INTRODUCCION Las enzimas como catallzadores Catdlisis. Los organismos vivos pueden obtener y gastar la energia muy rapidamente debido a la presencia de catalizadores bioldgicos llamados enzimas. Como sucede con los catalizadores inorgénicos, las enzimas modifican la velocidad de una reaccién quimica sin afectar el equilibrio final; y sdlo se requieren pequefias cantidades para efectuar la transformacién de un gran numero de moléculas de sustrato. Sin embargo, a diferencia de la mayoria de catalizadores inorganicos, las enzimas son bastante especificas, ya que catalizan un numero comparativamente pequefio de reacciones y en algunos casos tan solo una reaccién. Asi mismo, las enzimas funcionan solamente bajo condiciones muy definidas de pH, temperatura, concentra- cién de sustrato, cofactores, etc., propiedades que se ilustran en algunos de los experimentos siguientes. Clasificacién. Las enzimasse designan y se clasifican de acuerdo con el tipo de reaccién que catalizan. Los seis grupos principales de enzimas so! 1. Oxidoreductasas. 2. Transferasas. 3. Hidrolasas. 4. Liasas. 5. Isomerasas. 6. Ligasas (sintetasas). 230Enzimas 231 Cada enzima se designa por un nombre sistematico y por un numero que la identifica de acuerdo a sus grupos y subgrupos. La lactato: NAD oxido- reductasa, por ejemplo, es la ntimero 1.1.1.27. El primer numero nos dice que la enzima esté en el grupo 1 y por lo tanto es una oxidoreductasa. El segundo numero es el subgrupo e indica el grupo quimico que modifica, que en este caso es el —CHOH. El tercer nimerodenota el subgrupo, el cual indica que el aceptor de hidrégeno es el NAD o NADP. El cuarto es el nimero carac- teristico de la enzima. Existe también un nombre comun recomendado, mas corto y mas conveniente que el nombre sistematico. Para el caso delaenzima antes mencionada este es deshidrogenasa lactica. EXPERIMENTO 9.1 Catdlisis enzimatica Fundamento El perdxido de hidrégeno se descompone en agua y oxigenoen presenciade un catalizador. En este experimento, se compara la capacidad de la enzima catalasa y del catalizador inorgdénico para descomponer el peréxido de hidrégeno. Esto puede medirse titulando con permanganato de potasio y usando Mn" como catalizador. 5H,0,+2MnO,- +6H* ——> 50, +2Mn‘* +8H,0 Materiales 100 1. Peréxido de hidrégeno (10 mmol/1). 221 2. Amortiguador de fosfato sédico 0 potasico 51 (50 mmol/l, pH 7.2). 3. Solucién de catalasa (0.2 g/ml). 31 4, Platino coloidal (20 ug/ml). 31 5, HCl (5 mmol/l). 151 6. MnCl, (0.1 mol/l). 500 ml 7. Patrén de KMnQ, (2 mmol/I). 101 8. Buretas (10 ml). 50 9. Bafio de agua a 37°C. 25 10. KCN (10 mmol/1). ;Cuidado: Veneno! 31 Método . Catélisis. Prepare cinco tubos de ensayo pyrex que contengan la mezcla indicada en la tabla siguiente y coléquelos en un bafio de agua a 37°C. Al mismo tiempo, coloque la solucién de perdxido de hidrégeno en el bafio de agua hasta alcanzar una temperatura de 37° C. Después de que permanezca5 minutos a esta temperatura comience la reaccién afiadiendo 5 ml ala mezcla presente en cada uno de los tubos. Remueva los tubos después de 3, 6,9, 12 y 15 minutos de incubacién e inmediatamente pare la reaccién agregando 5 ml de232 Bloquimica practica Componentes mi agua 3ml amortiguador de fosfato (50 mmol/l, H 7.2). Imi catalizador (catalasa o Pt coloidal) Imi HCI 5 mol/l para inactivar el catalizador. Coloque los tubos en un bafio de hielo y titule los contenidos de cada tubo con solucién patrén de KMnO,. Titulacién. A cada muestra agregue dos gotas de MnCl; 0.1 mol/I titule con KMnO, 2 mmol/I hasta obtener un color rosado palido. Si el KMnO, ha sido preparado en tal forma que sea realmente una solucién patrén, entonces 1 ml serd equivalente a5 1 mol de H, O,. Usando los datos de la titulacién, haga un grafico de la desaparicién de H, O, contra tiempo después de corregirel error debido a la descomposicién espontanea del H, Op. Controles. El H,O, es inestable y se descompone un poco espontdneamente en ausencia del catalizador. Para corregir el error que esta descomposicién introduce en los resultados se debe incubar paralelamente con la muestra una serie de tubos que contengan H, O;, amortiguador y agua pero sin catalizador. El valor obtenido en estos tubos se resta del de las muestras. Comparacién de los catalizadores. Los estudiantes deben trabajar en parejas y mientras uno de ellos hace el experimento