cavtruco & Enzimas: cinética e inhibicién Los enzimas son proteinas especializadas en la catalisis de las reacciones bioldgicas. Se encuentran entre las mas notables de las biomoléculas conocidas debido a su extraordinaria es- pecificidad y a su poder catalitico, que es mucho mayor que la de los catalizadores hechos por el hombre. Gran parte de Ja historia de la bioquimica es la historia de la investigacién de los enzimas. El nombre enzima («en la levadura») no se empleé hasta 1877, pero mucho antes ya se sospechaba que ciertos catalizadores biolégicos intervenian en la fermentaci6n del aziicar para formar alcohol (de aqui el nombre inicial de «fermentos»). La primera teoria general sobre la catalisis quimica, publicada por J. J. Berzelius en 1835, incluia un ejemplo de lo que ahora se conoce como enzima, Ja diastasa de la malta, y sefialaba que la hidrélisis del almi- dén se cataliza por la diastasa con mas eficacia que por el cido sulfirico. Aunque Luis Pasteur reconocié que la fermentacién es ca- talizada por enzimas, postulé en 1860 que éstos se hallaban ee ligados de modo inextricable con la estructura y Ia vida de las Cristales de quimotripsina bovina células de la levadura. Constituy6, por ello, un logro impor- tante en la historia de la investigacién enzimatica que, en 1897, E. Biichner consiguiera extraer los enzimas que catalizan la fermentacién alcohdlica de las células de levadura. Este hecho demostraba claramente que estos importantes enzimas, que catalizan una ruta metabélica principial productora de energia, pueden actuar independientemente de la estructura celular. Hasta muchos afios después, sin embargo, no fue ais- lado por vez primera un enzima en forma cristalina; ello lo consiguié J. B. Sumner, en 1926, con la ureasa, aislada de extractos de la alubia Cannavalia enzyformis. Sumner demostr6 que los cristales se hallaban constituidos por proteina y Ileg6 a la conclusi6n, contraria a la opinién que prevalecia por aquel entonces, de que los enzimas son proteinas. Sus puntos de vista no fueron aceptados inmediatamente, sin embargo, y hasta el petiodo comprendido entre 1930 y 1936, durante el cual Northrop aislé la pepsina cristalizada, la tripsina y la quimotripsina (fig. 8-1), no quedé bien establecida la natu- raleza proteica de los enzimas.-En la actualidad se han identi- ficado cerca de 2000 enzimas diferentes. Muchos de ellos se han aislado en forma pura y homogénea, y alrededor de unos M. Kunite 189PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS 200 se han podido cristalizar. Aunque se han identificadd la mayor parte de los enzimas relacionados con el metabolismo basico corriente de la célula quedan por resolver muchos pro- blemas importantes, entre ellos el control genético de la sin- tesis enzimatica, los mecanismos moleculares mediante los que se regula la actividad enzimatica y el papel de las formas miltiples de algunos enzimas en el desarrollo y en la diferen- ciacién, Pero sobre todo, todavia no se conoce en términos moleculares, cémo catalizan los enzimas Jas reacciones qui- micas con tal eficacia, precisién y especificidad. En este capitulo y el siguiente no se hard ningtin intento para catalogar y describir el gran néimero de enzimas dife- rentes conocidos hasta la fecha; se examinaran mas bien las propiedades y caracteristicas comunes a la mayor parte de los enzimas. Los enzimas especificos que participan en diversos ciclos metabélicos se estudiaran, mas detalladamente en capi- tulos sucesivos. Nomenclatura y clasificacién de los enzimas Muchos enzimas han sido designados afiadiendo el sufijo -asa al nombre del sustrato, es decir, de la molécula sobre la cual el enzima ejerce su accién catalitica. Por ejemplo, la ureasa cataliza la hidrélisis de la urea con produccién de amoniaco y CO, la arginasa cataliza la hidrélisis de la arginina a ornitina y urea, y la fosfatasa cataliza la hidrélisis de los ésteres fos- foricos, Esta nomenclatura, sin embargo, no siempre ha resul- tado practica, lo cual ha ocasionado que muchos enzimas hayan recibido nombres que quimicamente son poco informa- tivos; por ejemplo, la pepsina, Ia tripsina, y la catalasa, Por dicha razén, y porque el niimero de enzimas que se descubren esté aumentando rapidamente, se ha adoptado una clasifica~ cién sistematica de los enzimas segan recomendacién de una comisién internacional de enzimas. E] nuevo sistema divide a los enzimas en seis clases principales, cada una de las cuales se divide a su vez en subclases, de acuerdo con el tipo de reac- cién catalizada (tabla 8-1). Cada enzima es designado por un nombre recomendado, generalmente corto y apropiado para st uso habitual; por un nombre sistemético, que identifica la raccién que cataliza, y por un numero de clasificacién, que se emplea cuando se precisa la identificacién inequivoca del enzima, tal como ocurre en las revistas internacionales de in- vestigacién, en los restimenes y en los indices. Se da como ejemplo, el enzima que cataliza la reaccién ATP + creatina = ADP + fosfocreatina El nombre recomendado de este enzima, el que se emplea normalmente, es creatin-quinasa y el nombre sistematico, que se basa en la reacci6n catalizada, es ATP: creatin-fosfotrans- ferasa. Su niimero de clasificaci6n es EC 2.7.3.2, en donde EC significa, abreviadamente, Comisi6n de Enzimas; la pri- mera cifra (2) representa el nombre de la clase (transferasas), la segunda cifra (7) representa a la subclase (fosfotransfera- sas), la tercera cifra (3) la sub-subclase (fosfotransferasas con un grupo nitrégeno como aceptor) y la cuarta cifra (2) designa a la creatin-quinasa (véase tabla 8-1). En este libro utilizare- mos los nombres recomendados de los enzimas, tal como se 190 ‘Trbta 8-1. Clasificacién internacio- nal de los enzimas (denominaciones de las clases, mimeros de cédigo y tipos de reacciones catalizadas) 1. Oxido-reductasas (Reacciones de 6xido-reduccién) 1 Actdan sobre YoH—OH \ 1.2 Actéan sobre & =O \ 1.3 Actéan sobre c=CH— A 1 Actian sobre oH —NH, 15 Actéan sobre YoH—NH— 1.6 Acttan sobre NADH; NADPH 2. Transferasas (Transferencia de grupos funcio- nales) 2.1 Grupos de un atomo de carbono 2.2. Grupos aldehidicos 0 ceténicos 23 Grupos acilos 24 Grupos glucosilo 2.7 Grupos fosfato 