N 5, diciembre 2016

ISSN: 1390-7573

Centro de Biotecnologa 2016, 5(1): 80-90

Comparacin de la sensibilidad de la PCR frente

a otras tcnicas de Laboratorio utilizadas para
el diagnstico de Leishmaniosis Cutnea en
Ecuador
Comparison of the sensitivity of PCR to other laboratory
techniques used for the diagnosis of Cutaneous Leishmaniasis in
Ecuador

1. Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical, rea de

Iliana Caicedo1,2*
Patricia Nathaly Mrquez1,2
Martha Leonor Snchez1,2
ngel Ortz Arauz3
Luis Fernando Solorzano4
Glenda Jackeline Castro5
Wilson Orlando Pozo6
Biotecnologa, Virologa
2. Programa de Biotecnologa, Universidad de Guayaquil.
3. Universidad de Guayaquil. Facultad de Ciencias Mdicas
4. Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical, rea de
Biotecnologa, Parasitologa
5. Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical Centro Na-
cional De Bacteriologa/Resistencia Antimicrobiana
6. Universidad de Guayaquil, Facultad de Ciencias Naturales.
*Autor para correspondencia:ilianacaicedo@yahoo.com

RECIBIDO: 14/04/2016 APROBADO: 16/11/2016

RESUMEN
Antecedentes y Objetivo.- La leishmanio-
sis es una enfermedad parasitaria endmica de
pases ubicados en el rea tropical y subtropical;
que afecta a la piel, mucosa y ciertas vsceras.
En el Ecuador, el diagnstico de Leishmaniosis
cutnea/mucosas tradicionalmente incluye la
identificacin de amastigotes de Leishmania por
microscopia directa y el crecimiento de promas-
tigotes en cultivos, mientras que la PCR es una
ABSTRACT
Leishmaniasis is a parasitic disease endemic
in tropical and subtropical countries and affects
the skin, mucosa and certain viscera. The diag-
nosis of cutaneous / mucosal Leishmaniasis tradi-
tionally includes identification of amastigote of
Leishmania by direct microscopy and promasti-
gote growth in culture, which are the two tech-
niques performed routinely in Ecuador. The aim
of this study was to compare the sensitivity of

