marques poly-
en unités de carte génétique. L'étape suivante de Ia
caractrisation du génome consiste& éablir une carte
de restriction, c'estdire une carte physique qui
refléte les distances exactes entre les sites de restric
tion.
1 serait souhaitable de pouvoir rapporter Ia carte
‘génétique la séquence de I’ADN des chromosomes,
‘mais il est difficile d'soler de grands fragments
@'ADN. Méme le plus petit chromosome humain
contient environ 50 000 kb d° DN. Toutefois, DN
4 chromosomes d'Eucaryotes inférieurs peut désor-
Coat gine cara tao
xe pobmartcmes
‘moephes en liaison avec I'échelle de droite, relée la
liaison mesurée en centiMorgans. On peut se ree
‘compte de la déformation qui existe par rapport & la
carte physique en comparant emplacement des mse
4queurs sur la carte de liaison (regardez Iorientation
des différents triangles bleus : par exemple, DXZ1 et
DXYSIZ sont situés deux fois plus loin sur la carte
physique que sur la carte de liaison).
est remarguer que la carte des RFLP est une
carte de liison, Ala difference d'une carte pénstie
classique, elle est basée sur des RFLP mesurés daprés
Ja taille des fragments de restriction d°ADN et non 3
partir des conséquences phénotypiques des mutations
La distance entre les RFLP est mesurée classiquement
Isolement des pines | 129 mais étre isolé sans dommage, ce qui permet d'établir
directement le earyotype.
LLeexemple de la Figure 6.12 présente le caryotype
‘une levure, obtenu en séparant directement les ADN
cchromosomiques par une technique appelée électro-
phorése sur gel en champ pulsé (PEGE). S. cerevisiae
posséde 16 groupes de liaison. Certains ont des lon-
‘gueurs denviron 400 unités génétiques, alors que
{quelques chromosomes contiennent tts pew de muta
tions. On s'attend &.ce que les ADN chromosomiques
aient des longueurs variant de 2000 kb jusqu’® une
taille aussi petite que 300 kb.
‘Une application puissante de cette technique rend
possible la localisation directe d'un gene sur un chro-
‘mosome, en identifiant la bande d ADN avec laquel
il s hybride. En utilisant des souches de levure ay
‘des translocations génétiques eonnues, la cartographic
a Vimérieur des régions des chromosomes devient
possible. Grice & cette technique, on a pour la premit-
re fois la possibilité de relier directement une carte de
ison 4 ADN chromosomique.
Du point de vue de la cartograph
du_génome
Tmt sek Ua
00
Home
om,
700
sem
400
am
20
i
S898 BS
hhumain, la PFGE est importante parce qu’elle permet
de manipuler des fragments d’ADN d'sssez grande
tulle et de les localiser les uns par rapport aux autres.
Cela réduit sensiblement les difficutés que l'on pré-
voyait pour 6ablir une carte de restriction.
Grice aux spécifcités d'appariement des bases, une
double hélice d'ADN a une structure constante, indé-
pendante de sa séquence. La diférence entre des molé
cules individuelles d° ADN repose sur leurs séquences de
pires de bases, et non sur des changements importants
de structure. De tres petites différences dans les
‘séquences d ADN peuvent ére hautement significative.
Les mutations sont des changements de la séquence
‘d°ADN qui peuvent ne toucher qu'une paire de bases.
‘Comment peut-on déterminer la séquence exacte des
rucléotides d'un ADN ? La premitre approche du
séquengage d'un acide nuciéiques'inspirait du séquen-
age des protéines: couper la molécule en petits frag~
‘ments, déterminer leur composition en bases, et obtenir
des fragments chevauchants pour établir la séquence
exacte. Avec les protéines, lexistence des 20 acides
mings et de Ia varigté qu'il offrent est pratique; dans
le cas des acides nucléiques, le probleme vient du fait
qu'il n'y @ que 4 bases. Les techniques anciennes
aient done limitées, ne permettant de déterminer ta
séquence que de ts courts acides nucléiques.
‘Désormais il est possible de déterminer directement 130
Chapitre 6
les séquences d°ADN. En fut, les séquences d°ADN
peuvent re obtenues plus rapidement que les
séquences des protéines.
‘Tous les protocoles de séquencage reposent sur le
sméme principe. Chacun produit une série de molé-
‘cules d'ADN simple-brin, ayant une base de plus que
la précédente. Les molécules d’ADN qui ont la méme
séquence, mais qui different les unes des autres d’aus-
si peu qu'une base & une extrémité, peuvent ére sépa-
rées par électrophortse sur gel «acrylamide. Les
bbandes correspondant sux molécules de longueurs
croissantes forment une «échelle» que I'on peut suivre
sur environ 300 nucléotides
Deux types d'approche ont été utlisés pour obtenir
cette succession de bandes. La premitre utilise des
réactions chimiques qui coupent 'ADN au niveau
dune seule des quatre bases. L'aure fait appel & une
réaction enzymatique au cours de laquelle ADN est
-symthtisé in vitro de tlle fagon que la réaction se ter-
‘mine spécifiquement & une position correspondant &
tune base donnée.
Pour déterminer la séquence de la molécule par
une ou Tautre approche, il faut que le protocole
approprié soit réalisé pour quatre réactions différentes,
‘chaque réaction étant spécifique d'une des bases. Les
produits sont soumis a une électrophorése dans quatre
pistes paralleles du méme gel. La bande correspondant
-Aune longueur déterminée n'apparait que dans une des
‘quatre pistes. Cette piste permet de savoir quel ext le
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