2.8 Grupos que contienen azufre 3, Hidrolasas Reacciones de hidrélisis) 3.1 Bsteres 32 Enlaces glucosidicos 34 Enlaces peptidicos 35 Otros enlaces C_N 3.6 Anhidridos de acido 4. Liasas : (Adicién a Jos dobles enlaces) Vee” 41 Yomcl 42 Sc A cas 5. Isomerasas (Reacciones de isomerizacién) 5.1 Racemasas 6. Ligasas (Formacién de enlaces con escisién del ATP) 61.C-O 62 C-S 63 C-N 64 C-CTapia 8-2. Algunos de los enzimas que contienen iones metélicos 0 los necesitan como cofactores. Za Alcobol-deshidrogenasa Anhidrasa-carbénica Carboxipeptidasa Mg* Fosfohidrolasas Fosfotransferasas Mn* Arginasa Fosfotransferasas Fe o Fe Citocromos Peroxidasa Catalasa Ferredoxina Cu (Cu) ‘Tirosinasa Citocromo-oxidasa Ke Piruvato-quinasa (también necesita Mg") ‘Nav ATPasa de la membrana plas- matica (necesita también K* y Mg”) Capitulo 8 Enzimas: cinética ¢ inhibicion hallan catalogados en la edicién de Enzyme Nomenclature, 1973 (véase Bibliografia), salvo unas pocas excepciones. Cofactores enzimaticos La actividad de algunos enzimas depende solamente de su estructura como proteinas, mientras que otros necesitan, ade- mas uno o mas componentes no proteicos, llamados cofac- tores. El cofactor puede ser un ion metalico, o bien una mo- Iécula organica llamada coenzima; algunos enzimas necesitan de ambos. Los cofactores son generalmente estables frente al calor, mientras que muchas proteinas enzimaticas pierden la actividad por calefaccién. El complejo enzima-cofactor cata- liticamente activo recibe el nombre de holoenzima. Cuando se separa el cofactor, la proteina restante, que por si misma es inactiva cataliticamente, se designa con el nombre de apoenzima, Ta tabla 8-2 retine algunos enzimas que precisan de iones metélicos como cofactores. En tales enzimas el ion metélico puede actuar como: 1) centro catalitico primario; 2) como grupo-puente para reunir el sustrato y el enzima, formando un complejo de coordinacién; 0 3) como agente estabilizante de la conformacién de la proteina enzimatica en su forma cataliticamente activa. Los enzimas que precisan de iones me- talicos se Ilaman a veces metaloenzimas; en algunos de ellos, el componente metélico, por si solo, ya posee una actividad catalitica primaria, muy incrementada a su vez por la proteina enzimatica; por ejemplo, la catalasa, es un enzima ferro- porfirinico que cataliza la descomposicién muy rapida del peréxido de hidrégeno, en agua y oxigeno; las simples sales de hierro también catalizan esta reaccién, pero a velocidad mucho menor. La’ tabla 8-3 redne los principales coenzimas conocidos y losAipos de reacciones enzimaticas en las que participan. Cada ye de los coenzimas catalogados contiene, como parte de su structura, una molécula de alguna de las vitaminas; éstas son sustancias organicas que, en cantidades minimas (trazas), son vitales para la funcién de todas las células, y deben figu- rar en la dieta de algunas especies. Las vitaminas y sus formas coenzimaticas seran objeto de estudio en el capitulo 13 (pa- gina 341), Los coenzimas actiian, por lo general, como trans- ‘Tapa 8-3, Coenzimas de reacciones de transferencia de grupos. Coenzima Entidad teansferida Nicotinamida-adenina-dinuclestido Fosfato de nicotinamida-adenina-dinu- clestido Atomos de hidrégeno (electrones) Flavin-mononuclestido Atomos de hidrégeno (electrones) Flavin-adenina-dinuclestido Atomos de hidrégeno (electrones) Atomos de hidrégeno (electrones) Coenzima Q. Atomos de hidrégeno (electrones) Pirofosfato de tiamina Aldehidos Coenzima A Grupos acilo Lipoamida Grupos acilo Coenzimas cobamidicos Grupos alquilo Biocitina Didxido de carbono Fosfato de piridoxal Coenzimas tetrahidrofélicos Grupos amino Grupos metilo, metileno, formilo 0 formimino 191PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS portadores intermediarios de grupos funcionales, de atomos especificos o de electrones, los cuales son transferidos en la reaccién enzimatica global. Cuando el coenzima se halla unido intimamente a la molécula del enzima recibe, normalmente, el nombre de grupo prostético; por ejemplo, el grupo biocitina de la acetil-CoA-carboxilasa, que se halla incorporado cova- Ientemente en la cadena polipeptidica (pag. 351). Sin embargo, en algunos casos el coenzima esta unido débilmente y actia, esencialmente, como uno de los sustratos especificos de aquel enzima, Cinética quimica Antes de proceder a examinar la catélisis enzimatica de las reacciones, deben esbozarse algunas relaciones y términos em- pleados para la medicién y expresién de las velocidades de las teacciones quimicas, Las reacciones quimicas pueden clasifi- carse basandose en el niimero de moléculas que en total deben reaccionar pata formar los productos de la reaccién. Asi ten- dremos reacciones monomoleculares, bimoleculares y trimo- leculares, en las que reaccionan una, dos o tres moléculas, respectivamente, Las reacciones quimicas pueden clasificarse también sobre Ficura 8-2 una base cinética, por el orden de reaccién. Tendremos, de _—_Representacién gréfica del curso de una este modo, reacciones de orden cero, de primer orden, de se- _reaceién de primer orden. El tiempo medio gundo orden y de tercer orden, segtin como resulte influida _{(74).e+ ¢/ necesario para que se consuma la velocidad de reaccién por la concentracién de los reaccio- _reaccionante nantes bajo un conjunto de condiciones determinado. Las reacciones de primer orden son las que tienen lugar a una velocidad exactamente proporcional a la concentra- cién de un reaccionante (fig. 8-2). El ejemplo mas sencillo es cuando la velocidad de la reaccién Pendiente de la tangente —aAL dt A—>P es exactamente proporcional a la concentracién de A. En este caso la velocidad de reaccién en cualquier tiempo ¢ viene dada por la ecuacién de primer orden ty —a[A] wat 7 MAT en la que [A] es la concentracién molar de A y —d[A]/dt es la velocidad a que disminuye la concentracién de A. La constante de proporcionalidad k recibe el nombre de constante de velocidad 0 velocidad de reaccién especifica. Las constan- tes de velocidad de primer orden poseen las dimensiones del reciproco del tiempo habitualmente s-, La forma integrada de esta ecuacién, que es mas util para Ja realizacién de cAlculos cinéticos, es tog [A] —_#t [A] en