80
 Caicedo et al., 2016; Comparacin de la sensibilidad de la PCR frente a otras tecnicas de Laboratorio utilizadas para el diagnstico de
Leishmaniosis Cutnea en Ecuador
tcnica que no se utiliza. El presente trabajo
tuvo como objetivo comparar el nivel de sen-
sibilidad de deteccin de esta tcnica frente a
la microscopia y cultivo en muestras sospechas
de leishmaniosis cutnea de pacientes ecuato-
rianos. Materiales y mtodos.- Se examinaron
23 muestras provenientes de lceras de piel
sospechosas de leishmaniosis por 3 tcnicas de
laboratorio: Microscopa, cultivo y PCR. Resulta-
dos.- La microscopa detect 21 muestras positi-
vas, el cultivo 10 y la PCR 16. Conclusiones.- Este
trabajo nos permite concluir que la PCR no es la
tcnica ms sensible para la deteccin del par-
sito Leishmania.
Palabras clave: Cultivo, leishmaniosis cutnea, microscopa,
PCR
INTRODUCCIN
La Leishmania es un parsito que pertene-
ce al orden Kineplastida, familia Trypanosoma-
tidae, es el agente causal de la leishmaniosis o
Leishmaniasis (Ryan y Ray, 2004), cuyas formas
clnicas comprenden una forma visceral, cut-
nea y mucocutnea. La leishmaniosis es una
enfermedad transmitida por la picadura de un
mosquito del gnero Lutzomyia, que mide de
1,5 2 mm de tamao y que en algunas zonas de
pases sudamericanos se conoce con el nombre
de manta blanca (Botero y Restrepo, 1992).
Despus de la picadura en la piel por el mosqui-
to infectado, existe un perodo de incubacin
que vara entre dos semanas a dos meses o ms
(Salazar et al., 2001), presentndose en el rea
afecta una pequea lesin inicial con aspecto
de ppula eritematosa de unos 3 mm, un ndu-
lo o una simple induracin que puede ser nica
o mltiple. Despus de varios das esta lesin
inicial se ulcera espontneamente y se recu-
bre de un lquido amarillento y adherente, que
posteriormente da lugar a la costra. Debajo de
esta costra la lesin se extiende en superficie y
these three methods : microscopy, culture and
PCR to detect Leishmania in 23 samples of skin
ulcers . The microscopy detected 21 positive
samples, 10 by culture and 16 by PCR.
Keywords: Culture, cutaneous Leishmaniasis, microscopy,
PCR
profundidad. Pueden adems aparecer lesiones
satlites que pueden unirse a la inicial, y dan lu-
gar a una gran ulceracin. La lcera caracters-
tica es generalmente redondeada, indolora, con
bordes bien definidos y cortados en forma de
sacabocado; este borde es hipermico, levanta-
do e indurado (Botero y Restrepo, 1992).
La leishmaniosis tegumentaria es prevalen-
te en 88 pases y se estima que 350 millones
de personas estn en riesgo. La incidencia es
de 1.5 millones de casos de leishmaniosis cut-
nea por ao. El 90% de los casos son reportados
en frica, el Medio Oriente y en Amrica Lati-
na; primordialmente Brasil, Bolivia, Colombia,
Ecuador, Per y Venezuela (Desjeux et al. 2004;
Murray et al., 2005).
En el nuevo mundo, la leishmaniasis cu-
tnea, visceral y mucocutnea son endmicas
en varios pases del Centro y Sur de Amrica,
constituyndose en un problema significativo
de salud pblica. En Ecuador, el primer caso re-
portado fue en el ao de 1920, en la provincia
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de Esmeraldas, mientras que la primera caracte- una alternativa ms sensible y especifica frente
rizacin a nivel de zimodemo y serodemo de los a los mtodos tradicionales actualmente en uso
parsitos de la leishmaniasis, aislados de huma- (de Vries et al., 2015)
nos, animales reservorios y del insecto vector La PCR, sera una buena opcin ya que los
se realiz en 1989 (Mimori et al., 1989). mtodos convencionales de diagnstico para-
El Ecuador se considera una regin en- sitolgicos no son suficientemente sensibles
dmica de Leishmaniosis ya que se encuentra (Bensoussan E, 2006). Ciertos autores han su-
en 22 de 24 provincias (Guinara, 2014). Se ha gerido la combinacin de tcnicas para obtener
confirmado la existencia de varias especies de un diagnstico ms certero, como por ejemplo
Leishmania como son L. (V) guyanensis, L. (V) el frotis de la lesin con el aislamiento de mate-
panamensis y L. (V) brasiliensis, L. (L.) mexica- rial gentico y la Reaccin en Cadena de la Poli-
na, L. (L.) amazonensis, L (V) equatoriensis y L merasa (PCR) (Bonifaz et al., 2011).
(L) major-like. (Calvopina et al., 2004, Weigel et El objetivo de este estudio es establecer la
al., 1994; Fernndez et al., 2012). Segn el Pro- sensibilidad de la tcnica de PCR como tcnica
grama Nacional de Leishmaniasis en Ecuador, alternativa frente al examen directo (tcnica de
durante el periodo 2010 al 2014, se reportaron referencia) y al cultivo, tcnicas actualmente en
6.608 casos de leishmaniasis al Ministerio de uso, con el fin de establecer las ventajas de esta
Salud Pblica del Ecuador tcnica en cuanto a sensibilidad para el diag-
El diagnstico definitivo de leishmaniosis nstico de leishmaniosis cutnea
requiere la demostracin de la presencia del
parsito Leishmania s en el frotis obtenido de MATERIALES Y MTODOS
las lesiones teido con Wright, en el estado de
amastigotes en los cultivos en el estado de pro- Muestras.- Se analizaron 23 muestras to-
mastigote (Arechavala, 2010), o bien la deteccion madas por tcnicos del Laboratorio de Parasito-
del DNA. La examinacin por microscopa es loga del Instituto Nacional de Investigacin en
econmica, rpida pero de limitada sensibilidad, Salud Pblica (INSPI), Provenientes pacientes de
mientras que los cultivos son sensibles a la con- zonas endmicas y de pacientes que visitaban el
taminacin microbiolgica (Arechavala, 2010). Laboratorio de Parasitologa. Las muestras de-
Como en toda enfermedad infecciosa es impor- ban ser tomadas del sitio de la lesin, la misma
tante identificar al agente etiolgico y as, admi- que deba estar limpia, libre de crema, polvo y/o
nistrar al paciente un tratamiento adecuado. ungento.