con catalasa, otro usa platino coloidal. Todos los ensayos deben hacerse por duplicado. Usando el grfico calcule la actividad de cada catalizador a partir de la pendiente de la curva y exprese los resultados en términos de micromoles de H,O, descompuesto por minuto por miligramo de catalizador. Ademés, exprese los resultados en forma de micromoles de H,O, descompuesto por minuto por micromol de catalizador y compare la eficiencia relativa de la catalasa y del Pt coloidal. Peso molecular del platino = 195, Peso molecular de la catalasa = 25 000. Para efectos de los célculos suponga que hay s6lo un centro activo por cada &tomo o molécula. Envenenamiento. Repita el experimento con los dos catalizadores, pero utilice 1 ml de una solucién de KCN 10 mmol/l en vez de 1 ml de agua. Precaucién: este compuesto es venenoso; por tanto, no use pipetas sino una bureta para dispensarlo. Comente los resultados. Medicién de la actividad enzimatica Ensayo de la enzima. Debido a quesélo se necesitan muy bajas concentracio- nes de enzima para catalizar una reaccién dada, s6lo muy pocas enzimasEnzimas 233 pueden medirse directamente. Por consiguiente, la presencia de una enzima se demuestra generalmente siguiendo la desaparicién del sustrato o la aparicién de un producto de la reaccién. La enzimaes incubada con el sustrato bajo condiciones cuidadosamente controladas y se sacan alicuotas aintervalos de tiempo apropiados para ser analizados. Controles. Ademés de las ‘muestras’, siempre se preparan ‘controles’, unode los cuales no contiene enzima mientras el otro contiene enzima pero no sustrato. Pueden ser necesarios también otros ‘controles’ cuando la enzima requiere varios cofactores, El objeto de los controles es corregir los errores que se presenten debido a reacciones quimicas esponténeas no especificas ni catalizadas por la enzima. Curvas de progreso. La velocidad de una reaccién enzimatica se puede expresar como funcién de la concentracién de sustrato transformado o producto obtenido con respecto al tiempo, luego de restar los valores debidos a cualquier transformacién no enzimatica. El tipo de curva obtenidose muestra en la figura 9.1 y se conoce como gurva de progreso. La transformacién del sustrato con respecto al tiempo es lineal al comienzo, pero pronto comienzaa disminuir. Inicialmente no hay productos presentes en la mezcla de incubacién, pero, a medida que progresa la reaccién, la reaccién inversa se hace més y més importante hasta alcanzar el equilibrio. La concentracién de sustrato también disminuye con el tiempo de manera que la actividad se hace menor porque la enzima estard menos saturada de sustrato. Finalmente, la enzima puede ser inhibida por los productos formados o puede inactivarse lentamente bajo las condiciones experimentales. Todos estos efectos juntos hacen que sea casi imposible derivar una ecuacién esténdar que se ajuste ala curva de progreso. Por tanto la actividad enzimética (v) se determina conside- rando tinicamente la velocidad inicial de reaccién (v = a/b) ya que en tales condiciones los efectos discutidos son mas pequefios (figura 9.1). Le actividad enzimética inicial es la pendiente ‘do la parte lineal de la curva, v= 2/6. Sustanc! wansformada, s Tiempo, ¢ Figura 9.1 Curva tipica de progreso234 Bloquimica practica Unidades enzimaticas. La actividad enzimdtica se expresa frecuentemente en términos de unidades (U). Una unidad es la cantidad de enzima que cataliza la conversién de un micromol de sustrato por minuto bajo condiciones definidas. En algunos casos la unidad es muy grande y laactividad debe expresarse mAs adecuadamente en términos de nmol/min o pmol/min. La unidad SI de actividad enzimatica es la’ katal (kat) que representa la transformacién de 1 mol de sustrato por segundo, Esta unidad es grande pero se pueden obtener valores més facilmente manejables expresando las actividades en microkatals (kat), nanokatals (nkat) o picokatals (pkat). 