la que [As] es la concentracién de A al tiempo cero, y [A] es la concentracién al tiempo t. En las reacciones de primer orden, el tiempo mitad (2) de la reaccién viene dado por 0,693 ha =e 192Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicion relacién que se deduce facilmente. Obsérvese que en las reac ciones de primer orden, el tiempo mitad es independiente de la concentracién inicial del sustrato. Reacciones de segundo orden son aquéllas cuya velocidad es proporcional al producto de la concentracién de dos reac- cionantes o a la segunda potencia de uno de los reaccionantes. El ejemplo mas sencillo es la reaccién A+B—>P La velocidad de esta reaccién que puede ser designada como —(d[A]/dt), —(4[B]/dt) 0 +(d[P]/dt), es proporcional al producto de las concentraciones de A y de B, y viene dada por la ecuacién de velocidad de segundo orden HAL = aca) en la que k es la constante de velocidad de segundo orden. Si la ‘reaccién tiene la forma 2A—>P y su velocidad es proporcional al producto de la concentracién de las dos moléculas reaccionantes, la ecuacién de velocidad de segundo ‘orden es aa] = K{AJIA) = Kia? Las constantes de velocidad de las reacciones de segundo orden tienen las dimensiones 1/[concentraci6n x tiempo], 0 M+ s+, La forma integrada de la expresién de segundo orden es 2,303 log IBoLAL *~ifAel = TBD 18 TAB] en donde [Aq] y [By] son las concentraciones iniciales y [A] y [B] las concentraciones en el tiempo t. En las reacciones de segundo orden, cuyas concentraciones de los reaccionantes son iguales, el tiempo mitad es igual a 1/Cok, en donde Cy es la concentracién inicial de los reaccio- nantes y k la constante de velocidad de segundo orden. Es importante observar que una reaccién de segundo orden, tal como A+B—>P puede parecer, en ciertas condiciones, una reaccién de primer orden. Por ejemplo, si la concentracién de B es muy elevada, y la de A muy baja, esta reaccién podria parecer como, de primer orden, ya que su velocidad seria casi proporcional a la concentracién de uno sélo de los reactivos; reacciones de seudoprimer orden © de primer orden aparente. Las reacciones de tercer orden, que son relativamente esca- sas, son aquéllas cuya velocidad es proporcional al producto de tres términos de concentracién. Algunas reacciones qui- micas son independientes de la concentracién de cualquier reactivo; son las llamadas reacciones de orden cero. Muchas 193PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CHLULAS reacciones catalizadas son de orden cero con respecto a los reactantes. Cuando es éste el caso, la velocidad de reaccién depende de la concentracién del catalizador o de algin otro factor distinto a la concentracién de las especies moleculares que experimentan la reaccién. Las velocidades de reaccién no es preciso que sean necesariamente de primer orden puro o de segundo orden puro; en ciertas condiciones se observan con frecuencia ordenes de reaccién mixtos. Energia libre de activacién y efectos de los catalizadores Una reaccién quimica, tal como A —> P, tiene lugar porque cierta fraccién de la poblacién de moléculas A, en cualquier instante dado, posee la suficiente energia como para alcanzar un estado activado, llamado estado de transicién, en el que es muy elevada la probabilidad de que se establezca 0 se rom- pa un enlace. quimico para formar el producto P. Este estado de transicién reside en la cima de la barrera de energia que separa a los reaccionantes y a los productos (fig. 8-3). La velocidad de una reaccién quimica dada es proporcional a la concentracién de estas especies caracteristicas del estado de transicion. La energia libre de activacién AG? (el simbolo + se emplea para representar el proceso de activacién) es la cantidad de energia necesaria para llevar todas las moléculas de 1 mol de sustancia a una temperatura determinada, al estado de transici6n, en la cima de la barrera de activacién. Hay dos métodos generales, mediante los cuales, puede acelerarse la velocidad de una reaccién quimica. Uno de ellos es la elevacién de la temperatura, ya que provoca un incre- Ficura 83 rama de energia para una reaccién quimica, no catalizada y catalizada. Estado de transicion Bergin libre de activacién de la reaccién inversa (a0 catalizada) Energia libre de activacion de la reaccién inversa (catalizada) Energia libre de activacién de Ta reaccion directa: (no catalizada) Energia libre ——> Estado inicial Cambio! lobal de Energia libre al ike i de activacién : dela reaccién catalizada Estado final Curso de la reaccién ——> 194‘Tata 8-4. Energia libre de activacién AG* calculada para Ja descomposicién del peréxido de hidrégeno a 20°C. La catalasa acelera la velocidad de Ja reaccion mas de 10° veces. aG* Condiciones keal mo! Sin catalizar 18 Catalizada con platino coloidal 13 Catalizada por catalasa 7 Figura 8-4 Efecto de la concentracién de! susteato sobre la velocidad de una reaccién catalizada enziméticamente. Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicion mento del movimiento térmico y de la energia, aumenta el niimero de moléculas capaces de alcanzar el estado de tran- sicién, y acelera, de este modo, la velocidad de las reacciones quimicas. En muchas reacciones la velocidad de reaccién se duplica, aproximadamente, por cada 10°C de aumento de la temperatura. La velocidad de una reaccién qui- mica puede verse incrementada también por la adicién de un catalizador; éste se combina con los reaccionan- tes de modo transitorio y se produce un estado de transicién de menor energia de activacién que el correspondiente a la reaccién no catalizada. Asi los catalizadores aceleran las reac- ciones quimicas porque disminuyen la energia de activacién (fig. 8-3). Cuando se forman los productos de la reaccién se regenera el catalizador libre. La tabla 8-4 muestra la energia de activacién para la descomposicién del peréxido de hidré- geno, en ausencia o en presencia de un catalizador. Cinética de las reacciones catalizadas por los enzimas. Ecuacién de Michaelis-Menten Los principios generales de la cinética de las reacciones qui- micas son aplicables a las reacciones catalizadas por los en- zimas, pero éstas muestran también un rasgo caracteristico, que no se observa en las reacciones no enzimaticas: la satu- racién con el sustrato. En la figura 8-4 vemos el efecto de la concentracién del sustrato sobre la velocidad de la reacci6n catalizada por un enzima A —+» P. A una concentracién de sustrato baja, la velocidad inicial de la reaccién vp es casi proporcional a la concentracién del sustrato y la reaccién, por tanto, es aproximadamente de primer orden con respecto al mismo. Sin embargo, a medida que la concentracién de sus- trato aumenta, Ja velocidad inicial de la reaccién disminuye y deja de ser aproximadamente proporcional a la concentra- cién de sustrato; en esta zona el orden de reaccién es mixto. Con un aumento posterior de la concentracién del sustrato, la velocidad de la reaccién Ilega a ser esencialmente indepen- diente de la concentracién de sustrato y se aproxima asinté- ticamente a una velocidad constante. En este intervalo de concentraciones de sustrato la reaccién es esencialmente de or- den cero con respecto al sustrato, y se dice entonces que el enzima se halla saturado con su sustrato. Todos los enzimas muestran el efecto de saturacién, pero varian ampliamente con respecto a la concentracién de sustrato que se necesita para que se manifieste. El efecto de saturacién condujo a algunos Ku [Sustrato] 195,PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS de los primeros investigadores, en particular a J. Brown y también a V. Henry, a formular la hipétesis de que el enzima y el sustrato reaccionan reversiblemente para formar un com- plejo, como etapa esencial en la reaccién catalizada. L. Michaelis y M. L. Menten desarrollaron en 1913 una teoria general acerca de la accién y cinética de los enzimas, la cual, fue ampliada posteriormente por G. E. Briggs y J. B. S, Haldane, Esta teoria, que es fundamental para el anali- sis cuantitativo de todos los aspectos de la cinética de los en- zimas y de la inhibicién, se ha desarrollado plenamente para el caso sencillo de una reaccién en la que sélo hay un sustrato. La teoria de Michaelis-Menten supone que el enzima E se combina en primer lugar con el sustrato S para formar el complejo enzima-sustrato ES; a continuacién este ultimo se escinde en una segunda etapa, para formar enzima libre y producto P: be E+S—=Es @ ES E+P @) Se supone que estas reacciones son reversibles; Jas constantes de velocidad para las reacciones directa e inversa poseen un: subindice positivo y otro negativo, respectivamente. Deduciremos a continuacién la ecuacién de Michaelis-Men- ten, que expresa la relacién matematica entre la velocidad inicial de una reaccién catalizada por un enzima, la concen- tracién del sustrato y ciertas caracteristicas del enzima. La ecuacién de Michaelis-Menten es la ecuacién de velocidad para las reacciones catalizadas por enzimas que sélo actéan sobre un sustrato. En la deduccién, debida a Briggs y Hal- dane, [E] representa la concentracién del enzima libre 0 no combinado, [ES] la concentracién del complejo enzima-sus- trato, y [Ey] la concentracién total del enzima (suma de las formas libre y combinada). La concentracién del sustrato se representa por [S], la cual se supone que es mucho mayor que [E], de modo que la cantidad de S unida a E en cualquier instante, es despreciable si se compara con la concentraci6n total de S. El objeto de esta deduccién es definir una expresién gene- ral para vp, que es la velocidad inicial de una reacci6n catali> zada enziméticamente, suponiendo que las reacciones de esta clase transcurren en dos etapas, tal como muestran las reac- ciones (1) y (2). La velocidad inicial es, por supuesto, igual a la velocidad de ruptura del complejo enzima-sustrato, ES, de acuerdo con la ecuacién (2); podemos escribir para ella la ecuacién de velocidad de primer orden, Vo = kya[ES] (3) Sin embargo, ya que ni k., ni [ES]. pueden determinarse directamente, debemos encontrar otra expresién para vp en funcién de otras variables que puedan medirse con mas faci- lidad. Para ello escribiremos en primer lugar la ecuacién de velocidad de segundo orden para la formacién de ES a partir de E y de S [véase la reaccién (1)]: ESI. = &, (8x) — (ES) [5] (a) 196Figura 8-5 Transcurso de la formacién de un complejo ‘enzima-sustrato en funcién del tiempo e iniciacién del estado estacionario, tal como se deduce de la resolucién por computador de los datos obfenidos en un experiment real con un enzima tipico. La porcién sombreada del grafico superior es la que aparece ampliada en la grafica inferior. Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicion en la que k,: es la constante de velocidad de segundo orden. Aunque ES puede formarse también a partir de E y de P por inversion de la reaccién (2), la velocidad de la reaccién inversa puede despreciarse, ya que estamos considerando que 4a reaccién se inicia en el sentido directo, cuando [S] es muy elevado y [P] es cero, o proximo a este valor. A continuacién escribiremos la ecuacién de velocidad para la descomposicién de ES por suma de dos reacciones; en pri- mer lugar, la reaccién que rinde el producto (reaccién directa) y después la reaccién que produce E + S$ [la inversa de la ecuacién (1)]. Tendremos entonces: TAPS — 18 +, .LES] 6 Cuando la velocidad de formacién de ES es igual a su velo- cidad de desaparicion, es decir, cuando el sistema ha alcan- zado el estado estacionario, que se define como aquél en que la concentracién de ES permanece constante, entonces k,.