La Organizacin Mundial de la Salud consi- Microscopa.- El frotis de la lesin se rea-

dera a la leishmaniosis cutnea una enfermedad liz por el mtodo de raspado de la lcera con
olvidada severa en la categora 1 de enfermedad un bistur, el material colectado fue colocado
emergente y no controlada. La mayor parte de en una placa de vidrio, teido con Giemsa, y
los casos pueden ser tratados con medicacin fue analizado con microscopio de luz (Olympus)
tpica, pero algunas especies de Leishmania utilizando el objetivo 100X, observando amas-
pueden causar lesiones mucocutneas en don- tigotes en forma ovalada o redondeada de 2 a 5
de es necesario un tratamiento sistmico. La micras con un kinetoplasto en forma de bastn.
identificacin del parsito es laboriosa y nece- Cultivo.- Para el cultivo se utiliz la tcnica
sita de un observador experimentado. las tcni- de aspirado de la lesin (ulcera) con una jerin-
cas de amplificacin de DNA podran constituir guilla de insulina con aguja calibre 23 y se ino-

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 Caicedo et al., 2016; Comparacin de la sensibilidad de la PCR frente a otras tecnicas de Laboratorio utilizadas para el diagnstico de
Leishmaniosis Cutnea en Ecuador
cul la muestra en medio de cultivo Novy, Mc-
Neal, Nicolle (NNN) y a temperatura ambiente
del laboratorio +/-22C. Fueron observados por
lo menos vez por semana en busca de promas-
tigotes que es una forma alargada, flagelada de
14 a 20 micras de largo, nucleada y con kineto-
plasto en forma de barra
PCR.- Para realizar la PCR luego de realizar
un raspado de la ulcera para obtener el frotis,
se realiz una impronta de la lesin en papel fil-
tro FTA, se dej secar a temperatura ambiente y
posteriormente el papel filtro fue almacenado a
4C hasta realizar el paso de extraccin.
Extraccin de ADN.- Para la extraccin de
ADN se utiliz el kit comercial (Qiamp DNA
Blood Mini kit- QIAGEN, Venlo, Netherlands ) Se
utiliz el papel filtro FTA y se sigui las instruc-
ciones del fabricante. El ADN extrado fue con-
servado a -80C hasta su posterior uso.
PCR.- La reaccin de amplificacin fue rea-
lizada en un termociclador S1000 Thermal Cy-
cler with Dual 48/48 Fast Reaction Module (Bio
Rad, Hercules, California, USA) . El volumen de
reaccin fue de 50 ul conteniendo 5uL del Ta-
pon 10X; 3uL de Cl2Mg (50mM); 5uL de dNTPs
(2mM); 1uL de cada primer (100ng/uL) HM1(5'-
CCG CCC CTA TTT TAC ACC AAC CCC-3', HM2
(5'- GGG GAG GGG GCG TTC TGC GAA -3'), HM3
(5'- GGC CCA CTA TAT TAC ACC AAC CCC -3') pre-
viamente descritos (Leite et al. 2010); 0,2uL de
Taq-Polimerasa (5U/ul); 5ul de ADN previamente
extrado, y agua hasta completar el volumen.
Las muestras fueron sometidas a un ciclo de
desnaturalizacin de 15min a 94C; seguido por
30 ciclos: 30seg a 94C (Desnaturalizacin), 30seg
a 50C (hibridacin), 30seg a 72C (extensin) y un
periodo de elongacin final de 10min a 72C.
Electroforesis.- Los productos de amplifica-
cin fueron migrados en geles de agarosa al 2 %
conteniendo SYBR safe (life technologies, Car-
lsbad, CA, USA) utilizando un marcador de peso
molecular de 100pb (Invitrogen, Carlsbad, USA)
y fueron foto documentados usando el transilu-
minador Molecular Imager Chemidoc XRS (Bio
Rad, Hercules, California, USA). El producto de
amplificacin esperado es una region conserva-
da del Kinetoplasto del parasito de 120pb.
Anlisis de datos.- Se compar los resulta-
dos positivos obtenidos en cada tcnica utilizan-
do anlisis porcentual simple. Los datos sern
ingresados en una base de datos de Microsoft
Excel y analizados mediante estadstica simple e
inferencial. Usando el programa Epi Info 7. Los re-
sultados sern expresados en porcentajes
RESULTADOS
La sensibilidad de estos mtodos en el
diagnstico de leishmaniosis cutnea se ve
afectada por varios factores como la cantidad
de nmero de muestras a analizar, el personal
quien toma la muestra, el lugar de la lesin del
cual se toma la muestra (centro o borde de la
lesin), la experticia del tcnico de laboratorio
que la analiza y la calidad de los reactivos utili-
zados (Arechavala, 2010).
La observacin del parsito ya sea como
amastigote en el frotis, como promastigote en
el cultivo o la observacin del DNA parasitario
visto como la presencia de una banda de 120pb
en el gel de agarosa. (figura 1), confirman la in-
feccin con el parsito Leishmania spp.
Amastigotes de
lesihmania en
el interior de un
macrofago
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Examen directo, frotis de lesion Promastigotes de Lesihmania Raspado de ulcera, obtencin de frotis
provenientes de cultivo para realizar la tincin

