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Turbidez estndar

Preparacin de la turbidez estndar de McFarland


Uno de los primeros usos de la turbidez para el clculo de la poblacin bacteriana
fue en la preparacin de vacunas. En 1907 McFarland desarroll una serie de
soluciones de sulfato de bario para calcular aproximadamente el nmero de
bacterias en soluciones de turbidez equivalente, segn lo determinado por los
recuentos en placa.

La turbidez estndar de 0.5 en la escala de McFarland preparada comercialmente


est disponible de varios fabricantes. Adems, la turbidez estndar de 0.5 de
McFarland puede preparase aadiendo 0.5 mL de cloruro de una solucin de bario
deshidratado (BaCl2x2H2O) al 1.175% (p/Vol) a 99.5 mL en tubos de prueba
idnticos a aquellos utilizados para preparar la suspensin del inculo. Selle los
tubos de turbidez estndar de McFarland se puede guardar hasta 6 meses en la
oscuridad a temperatura ambiente (22C-25C); descrtela despus de 6 meses o
antes si pierde algn volumen. (Marque el tubo para indicar el nivel del lquido y
verifique antes de utilizarlo para estar seguro que no ha ocurrido evaporacin, si
esto ocurre, debe prepararse una turbidez estndar fresca). Antes de utilizarlos,
agite el tubo que contiene la turbidez estndar, de manera que el precipitado
blanco fino de sulfato de bario se mezcle en el tubo.
La composicin de la turbidez estndar de McFarland y las correspondientes
densidades de bacterias (/mL) se presentan en la siguiente tabla.

Tabla 1. Composicin de la turbidez estndar de McFarland

La exactitud de la densidad de la turbidez estndar de McFarland preparada se


debe comprobar mediante un espectrofotmetro con un paso de luz de 1 cm; para
la turbidez estndar de 0.5 de McFarland, la absorbancia de una longitud de onda
de 625 nm debe ser de 0.08-0.1.
Dentro de otro modo, la exactitud de la turbidez estndar de McFarland puede
verificarse por ajuste de una suspensin de una cepa de control (por ejemplo, E.
coli ATCC 25922) a la misma turbidez, preparando diluciones seriadas 10 veces, y
desarrollando despus conteos de colonias en placa (Vase la siguiente figura
50).

Figura 1. Procedimiento para la preparacin y el control de calidad de la turbidez estndar


de McFarland.

La suspensin ajustada debe dar un conteo de 108 unidades formadores de


colonia/mL. Las figuras 51 y 52 sirven de gua para leer y comparar la turbidez
estndar de McFarland con una nueva preparacin de suspensin celular.
Figura 2. Comparacin de la turbidez Figura 3. Lneas de fondo para ver la
estndar de 0.5 de McFarland con una turbidez de una suspensin de inculo
suspensin bacteriana. en comparacin con la turbidez
estndar de McFarland.

Mtodo de conteo en placa para probar la turbidez estndar de 0.5 en la


escala de McFarland
El objetivo de este procedimiento es determinar el nmero de bacterias por mL del
fluido. Una suspensin bacteriana equivalente en turbidez estndar de 0.5 de
McFarland contiene aproximadamente de 108 bacterias por mL.
1) Prepara una turbidez estndar de 0.5 en la escala de McFarland, como se
descrito anteriormente.
2) Prepare una suspensin de un microorganismo de prueba (por ejemplo, E.
coli ATCC 25922) para enfrentar a la densidad de la turbidez estndar de
McFarland.
3) Haga diluciones seriadas, diluya 10 veces una suspensin bacteriana en un
medio de caldo adecuado. (Ejemplos de medios de caldos adecuados
incluyen: caldo de Mueller-Hinton, caldo TS, o BSF). Los siguientes pasos
a-i describen el procedimiento para hacer las diluciones seriadas.