1U=14umolmin", 1 katal = 1 mols’, 1 U = wkat/60 = 16.67 nkat. La pureza de una enzima se expresa en términos de actividad especifica que se define como el ntimero de unidades enzimaticas (U) por miligramo de proteina. La actividad especifica en unidades SI se da en katals por kilogramo de proteina. Las actividades relativas de enzimas puras pueden ser comparadas usando como referencia sus actividades molares. Esto se conoce también como actividad molecular 0 niimero de recambio definido como el niimero de moléculas de sustrato transformados en un minuto por una molécula de la enzima bajo condiciones éptimas. Por ejemplo, la actividad molar de la catalasa es aproximadamente de 5 x 10°. EXPERIMENTO 9.2 Curva de progreso obtenida durante la hidrélisis de p-nitrofenilfosfato por la fosfatasa alcalina sérica (monoéster ortofosférico fosfohidrolasa, 3.1.3.1.) Fundamento La fosfatasa alcalina (pH éptimo 9—10) se halla en hueso, rifién, higado e intestino y acttia sobre los ésteres fosféricos liberando fosfato inorgénico. OH OH R-O-f-0 + H,0 ——> R-OH + Ho-f-0 HH OH Para su determinacién se usa como sustrato p-nitrofenilfosfato y el p-nitrofenol liberado por la hidrélisis enzimatica es medido colorimétrica- mente. El p-nitrofenol en solucién alcalina absorbe a 405 nm. El sustrato p-nitrofenilfosfato no absorbe a esta longitud de onda, de manera quel curso de la reaccién catalizada por la-enzima puede ser seguido facilmente midiendo el cambio de la extincién a 405 nm (experimento 4.7).Enzimas 235 | Materiales 100. 1. Amortiguador de bicarbonato-carbonato de sodio 500 ml (0.1 mol/1, pH 10.0). 2. Solucién de sustrato, p-nitrofenil fosfato (5 mmol/1 en 500 ml amortiguador alcalino). 3. Patrones de p-nitrofenol (50 “mol/1). Disuelva 69.6 mg li de p-nitrofenol en 100 ml de amortiguador alcalino, diluya esta solucién 1 a 100 con el amortiguador. Las soluciones (2) y (3) siempre deben estar frescas para cada experimento. 4. Suero. 50 ml 5. Colorimetros. 50. Método Prueba. Agregue 0.8 ml de amortiguador de carbonato-bicarbonato a 2ml de lasolucién de sustrato y mezcle vigorosamente. A un tiempo cero agregue 0.2 ml de suero y siga el cambio en extincién a 405 nm. Blanco. Se prepara lo mismo que la muestra, excepto que en vez de 0.2 ml de suero.se usa amortiguador. Patrén. Prepare una serie de soluciones de p-nitrofenol y haga un grafico de la extincién a 405 nm en funcién de la concentracién. Actividad enzimatica, v Concentracién de enzima, @ A. Respuesta normal 8. (i) Parte no lineal de 1a curva de progreso usada para calcular la actividad. {ii) Inhibidor presente en la preparacién de enzima, ©. Activador presente en la praparacién enzimatica, D. Agotamiento del sustrato. E, Inactivadores tales como metales pesados en la mezcla de reaccién, Figura 9.2 Efecto de la concentracién de enzima sobre la actividad236 © Bloquimica practica Célculos Reste el valor de la extincién obtenida para el blanco del valor dela muestray calcule a partir de la curva patrén el p-nitrofenol liberado. Exprese la actividad de la fosfatasa alcalina sérica en términos de unidades por mililitro de suero recordando que en el ensayo se usaron 0.2 ml de suero. Concentracién de la enzima Las pruebas enziméticas se hacen en una alicuota del material disponible pero la actividad debe referirse al volumen total de la soluci6n o del peso de la enzima. Por ejemplo, en bioquimica clinica se usa 0.1 ml 60.2ml desuero pero la actividad se expresa en unidades por litro. Por esta razén es importante determinar si la actividad varia linealmente con la concentracién de la enzima. Cualquier desviacion de la linealidad es el resultado de algin factor limitante (figura 9.2). EXPERIMENTO 9.3 Variacion de la actividad de la fosfatasa alcalina con la concentracion de la enzima Materiales Prepara 21 de amortiguador y sustrato y 200 ml de suero tal como lo hizoenel experimento anterior. Este material es suficiente para 50 parejas de estudiantes. Método Repita el experimento anterior con voliimenes de suero desde 0.1 a 0.6 ml. El volumen del sustrato se mantiene constante (2 ml) y el volumen del amortiguador se ajusta de manera que la mezcla final sea 3 ml como anterior- mente. Se prepara una curva de progreso para cada volumen de suero como se describié arriba y se determina la velocidad inicial de la reacci6n. Haga un grafico de la actividad enzimatica en funcién de la concentracién de enzima expresada como mililitros de suero. : Escoja un tiempo conveniente mas all de la porcién lineal de la curva de progreso y exprese la actividad como la cantidad promedio de p-nitrofenol liberada por minuto. Haga un grafico de la concentracién de enzima en funcién de la actividad y compare los resultados con la curva anterior, en la cual se usaron las velocidades iniciales para expresar