Obtencion de muestras para el cultivo Inoculacion de la muestra en tubos Impronta de lesion en papel filtro
con medio NNN

Tarjetas de papel
filtro con la
identificacion del
paciente

La sensibilidad de deteccin de cada tcnica fue:

91% (21/23) para el examen directo, 70% (16/23) para
la PCR y 43% (10/23) para el cultivo (figura 2)

A partir de los resultados obtenidos, podemos

concluir que la tcnica ms sensible para identificar
el parsito es la observacin el frotis de la lesin tei-
do, seguido de la PCR y el cultivo. Por lo que la com-
binacin de tcnicas como la microscopia y la PCR
sera la ideal para el diagnstico (Bonifaz et al., 2011).
Segn Olga Zerpa (2002) la sensibilidad de la de-
teccin del parsito proveniente de lesiones cutneas
por microscopia vara entre 32,7% y 90,4%. De acuer-

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Leishmaniosis Cutnea en Ecuador

Figura 2. Mtodos de diagnsticos utilizados en este estudio y el porcentaje de positivos

por cada tcnica: Nivel de deteccin del frotis: 91%, seguido de la PCR con un 70% y el
cultivo con un 47%

do con Ros Yuil y Yuil de Ros (2010) consideran del parsito por el examen microscpico de fro-
que un microscopista entrenado debe evaluar, tis teido con Giemsa es el "estndar de oro"
por lo menos, dos frotis por 1 hora; a pesar de en el diagnstico de la leishmaniosis, ya que
esto, puede haber falsos negativos. Entre las es altamente especfico. Sin embargo, autores
ventajas del uso del frotis se pueden mencio- como Calvopina et al. 2004 consideran que en
nar: bajo costo, relativa facilidad para la realiza- los laboratorios de las reas endmicas de Ecua-
cin, rapidez en la obtencin del resultado y no dor hay muchos falsos positivos que podran ser
requerir un laboratorio con equipo sofisticado. debido a personal no capacitado.
La sensibilidad de esta prueba aumenta del En este estudio pudimos observar que la
40 al 80 % dependiendo s se toma una muestra sensibilidad del frotis de lesin sospechosa de
o cuatro muestras de la lesin para el examen Leishmania fue del 91% (21/23), este resultado
microscpico. es muy similar al referido en la revisin realiza-
Ros Yuil y Yuil de Ros (2010) manifestaron da por Ros Yuil y Yuil de Ros (2010) (90%) pero
que cuando se toma la muestra del borde de difiere al encontrado por Calvopina et al., 2004
la lcera para observacin microscpica se ob- (45%), a pesar de que este estudio fue realizado
tiene una sensibilidad del 78,3 %; sin embargo, en muestras de pacientes ecuatorianos. Dicha
cuando la muestra es tomada del fondo de la discrepancia podra deberse a factores mencio-
lcera, la sensibilidad aumenta a un 90,4 %. Es nados por Ros Yuil y Yuil de Ros (2010), Calvopi-
por esto que, entre las recomendaciones para na et al. (2004); Desjeux et al. (2004), entre otros.
la realizacin de un buen examen directo, se
incluyen la toma de muestras tanto del borde
como del fondo de la lcera. La identificacin