((Er] — [ES)}[S] = k,[ES] + k,2[ES] © Concentracién Concentracién ‘Tiempo 197PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS La figura 8-5 muestra la variacién a lo largo del tiempo de los diversos participantes. Reordenando la ecuacion (6), obtenemos {S}((Er] = (ES}) _ ky + kie [ES] Ku 7) La constante global Ky, que sustituye al término (k-1 + ky) /kuy se llama constante de Michaelis-Menten. A partir de esta ecuacién puede obtenerse la concentraci6n del complejo ES en el estado estacionario, despejando dicho término: —lE/ISI [ES] Ku + [5] (8) Ya hemos visto (anteriormente) que la velocidad inicial de reaccién, vo, de una reaccién enzimatica es Vo = kyo [ES] (3) Podemos sustituir, ahora, el término [ES], que figura en la ecuacién (3), por su valor en la ecuacién (8): kj, als) K+ [6] (9) Cuando la concentracién del sustrato es tan elevada que practicamente todo el enzima del sistema esta presente en forma de complejo ES, es decir, cuando el enzima se halla saturado, se alcanzara la velocidad inicial maxima, Vina, dada por Vinix = keo{Ex] (10) en la que [Ey] es la concentracién total del enzima. Susti- tuyendo ky [Er] por su valor deducido de la ecuacién (10), se obtiene ; — Vis [SI] Ku + [S] 0 (a1) Esta es la ecuacién de Michaelis-Menten; es la ecuacién de Ia velocidad para una reaccién de un solo sustrato, catalizada enzimaticamente. Relaciona la velocidad inicial, la velocidad maxima y la concentracién inicial del sustrato a través de la constante de Michaelis-Menten. Es importante observar que aunque la ecuacién de Michaelis-Menten parece no contener ningiin término para la concentracién del enzima, en realidad ésta se halla contenida en el término Ving, que hemos visto gue es igual a k. [Er]. Dea-eeuacién de Michaelis-Menten se deriva una relacién numérica importante en el caso especial en que la velocidad inicial de la reaccién sea exactamente la mitad de la velocidad maxima; es decir, cuando vp = Y% Vinx (fig. 8-4). Vis _ Vass (S] 2 Ku + (S} Al dividir por Vuux, se obtiene [Ss] Ku + [8] 198Tasta 8-5. Ky de algunos enzimas. Enzima y sustrato Ku (mM) Catalasa HO; 5 Hexoguinasa Glucosa 05 Fructosa 15 Quimotripsina N-Benzoiltirosinamida 25 N-Formiltisosinamida 120 N-Acetiltirosinamida 2 Gliciltirosinamida 122 Anhidrasa carbénica HCO; 9.0 Glutamato-deshidrogenasa Glutamato 0412 aCetoglutarato 20 NH? 7 NAD» 0,025 NADoa 0,018 Aspartato a-amino transferasa Aspartato| 09 ‘e-Oxoglutarato Ot Oxalacetato 0.04 Glutamato 40 Trsta 8.6. Efecto de la estructura del sustrato sobre la Vnu para la D-amino&cido- onidasa (los datos se refieren a la pealanina = 100). Sustrato Ven: relativa p-Tirosina 297 p-Prolina 231 p-Metionina 125, b-Alanina 100 p-Valina 55 p-Histidina 97 Glicocola 0.0 Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicion Reordenando, se transforma en Ku + (S] = 2[S] Ku=(S] ‘Vemos asi que la constante de Michaelis-Menten Ky es igual a la concentracién de sustrato en la que la velocidad inicial de la reaccion es la mitad de la velocidad maxima. Las dimensio- nes de Ky para una reaccién de un solo sustrato son moles por litro, y la constante es independiente de la concentracién del enzima. Puede obtenerse con facilidad, una aproximacién al valor de Ky a partir de una serie de experimentos sencillos en los que la velocidad inicial de la reaccién se mide a diferentes concentraciones iniciales de sustrato con una concentracién de enzima constante. El valor aproximado de Ky se obtiene gra- ficamente al representar la velocidad inicial frente a la concen- tracién inicial del sustrato (fig. 8-4); se obtiene una hipérbole rectangular. A concentraciones de sustrato muy bajas, la ve- locidad inicial, vo, es casi proporcional la [S]; es decir, la reaccién muestra esencialmente un comportamiento de primer orden. A concentraciones de sustrato muy elevadas la veloci- dad de la reaccién se aproxima asintéticamente a la Vinx y es esencialmente de orden cero; 0 sea, casi independiente de la concentracién del sustrato, Unos cuantos enzimas, como la catalasa, parecen no mostrar saturacién por el sustrato; ello es debido a que la velocidad de descomposicién del complejo ES para formar productos es tan raépida que no puede con- vertirse facilmente en limitante del proceso. La tabla 8-5 retine los valores de Ky para varios enzimas. Obsérvese que Ky no es un valor fijo, sino que puede variar con la estructura del sustrato, con el pH y con la temperatura. Para los enzimas que poseen més de un sustrato, cada uno de ellos exhibe una Ky caracteristica. En condiciones intracelu- lares, Iés enzimas no se hallan necesariamente saturados por sus sustratos. Recordemos que la velocidad maxima, Vinax que es igual a ke [Er], varia ampliamente de un enzima a otro para una concentracién de enzima determinada. La Vinx varia también con la estructura del sustrato (tabla 8-6), con el pH y con la temperatura. La constante de Michaelis de un enzima constituye una ca- racteristica util e importante, que es fundamental no sélo para la descripcién matematica de la cinética enzimatica, sino también para la determinacién cuantitativa de la actividad en- zimatica en los tejidos y la purificacién del enzima. Ademas, Ja concentracién de sustrato que proporciona la mitad de la velocidad maxima, facilita una indicacién util para el andlisis de algunos mecanismos de regulacién enzimatica (pag. 242). Un notable ejemplo de investigacién médica reciente pone de manifiesto la utilidad de Ky en un nuevo aspecto. Algunos tipos de leucemia humana y animal (forma de cancer en la que los glébulos blancos sanguineos proliferan anormalmente) pueden suprimirse por administracién intravenosa del enzima asparaginasa, que cataliza la reaccién Asparagina + Hj,O = aspartato + NHi¢ Este descubrimiento condujo a la conclusién de que la aspa- ragina presente en la sangre es un principio nutritivo esencial 199PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS para el crecimiento de los leucocitos malignos; la asparaginasa intravenosa produce Ja hidrélisis de la asparagina en aspar- tato, el cual, no satisface las necesidades de aquéllas. Durante la basqueda de fuentes de asparaginasa adecuadas para el tratamiento de la leucemia se hizo el desconcertante descubri- miento de que no todas las asparaginasas son eficaces en la supresi6n de la leucemia experimental. Al final se encontré la raz6n: las asparaginasas de diferentes fuentes, animales, vege- tales o bacterianas, difieren en gran medida en el valor de Ky respecto a la asparagina, Como la concentracién de aspara- gina en la sangre es muy baja, la administracién de una as- paraginasa de otra especie sdlo sera terapéuticamente efectiva si su valor de Ky es lo suficientemente bajo como para hidro- lizar la asparagina rapidamente, dada la pequefia concentra- cién con que esta presente en Ja sangre. El comportamiento cinético de la mayor parte de los enzi- mas es mas complejo que el sencillo e idealizado de la reaccién de un solo sustrato que acabamos de estudiar. En primer lugar, nuestra formulacién ha supuesto que en la reaccién con un solo sustrato, se forma