Los materiales necesarios para las pruebas de turbidez estndar de 0.5 en la


escala de McFarland incluyen: siete tubos estriles de tapa de rosca, siete placas
de agar (con medio que permita el crecimiento de los organismos que se estn
probando) y pipetas capaces de medir, respectivamente, 4.5 mL y 0.5 mL.
Adems, es til una mquina vrtex para mezclar vigorosamente en los tubos.
a) Asegrese de que tiene siete tubos de tapa de rosca capaces de llevar
cada uno por lo menos 10 mL de fluido. Prepare los tubos de disolucin
aadiendo 4.5 mL de caldo estril en cada uno de los siete tubos de 10 mL.
b) Marque los tubos del 1 al 7, indicando la dilucin que tendr el tubo.
Marque tambin del 1 al 7 las placas del medio apropiado de agar.
c) Aada 0.5 mL de suspensin bacteriana hasta 0.5 de turbidez estndar de
McFarland al tubo marcado con el 7 y mezcle vigorosamente.
d) Pipetee utilizando la misma pipeta del paso c, y deslice la suspensin varias
veces dentro de la pipeta; transfiera 0.5 mL del tubo 7 al tubo 6, mezcle
vigorosamente.
e) Contine este proceso de transferencia de 0.5 mL a cada tubo sucesivo,
utilizando la misma pipeta, hasta que haya completado las disoluciones con
el tubo sucesivo, utilizando la misma pipeta, hasta que haya completado las
diluciones con el tubo.
1. Despus de mezclar vigorosamente el tubo 1, use la pipeta para
pipetear y deslice la suspensin en el tubo varias veces.
f) Transfiera o.1 mL del tubo 1 a la placa marcada con 1 utilizando la misma
pipeta.
g) Transfiera 0.1 mL de tubo 2 a la placa marcada con el nmero 2 utilizando
la misma pipeta. Contine este proceso con el tubo 3 y la placa 3, y con el
tubo 4 y la placa 4. (Si los laboratoristas no estn familiarizados con hacer
suspensiones bacterianas para enfrentar una turbidez estndar de
McFarland, pero se hacen responsables del procedimiento, el proceso
puede continuar hasta el tubo 7. Sin embargo, sembrar los tubos con una
concentracin mayor de medio no es obligatorio, porque hacindose as
habr que contar muchas colonias cuando crezcan.
h) Extienda el lquido en cada placa hasta cubrir toda la superficie utilizando
un rastrillo (varilla en gancho) y comenzando por la placa 1. Se puede hacer
una en gancho dndoles calor a una varilla de cristal de un dimetro de 2 a
5 mm a un ngulo de aproximadamente 60, con el extremo corto, que mida
aproximadamente 5 cm. Se puede utilizar un rastrillo de metal de acero
inoxidable de tamao similar como una alternativa al rastrillo de cristal. (El
lquido tambin puede ser extendido con una asa de inoculacin de alambre
o con una aguja rastrillo a un ngulo de 60, pero utilizando estos mtodos
es ms fcil que el lquido se extienda de manera uniforme).
i) Incube las placas toda la noche y cuente el nmero de colonias en cada
placa. Puede es difcil contar las colonias en las placas con los nmero 4 a
7, y si hay ms de 300 colonias por placa, ests no se podrn contar.

Resultados de la interpretacin del conteo por placa


Una turbidez estndar de 0.5 en la escala de McFarland es equivalente a
aproximadamente 108 bacterias por mL. La suspensin bacteriana original que
se parece a la turbidez estndar de 0.5 de McFarland podra tener un rango de
1.0 x 108 bacterias/mL a 9.0 x 108 bacterias/mL. Dentro de este rango, la
turbidez estndar de 0.5 es exacta; la diferencia ser evidente por el nmero
de bacterias que crezcan en la placa.
Despus que se aadan 0.5 mL de la suspensin bacteriana original (la cual es
equivalente a la turbidez estndar de 0.5 en la escala de McFarland) a los 4.5
mL de caldo en el tubo 7, se produce una suspensin de bacterias que
contiene aproximadamente 107 bacterias por mL. Se transfiere entonces 0.1
mL de esta suspensin a la placa nmero 7, la cual traduce aproximadamente
106 (1.000.000-9.000.000) bacterias presentes en esa placa. Si las bacterias
fueros diluidas correctamente: aproximadamente 105 ( 100.000-900.000)
bacterianas deben estar presentes en la placa nmero 6: aproximadamente
10.000-90.000 bacterias en la placa nmero 5; aproximadamente 1.000-9.000
bacterias presentes en la placa 4; aproximadamente de 100 a 900 bacterias
presentes en la placa nmero 3; aproximadamente de 10 a 90 bacterias en la
placa nmero 2, y aproximadamente de 1 a 9 colonias bacterianas podran
estar presentes en la placa nmero 1. Cada placa debe tener la dcima parte
de las bacterias de la placa con el nmero mayor inmediato superior.
Generalmente, la placa marcada con el nmero 3 ser la placa que se cuenta;
sin embargo, si hay ms de 300 colonias presentes en la placa nmero 3,
entonces se debe contar la placa nmero 2.