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Figura 3. Sensibilidad de deteccin del parsito Leishmania por medio del frotis, segn
diferentes investigadores: Calvopina 45%; Ros 90%; INSPI 91%

Al comparar los trabajos de varios investi- de la enfermedad, si bien el cultivo permite el

gadores (figura 3), observamos una discrepan- aislamiento del parsito para su observacin di-
cia de resultados y esto puede deberse al entre- recta se necesita del microscopio.
namiento del personal de laboratorio. En este estudio pudimos observar que la
El cultivo del material proveniente de las sensibilidad del cultivo de Leishmania fue del
lesiones cutneas nos permite la visualizacin 43% (10/23), siendo este nivel de deteccin infe-
directa del parsito e incrementar la cantidad rior al referido por Ros Yuil y Yuil de Ros (2010)
de parsitos vivos disponibles para la realiza- (67%) y al encontrado por Calvopina et al. (2004)
cin de pruebas adicionales. El cultivo del aspi- (57%), este bajo nivel de deteccin puede deber-
rado con aguja fina de la lcera es un mtodo se a la cronicidad de las lceras, contaminacin
sencillo y no traumtico para lograr un diagns- microbiana, tratamientos utilizados por los pa-
tico definitivo con una sensibilidad entre un 52 ciente, adems el cultivo del parsito es difcil
a 67,5 %. (Ros Yuil y Yuil de Ros, 2010). Esta y necesita de preferencia un ambiente termore-
tcnica es complementaria para el diagnstico gulado a 25C y en este caso estos se encontra-
directo de la enfermedad. Entre las ventajas del ban a temperatura ambiental (figura 4)
cultivo podemos mencionar: el ser econmico, La PCR puede ser utilizada tanto para el
accesible y permite aislar organismos para ha- diagnstico como para genotipificar muestras
cer pruebas de susceptibilidad a medicamentos clnicas (Pereira et al., 2009). La sensibilidad de
y genotipificacin. Sin embargo, tambin tiene la PCR puede variar debido a la regin gentica
desventajas como: requerir equipo especial, que se decide amplificar y al nmero de copias
consumir mucho tiempo, ser vulnerable a con- de esta en el genoma del microorganismo. Por
taminacin cuando se realiza en el campo y te- lo tanto, se debe trabajar con el marcador ge-
ner baja sensibilidad (Ros Yuil y Yuil de Ros, ntico que posea la mayor especificidad y sen-
2010). Se considera al cultivo como una tcni- sibilidad posible. Varios estudios han analizado
ca complementaria para el diagnstico directo estas variables en busca de mejores resultados.

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Leishmaniosis Cutnea en Ecuador

Figura 4. Sensibilidad de deteccin del parsito Leishmania por mtodo de cultivo segn
diferentes investigadores: Calvopina 57%; Ros 67%; INSPI 43%

As: en el ao 2006 Bensoussan et al., realizaron en la mitocondria y que contiene numerosas

un estudio utilizando tres tipos de marcadores
para el diagnstico de leishmaniosis cutnea.
1.- Gen de la glucoprotena 63 (gp63) tuvo una
sensibilidad del 53,8%; 2.- Genes del ARNr (cido
ribonucletido ribosomal) present un 91% de
sensibilidad, y 3.- marcadores del kinetoplasto
presentando una sensibilidad del 98,7%, (Ben-
soussan E, 2006). El kinetoplasto, es una masa
de ADN circular extranuclear que se encuentra
copias del genoma mitocondrial.(de Lima et
al.,2009, Rodgers et al. 1990).
Se considera al ADN del kinetoplasto
(ADNk) muy resistente a la manipulacin y ha
sido utilizado para discriminar entre especies
relacionadas de tripanosomatideos como T.
cruzi y T. rangeli y varias especies de Leishma-
nia (de Lima et al., 2009).