tinicamente un solo complejo enzima- sustrato , pero ahora parece probable que en muchas de las Teacciones con un sustrato puedan intervenir dos 0 tres com- plejos intermedios, tal como indica la secuencia E+S == ES == EZ == EP == E+P en la que EZ es el complejo del estado de transicién, y EP un complejo enzima-producto. Ademas, solamente una mino- ria de las reacciones enzimaticas son de un solo sustrato; en la mayor parte de ellas intervienen dos o mas sustratos, y pueden haber dos o mas productos. E] anilisis cinético de las reacciones enzimaticas en las que intervienen varios reaccio- nantes y productos es complejo; no obstante, la relacién de Michaelis-Menten contintia siendo el punto de partida para el analisis de la cinética de todas las reacciones enzimaticas. Constante de Michaelis, Ky, y constante del sustrato, Ks Tal como hemos sefialado anteriormente, la constante de Mi- chaelis es una magnitud determinada experimentalmente y definida operativamente: es la concentracién del sustrato a la cual la velocidad de la reacci6n es la mitad de la velocidad maxima. En el caso ideal utilizado en la deduccién anterior, equivale a kite Ky (7) pero en algunas reacciones enzimaticas k.; es muy grande en comparacién con k,2, en cuyo caso esta iiltima puede pasar a ser despreciable, y la ecuacién (7) se simplifica a ka Ku en que Ky es aproximadamente igual a la constante de diso- ciacién del complejo enzima-sustrato Ks, que también se de- signa como constante del sustrato: — (EIS) tS} 200Figura 8-6 Representacion (Lineweaver-Burk), doble reciproca, Ky Pendiente = max Ficura 8-7 Representacién de Eadie-Hofstee. Vo Pendiente = —Kx Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicién Desgraciadamente, Ky y Ks son considerados con frecuen- cia y equivocadamente, como sindénimos, No deberia conside- rarse a Ky como constante de disociacién del complejo ES, a menos que se disponga de informacién especifica que con- firme que el valor de k.2 es muy pequefio comparado con el de ke. Transformaciones de la ecuacién de Michaelis-Menten La ecuacién de Michaelis-Menten [ecuacién (11) ] puede trans- formarse algebraicamente en otras formas que son mas utiles para la expresién de los datos experimentales. Una de las transformaciones mAs corrientes se obtiene, sencillamente, to- mando los reciprocos de ambos miembros de la ecuacién de Michaelis-Menten (11): 1 _ Kw + [8] Vo Vinx [S] Reordenando, tendremos 1__Kky 1S) Vo Vinaxl 5] Vinax[ 5] que se reduce a 1 Ky 1 1 (12) Vo Vinax {s] + Vinax La ecuacién (12) es la ecuacién de Lineweaver-Burk, Cuando 1/vy se representa frente a 1/[S], se obtiene una linea recta. La pendiente de la recta es Ky/Vmix, y la interseccién sobre el eje 1/v% es 1/Vméx: la interseccién sobre el eje 1/[5] es — 1/Ky (fig. 8-6). Tal representacién doble-reciproca tiene la ventaja de que permite una determinaci6n mucho mas exacta del valor de Vinx» ya que en la representacién sencilla de v frente a [S] sélo se obtiene su valor aproximado (obsérvese la figura 8-4), puesto que es un valor limite a una concentracién del sustrato infinita. La representacién doble reciproca puede pro- porcionar también informaci6n valiosa acerca de la inhibicién enzimatica, como veremos mas adelante (pag. 205). Otra transformacion util de la ecuacién de Michaelis-Men- ten se obtiene multiplicando ambos miembros de la ecuacién (12) por Ving, y reordenando para dar la ecuacién Vv Vo = —Ku is! + Vindx La representacién de vy frente a v/[S], llamada representa- cién_de Eadie-Hofstee (fig. 8-7), no solamente da los valores de Vinx y de Ky en forma muy sencilla, sino que también amplia las desviaciones del caracter lineal que pueden no aparecer en una representacién doble reciproca. Efecto del pH sobre la actividad enzimatica La mayoria de los enzimas poseen un pH caracteristico al cual su actividad es maxima; por encima o por debajo de ese pH Ja actividad disminuye. Aunque los perfiles de las curvas de actividad en funcién del pH de muchos enzimas son acam- 201PARTE | COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS Ficura 8-8 Curvas de actividad en funcién del pH de algunos enzimas. a 2 a Colinesterasa u 3 Tripsina 6 3 2 B eG 6 8 10 pH Pepsina Papaina P (sustrato = benzoilargininamida) 2 4 6 pH panados, pueden variar considerablemente de forma (fig. 8-8). La relacién entre el pH y la actividad de cualquier enzima depende del comportamiento Acido-base del enzima y del sus- trato, asi como de otros muchos factores que son por lo ge- neral dificiles de analizar cuantitativamente. La forma de la curva de actividad-pH varia con la concentracién del sustrato, ya que el valor de Ky de muchos enzimas varia con el pH. ~Las mencionadas curvas son mucho mas significativas si el enzima se mantiene saturado con el sustrato en todos los valores de pH a los que se experimenta. En muchos estudios de cinética enzimatica, el pH se mantiene constante al, o muy préximo al, pH dptimo, El pH 6éptimo de un enzima no es necesariamente idéntico al pH de su entorno intracelular normal, el cual puede ha- llarse a su vez en la pendiente ascendente o descendente de su curva de pH-actividad. Este hecho sugiere que la relacién pH-actividad de un enzima puede constituir un factor en el control intracelular de su actividad. Efecto de la temperatura sobre las reacciones enzimaticas Al igual que ocurre con la mayoria de reacciones quimicas, la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se incre- menta en general con la temperatura, dentro del intervalo en que el enzima es estable y permanece totalmente activo. La velocidad de muchas reacciones enzimaticas se duplica, apro- ximadamente, por cada 10°C de aumento de la temperatura (Qio ~~ 2,0). Sin embargo, el coeficiente de temperatura Qo, varia algo de un enzima a otro segun la energia de activacién 202Ficura 8-9 Efecto de la temperatura sobre la actividad de un enzima. Los enzimas varian con tespecto a su estabilidad térmica. La porcién descendente de la curva se debe a la desnaturalizacién térmica. Porcentaje maximo de actividad = 2 Qo ao Qo 20 60 Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicién de la reaccién catalizada; es decir, de la altura de la barrera de energia para pasar al estado de transicién (fig. 8-3). Aunque las reacciones catalizadas por los enzimas parecen, con frecuencia, poseer una temperatura 6ptima (fig. 8-9), el pico que se observa al representar la actividad catalitica frente a la temperatura se produce porque los enzimas, al ser pro- teinas, se desnaturalizan por la accién del calor y se inactivan cuando la elevacién de temperatura sobrepasa un cierto punto. La aparente temperatura «6ptima» es, por tanto, la resultante de dos procesos: 1) el incremento habitual de la velocidad de reaccién con la temperatura, y 2) el incremento en la ve- locidad de desnaturalizacié6n térmica del enzima al sobrepasar una temperatura critica, Aunque la mayoria de enzimas se inactivan a temperaturas comprendidas entre 55 y 60°C, al- gunos de ellos son completamente estables y conservan su actividad a temperaturas muy superiores; por ejemplo, los enzimas de diversas especies de bacterias termofilicas que habitan en las termas de agua y siguen siendo activos a temperaturas superiores a los 85°C. Algunos enzimas, como la ribonucleasa, pierden actividad por calefaccién, pero la recuperan rapidamente por enfriamien- to, lo cual indica que su cadena polipeptidica desplegada vuel- ve rapidamente a adoptar su conformaci6n nativa (pag. 64). Inhibicién de los enzimas A partir del estudio de los inhibidores de los enzimas se ha obtenido informacién de importancia sobre el mecanismo y los caminos de la catalisis enzimatica, la especificidad de sustrato de los enzimas, la naturaleza de los grupos funcionales en el centro activo y la participacién de ciertos grupos funcionales en el mantenimiento de la conformacién activa de la molécula del enzima. Ademas, la inhibici6én de algunos enzimas por metabolitos especificos constituye un elemento importante en la regulacién del metabolismo intermediario. Los tres. tipos principales de inhibicién reversible de los enzimas, competitiva, acompetitiva y no competitiva, pueden distinguirse experimentalmente por los efectos que produce el inhibidor sobre la cinética de reaccién del enzima, la cual puede analizarse mediante la ecuacién basica de velocidad propuesta por Michaelis-Menten, Para la validez del anAlisis cinético, el inhibidor debe combinarse rapida y reversiblemente con el enzima o con el complejo enzima-sustrato. Los inhibi- dores que reaccionan con el enzima lentamente y/o irreversi- blemente se estudian en otro lugar (pags. 207 y 226). Inhibicién competitiva La caracteristica de la inhibici6n competitiva es que el inhi- bidor puede combinarse con el enzima libre de tal modo que compite con el sustrato normal para unirse al centro activo. Un inhibidor competitivo reacciona reversiblemente con el en- zima para formar un complejo enzima-inhibidor (EI) analogo al complejo enzima-sustrato: E+I=— EI 203PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS La molécula del inhibidor no resulta quimicamente alterada por el enzima. Siguiendo el formalismo de Michaelis-Menten, podemos definir la constante del inhibidor K;, como la cons- tante de disociacién del complejo enzima-inhibidor: — LEI A= El La constante del inhibidor, K;, es comparable por tanto a Ks, constante de disociacién del complejo enzima-sustrato. La inhibicién competitiva se reconoce experimentalmente con facilidad, debido a que el porcentaje de inhibicién para una concentracién de inhibidor constante disminuye al incremen- tarse la concentracién del sustrato. En el anAlisis cinético cuan- titativo, el efecto de la variacién de la concentracién del sus- trato [S] sobre la velocidad inicial vo, viene determinada para una concentracién constante del inhibidor. Este experimento se repite de nuevo con una concentracién de inhibidor dife- rente. A menudo se efecttan varias series de tales experi- mentos, cada uno con una concentracién de inhibidor diferen- te; a continuacién, se trazan representaciones de 1/vp frente a 1/[S], para cada una de las concentraciones del inhibidor. Estas representaciones se caracterizan por proporcionar una fa- milia de lineas rectas cuyo punto de interseccién comin se halla sobre el eje de 1/v (fig. 8-10). La presencia de un inhibidor competitivo incrementa, por tanto, la Ky aparente del enzima por el sustrato; es decir, provoca que se precisen concentra- ciones de sustrato superiores para que se alcance la velocidad maxima. E] valor de la Ky aparente del sustrato sera mayor que la verdadera Ky al aumentar el valor de la interseccién sobre el eje 1/[S]. Como la pendiente de la representacién de la reaccién no inhibida es Kyu/Vmax (fig. 8-10; tabla 8-7), y la pendiente de la recta para la reaccién inhibida es Ky/V mix (1 + [I]/K1), se observa que ha experimentado un incre- mento, expresado por el factor 1 + [1]/K;. A partir de esta relacién puede calcularse el valor de K;. Por otra parte, un inhibidor competitivo se caracteriza por no afectar al valor de Vingx, indicando con ello que no interfiere con la velocidad ° de ruptura del complejo enzima-sustrato. El ejemplo clasico de inhibicién competitiva lo constituye la inhibicién de la succinato-deshidrogenasa por el malonato (pa- gina 469), y por otros aniones dicarboxilato (fig, 8-11). La Tasta 8-7. Resumen de los efectos de los inhibidores sobre las representaciones de Lineweaver-Burk, 1/V, frente a 1/[S]. a a i ey Interseccién sobre la Pendiente ordenada state Ku 1 Sin inhibidor Vanes Vin Ky ( i) 1 ope. 1 + = — Competitivo Vands K Vendx K, 1 (1) Acompetitivo Vea Vind (1 + ) No competitivo (los valores de ambas Ku (2 4 i) 1 (: 4 i) K,; son idénticos) Vindx K Vind K 204Figura 8-10 Representaciones doble-reciprocas que muestran los efectos de fa inhibicién competifiva, acompetitiva y no competitiva de los enzimas. Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicién Pendiente de la reacci6én inhibida =(1+K) Va Inhibicién competitiva Sin inhibidor Pendiente = Ku Vindx Intersecciones —1 ul) Pendiente Acompetitiva de la reaccién inhibida or or Sin inhibidor Pendiente = Ku max : _ 1 a) Intersecciones = 7 ( + K, mdx ee er Intersecciones 1 tt} Ts] i+ K, _ x Pendiente de la reaccién inhibida =var(+,) Inhibicién no competitiva Sin inhibider Pendiente = e M max Intersecciones— —1— ( Vv. z max 205PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS succinato-deshidrogenasa forma parte del grupo de enzimas responsables de las reacciones del ciclo de los acidos tricarboxi- licos (pag. 469). Cataliza la eliminacién de dos atomos de hi- drégeno de los dos &tomos de carbono metilénicos del succinato (la naturaleza del aceptor del hidrégeno carece de importancia en esta discusién). El malonato, inhibidor competitivo, se pa- rece al succinato en que posee dos grupos carboxilo ionizados a pH 7, pero difiere de él, en que no es deshidrogenado por la succinato-deshidrogenasa. Si se afiade suficiente malonato para inhibir la deshidrogenacién de una concentracién determinada de succinato, en un 50%, por ejemplo el incremento de la concentracién de succinato reducira el porcentaje de inhibicién que produce el malonato. Ademas del malonato, pueden actuar como inhibidores com- petitivos de la succinato-deshidrogenasa los aniones de otros acidos dibasicos que poseen la distancia adecuada entre los dos grupos aniénicos; por ejemplo, el anién pirofosfato. Todo ello conduce a la conclusién de que el centro catalitico de la succi- nato-deshidrogenasa posee dos grupos con carga positiva, se- parados adecuadamente, que son capaces de atraer a los dos grupos carboxilato del sustrato con carga negativa. El centro catalitico muestra, por tanto, que es complementario con res- pecto a la estructura del sustrato. A partir de la relacién entre la estructura molecular de un inhibidor competitivo y de su afinidad por el enzima, expresada por la Ky, se puede obtener informaci6n valiosa acerca de la estructura y la geometria del centro activo, Constituye un mé- todo importante para abordar el trazado de mapas de los cen- tros activos del enzima. N Inhibicién acompetitiva En este tipo de inhibicién, cuya designacién no es muy ade- cuada, el inhibidor no se combina con el enzima libre ni afecta a su reaccién con el sustrato normal; sin embargo, el inhibidor se combina con el complejo enzima-sustrato para formar un complejo inactivo enzima-sustrato-inhibidor, el cual no experi- menta su transformacién posterior en el producto habitual de la reaccién: ES + I = ESI La constante del inhibidor es, por tanto: _ [ES] [EST] K Estas relaciones demuestran que el grado de inhibicién puede aumentar cuando la concentracién de sustrato se ve aumen- tada. La inhibicién acompetitiva puede reconocerse con gran facilidad en las representaciones de 1/v) frente a 1/[S] para concentraciones constantes del inhibidor, Tal como muestran la figura 8-10 y la tabla 8-7, lo caracteristico de la inhibicién acompetitiva es que la pendiente de las rectas permanece cons- tante al aumentar la concentracién del inhibidor, pero la Wyox decrece. La inhibici6n acompetitiva es poco frecuente en las reacciones de un solo sustrato, pero es corriente en las reac- ciones de dos sustratos. 206 Ficura 8-11 Inhibicién competitiva de la succinato- deshidrogenasa. Reaccion de fa succinato-deshidrogenasa. Goo” | Succinato I. COoOo- + Aceptor de hidrégeno Succinato deshidrogenasa coo- i Fumarato | COo- + Aceptor de hidrégeno reducido © Algunos inhibidores competitivos de la succinato-deshidrogenasa. Obsérvese © que todos contienen dos grupos aniénicos cuyo espaciado se parece al existente en el succinato. COoO- CH, Coo- Malonato CoO- CcCOoO- Oxalato coo- | CH, c=O0 COoO- Oxalacetato v O=F—O" oO O=F—O" O- PirofosfatoFicura 8-12 Quelato del tetracetato de etilendiamina con su catién metalico divalente (Me’*), La porcién sombreada representa el plano de los enlaces coordinados. Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicién Inhibicién no competitiva Un inhibidor no competitivo puede combinarse con el enzima libre o bien con el complejo enzima-sustrato, interfiriendo con la accién de ambos. Los inhibidores no competitivos se unen a un centro del enzima distinto del centro activo, a menudo para deformar al enzima, de modo que no pueda formarse el complejo ES a su velocidad normal y que una vez formado no se descomponga a su velocidad habitual para liberar los productos de reaccién. Sus efectos no se anulan al aumentar la concentracién del sustrato. En la inhibicién no competitiva la reaccién con el inhibidor produce dos formas inactivas, EI y ESI: E+I1=— El ES + I — ESI para las que existen dos constantes del inhibidor: — [END = EN . st — [ES)[] , [ES] que pueden ser iguales o diferentes, La inhibicién no compe- titiva se reconoce también con gran facilidad en las represen- taciones de 1/u frente a 1/[S], en presencia de diferentes concentraciones del inhibidor, que se mantienen constantes (fig. 8-10; tabla 8-7). Las representaciones difieren en pen- diente pero no comparten un punto de intersecci6n comin sobre el eje 1/vo. El valor de la interseccién sobre dicho eje es mayor para el enzima inhibido que para el no inhibido, lo que indica que la Vinx decrece en presencia del inhibidor y no puede restablecerse su valor a pesar de que la concentra- cién del sustrato pueda ser elevada. El tipo mas corriente de inhibici6n no competitiva es produ- cida por los reactivos que pueden combinarse reversiblemente con algin grupo funcional del enzima (situado fuera del cen- tro activo) que sea esencial para mantener la conformacién tridimensional cataliticamente activa de la molécula del enzima. Algunos enzimas (aunque no todos ellos) que poseen un grupo —SH esencial, son inhibidos no competitivamente por los iones de metales pesados (pag, 88), sugiriendo que tales grupos —5SH deben permanecer intactos para que el enzima conserve su conformacién activa normal. Algunos enzimas que precisan de iones metalicos para su actividad son inhibidos no competitivamente por agentes ca- paces de unirse al metal esencial. Por ejemplo, el agente que- lante tetra-acetato de etilendiamina (EDTA) se une reversi- blemente al Mg” y a otros cationes divalentes, inhibiendo asi de modo no competitivo a algunos enzimas que precisan de tales iones para su actividad (fig. 8-12). Inhibicién irreversible: modificacién del enzima En Ja inhibicién reversible de los enzimas, discutida anterior- mente, el inhibidor interviene en un equilibrio facilmente re- versible, que se establece con rapidez, con el enzima o con el complejo enzima-sustrato, y que puede analizarse mediante 207