Figura 5 : Organizacin del minicrculo del parsito Leishmania spp.

Fuente:www.ebi.ac.uk/parasites/kDNA/Source.html

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El ADN del kinetoplasto (ADNk) represen-
ta ms del 20% del ADN total celular y consta
de dos tipos de molculas de ADN circulares:
maxicrculos y minicrculos. Los maxicrculos
(20 - 35kb), tienen genes tpicamente mitocon-
driales y estn presentes en cerca de 20-50 co-
pias. Los minicrculos (0,5 a 1,5 kb), codifican
los ARN guas involucrados en los procesos de
maduracin de los ARNm ARN mitocondriales
(edicin de ARN). Ellos aparecen en gran canti-
dad (10.000 unidades / kinetoplasto) y hetero-
geneidad de secuencias entre los grupos. Cada
uno de los minicrculos de Leishmania muestra
una regin conservada de aproximadamente
200 pb que contiene tres bloques de secuen-
cias conservadas en todas las especies de Lei-
shmania (figura 5). El resto de la molcula, de
aproximadamente 550-700pb, contiene secuen-
cias altamente variables, con alta proporcin de
nucletidos A y T. Por lo tanto, en esta regin
se pueden encontrar secuencias especficas
para diferentes grupos de Leishmania (de Lima
et al., 2009; Pereiraet et al., 2009, Yurchenko et
al. 1999; Rodgers et al. 1990; Fay, 1989).
Figura 6: Sensibilidad de deteccin por PCR del parsito Leishmania segn diferentes
investigadores: Calvopina 85%; Ros 89%; INSPI 70%
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En el artculo de revisin de Ros et al.
(2010) se mencionan 2 estudios realizados para
detectar Leishmania por PCR, uno de ellos uti-
liz una secuencia especifica del ADNk para
hacer el diagnostico de leishmaniosis cutnea,
el producto de amplificacin obtenido de esta
PCR fue de 120 pares de bases. La PCR del ADNk
fue positiva en el 89,3 % de los casos. El segundo
estudio que se menciona; realizado en Brasil en
un centro de referencia para el diagnstico de
leishmaniosis tegumentaria americana, revel
que la PCR del ADNk tena una sensibilidad del
92,3% para el diagnstico de esta enfermedad.
En nuestro estudio se utiliz iniciadores de
la regin conservada del minicrculo del kineto-
plasto debido a que es un rea altamente con-
servada (Primez et al., 1999; Pereira et al. 2009,
Yurchenko et al. 1999), que ha mostrado entre
un 98 y 100% de identidad entre diferentes ge-
notipos de Leishmania (Pereira et al. 2009) y
porque el objetivo de nuestro trabajo era la de-
teccin del parsito por PCR sin identificar la
especie.
 Caicedo et al., 2016; Comparacin de la sensibilidad de la PCR frente a otras tecnicas de Laboratorio utilizadas para el diagnstico de
Leishmaniosis Cutnea en Ecuador

En nuestro estudio se obtuvo el tamao de

amplicn esperado en 16 de 23 muestras (70%), LITERATURA CITADA
estos resultados son inferiores a los resultados
Arechavala A .I., Bianchi M. H., Santiso G.
referidos por Ros et al. 2010 (89%) y Calvopina
M., Lehmann E. A., Walker L. y Negroni R. 2010.
et al., 2004 (85%) (figura 6), este bajo nivel de
Coloracin de Giemsa en el diagnostico etiol-
deteccin puede deberse a la antigedad de la
gico diferencial de patologas infecciosas con
muestra en el papel filtro, as como tambin in-
compromiso cutneo. Revista Argentina de Mi-
hibidores de la reaccin de PCR presentes en la
crobiologa, 42 (4): 316.
superficie cutnea de los pacientes. La desven-
taja de esta tcnica es que es costosa y necesita Belli A., Rodriguez B., Aviles H. y Harri E.
equipo especializado. 1998. Simplified polymerase chain reaction de-
tection of new world Leishmania in clinical spe-
CONCLUSIONES cimens of cutaneous leishmaniasis. The Ameri-
can Society of Tropical Medicine and Hygiene,
Los resultados obtenidos en este estudio
58(1): 102109.
nos permiten concluir que la deteccin del pa-
rasito por microscopia fue ms alta que la de- Botero D. y Restrepo M. 1992. Parsitosis
teccin del DNA por PCR. La PCR permiti de- Humanas. Corporacin para Investigaciones
tectar mayor nmero de muestras positivas que Biolgicas. Segunda Edicin. Colombia.
con el cultivo. La PCR para detectar Leishmania Bensoussan E., Nasereddin A., Jonas F., Sch-
no es ms sensible que la microscopia, pero si nur L. y Jaffe C. 2006. Comparison of PCR assays
es ms sensible que el cultivo. La combinacin for diagnosis of cutaneous Leishmaniasis. Jour-
de tcnicas ideal para el diagnstico debera ser nal of Clinical Microbiology, 44(4): 1435 1439.
la microscopa y la PCR y no la utilizada actual-
mente: Microscopia y cultivo. Calvopina M., Armijos R. X., y Hashiguchi
Y. 2004. Epidemiology of leishmaniasis in Ecua-
dor: Current status of knowledge - a review.
Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, 99(7):
663-672.
de Vries H.J., Reedijk S.H. y Schallig H.D.
2015. Cutaneous leishmaniasis: recent develop-
ments in diagnosis and management. American
Journal of Clinical Dermatology, 16(2): 99-109.
de Lima Rivero A.R., Navarro Aguilera M.
C., Arteaga Ochoa R.Y. y Contreras lvarez V.T.
2009. Heterogeneidad gentica del ADN de ki-
netoplasto (kADN) de Trypanosoma cruzi indu-
cida por tratamiento con Bromuro de Etidio.
Salus online, 12 (1):149-162.
Desjeux P. 2004. Leishmaniasis: current
situation and new perspectives. Comparative
immunology, microbiology and infectious di-
seases, 27(5): 305-318.

diciembre 89
2016
 N 5, diciembre 2016
ISSN: 1390-7573

Fraga T.L., Brustoloni Y.M., Lima R.B., Dor- diagnosis of human American tegumentary lei-
val M.E.C., Oshiro E.T., Oliveira, J., ... y Pirmez C. shmaniasis in Rio de Janeiro, Brazil. Journal of
2010. Polymerase chain reaction of peripheral Clinical Microbiology, 37(6), 1819-1823.
blood as a tool for the diagnosis of visceral lei- Pirmez C., da Silva Trajano V., Neto M.P.O.,
shmaniasis in children. Memorias do Instituto Da-Cruz A.M., Gonalves-da-Costa S.C., Catan-
Oswaldo Cruz, 105(3): 310-313. ho M.,..y Fernandes O. 1999. Use of PCR in diag-
Gllego, M. y Riera, C. 2000. Las leishma- nosis of human American tegumentary leishma-
niosis humanas: leishmaniosis autctona por niasis in Rio de Janeiro, Brazil. Journal of Clinical
Leishmania infantum. Control de calidad SEIMC. Microbiology, 37(6): 1819-1823.
Universitat de Barcelona, Barcelona-Espaa. Rodgers M.R., Popper S.J. y Wirth D.F.
Guinara B. 2014. Enfermedad de Leishnia- 1990. Amplification of kinetoplast DNA as a
sis se ha extendido a 22 provincias del Ecuador. tool in the detection and diagnosis of Leishma-
El poder de la Palabra en Ecuadorinmediato. nia. Experimental parasitology, 71(3): 267-275.
com/radio. Junio 27 del 2014 Ray D. S. 1989. Conserved sequence blocks
Mimori T., Grimaldi Jr G., Kreutzer R.D., in kinetoplast minicircles from diverse species
Gomez E.A. McMahon-Pratt D., Tesh R.B. y Has- of trypanosomes. Molecular and Cellular Biolo-
higuchi Y. 1989. Identification, using isoenzyme gy, 9(3): 1365-1367.
electrophoresis and monoclonal antibodies, of Ros Yuil J.M., Yuil de Ros E. 2010. Mto-
Leishmania isolated from humans and wild ani- dos diagnsticos parsitolgicos, inmunolgi-
mals of Ecuador. The American Society of Tropi- cos, histopatolgicos y moleculares de Leish-
cal Medicine and Hygiene, 40(2): 154-158. maniasis Cutnea. Revista Mdica Cientifica,
Murray H.W., Berman J.D., Davies C.R. y 23(2):45-60
Saravia N.G. 2005. Advances in Leishmaniasis. Ryan K.J. y Ray C.G. 2004. Sherris medical
Lancet 366,15611577. microbiology. (4th ed. edicin). McGraw Hill.
Pereira-Chioccola V.L. 2009. Diagnstico pp. 74954.
molecular das leishmanioses: contribuio ao Salazar M. y Castro E. 2001. Leishmaniasis
Programa de Vigilncia e Controle da LVA no cutnea, mucocutnea y cutnea difusa. Revi-
Estado de So Paulo, Boletin Epidemiolgico sin clnica de los casos en el Hospital Regional
Paulista; 6(68): 4-13. de Pucallpa de 1997 a 1999. Dermatologa Pe-
Prez D.B., Tordoya L.F.S., Luis, J. y Quispe C. ruana, 11(1), 21-25.
2011. Diagnstico de leishmaniasis cutnea por Telmo E. Fernndez R. y Ricardo T. Almeida
Reaccin en Cadena de la Polimerasa, a partir de
F. Reporte de lesiones mucosas. En leishmanio-
material gentico obtenido de frotis de lesin te-
sis tegumentaria americana, en el litoral (costa)
idos con Giemsa. BIOFARBO, 19(2), 28-38. ecuatoriano. Revista de Patologa Tropical. Vol.
Peters W. y Killick-Kendrick R. 1987. The 41 (3): 356-366.
Leishmaniasis in biology and medicine. Biology Weigel M. M., Armijos R. X., Racines R.
and Epidemiology. Academic Press. London. J., Zurita C., Izurieta R., Herrera E. e Hinojosa
Pirmez C., da Silva Trajano V., Neto M.P.O., E. 1994. La leishmaniasis cutnea en la regin
Da-Cruz, A.M., Gonalves-da-Costa S.C., Catan- subtropical del Ecuador: percepciones, conoci-
ho M., ... y Fernandes O. 1999. Use of PCR in mientos y tratamientos populares.

90
 Caicedo et al., 2016; Comparacin de la sensibilidad de la PCR frente a otras tecnicas de Laboratorio utilizadas para el diagnstico de
Leishmaniosis Cutnea en Ecuador

Yurchenko V.Y., Merzlyak E.M., Kolesni-

kov A.A., Martinkina L.P. y Vengerov, Y.Y. 1999. RECOMENDACIONES
Structure of Leishmania minicircle kinetoplast
Realizar estudios con un universo de mues-
DNA classes. Journal of Clinical Microbiology,
tras mayor para detectar y genotipificar las le-
37(5): 1656-165
siones sospechosas de Leishmania procurando
Zerpa O., Borges R., Loyo N., Galindo W., optimizar la calidad de la muestra, buscar otras
Belisario D., Rodrguez N., ... y Convit J. 2002. zonas conservadas del genoma del kinetoplas-
Comparacin de cinco mtodos para el diag- to, podra utilizarse una modificacin de la PCR
nostico de leishmaniasis cutnea. Dermatologa convencional usada en este estudio que es la
Venezolana, 40(4). PCR en Tiempo real que es menos operador de-
pendiente y es ms sensible que la convencional.
Se debe considerar a la PCR como una al-
ternativa para el diagnstico de Leishmania, en
especial en aquellos sitios donde no estn dis-
ponibles microscopistas experimentados en el
diagnostico microscpico de este parsito.

AGRADECIMIENTOS
Agradezco a la Dra Aracelly Alava Alprech
por permitir participar en el proyecto SENACYT
PIC-08-IZP-00001 Desarrollo de los diagnsticos
basados en Biologa Molecular de las Principales
Enfermedades Infecciosas de Importancia en Sa-
lud Pblica: al Dr. Luigi Martini, Dr. Luis Fernando
Solrzano y al personal del Laboratorio de Para-
sitologa por el apoyo brindado durante la ejecu-
cin de este proyecto; al personal de Concepto
Azul por contribuir a mi formacin profesional y
a mis padres por estar siempre conmigo.

diciembre 91
2016