la actividad. ACTIVIDAD ENZIMATICA Y CONCENTRACION DE SUSTRATO Enzimas del tipo Michaelis-Menten Cinética. Si se determina la actividad de una enzimaen presencia de concen- traciones crecientes de sustrato, se obtiene generalmente una curva hiperbélica rectangular similar a la que se muestra en la figura 9.3.Enzimas 237 Actividad enzimatica, v Concentracién de sustrate, s Figura 9.3 Efecto de la concentracién de sustrato sobre Ja actividad enzimatica A bajas concentraciones de sustrato v cambia linealmente con s, dando cinética de primer orden: v = —ds/dt = Ks, donde k es la constante de velocidad. A concentraciones altas de sustrato v es independiente de s, dando una cinética de orden cero: v = —ds/dt = constante = V. A concentraciones intermedias de sustrato se halla una mezcla de ciné- ticas de cero y primer orden. Se puede obtener una ecuacién que relacione v y s para la curva entera. Esta ecuacién fue derivada por primera vez por Michaelis y Menten en 1971: Vs . donde V y K,, son constantes. El supuesto basico en su derivacién es que la enzima y el sustrato forman un complejo que se disocia para dar la enzima y los productos. Derivacién de la ecuacién de Michaelis, Para derivar esta ecuacién, Mi- chaelis y Menten presumieron que la velocidad de disociacién del complejo es tan pequefia que no perturba significativamente el equilibrio entre la en- zima y el sustrato. Posteriormente, Briggs y Haldane extendieron esta idea y derivaron una ecuacién para condiciones de equilibrio dindmico, es decir, cuando la velocidad de disociacién del complejo es la misma que su velocidad de formacién durante el perfodo en que se hacen las mediciones.+ 238 Bloquimica practica Este supuesto més general se hace en la derivacién siguiente. El proceso total puede representarse por la ecuacién general: E +s ate Es ++ E+ Productos, (e—p) (s) “" @) donde e = concentracién de la enzima (E),$ = concentracién de sustrato (S), p = concentracién del complejo enzima-sustrato (ES) y ky, Rea, k-1 = constantes de velocidad. La concentracién del sustrato libre se considera igual asu concentracién total, ya que la cantidad que se encuentra ligadaen el com- plejo es generalmente pequefia. La velocidad de formacién de ES = k, | (e—p)s. La velocidad de disociacién de ES = k_ 1p + Rs 2p. . Bajo condiciones de equilibrio dindémico, la velocidad de formacién = la velo- cidad de disociacién, asi que: heyy (@ — p)s = (R-1 + Re2)p- Reagrupando esta ecuacién tendremos: PM o# (Bay the Mea) La velocidad de la reaccién enzimatica esté dada por v = k,, p, asi que: keynes s+ (Ray + Rea (Re) Cuando toda la enzima esté presente en forma de complejo, se obtiene entonces la velocidad maxima posible la cual est4 dada por V = k,, e. Sise reemplaza la expresién (k_, +hk,2)/(k+1) Por Km, entonces la ecuacién se transforma.en: Vs v o v=. s+Km 1+Ky/s v= Estas expresiones pueden reagruparse para obtener la forma usual de: (V—v)(Km +8) = VKm-Enzimas 239 Las constantes cinéticas Ky, y V. Sis = Km,entonces v = V/2, por lotanto, la constante de Michaelis es la concentracién de sustrato a la cual se obtiene la mitad de la velocidad maxima. Si se dan las condiciones de equilibrio sugeridas por Michaelis y Menten, entonces k, 2 es pequefia en comparacién de k, ,y puede ser ignorada. Por lo tanto, Km = k,/ks1,y es la constante de disociacién del complejo enzima- sustrato. Una Km grande implica, por tanto, una constante de disociacién grande o una constante de asociacién pequefia (1/Km). Al contrario, una K,, pequefia implica una constante de disociacién pequefia o una constante de asociacién grande (1/K,,). La constante de Michaelis da por lo tanto una medida de la afinidad enzima-sustrato. K,, grande = baja afinidad enzima-sustrato. K,, baja = alta afinidad enzima-sustrato. Las constantes cinéticas K,, y V pueden determinarse més conveniente- > mente utilizando una transformacién lineal de la ecuacién de Michaelis, que se obtiene tomando reciprocos: Km =a+5@yx Vv ein |e sustrato depende, por lo tanto, del nimero de sitios activos ocupados en * determinado momento por las moléculas del sustrato. A pesar de que la hemoglobina no es una enzima se puede usar como un buen ejemplo de una proteina alostérica que posee cuatro sitios de unin para el oxigeno. La facilidad relativa con que se unen los 4tomos de oxigeno del primero al cuarto es del orden de 1:4:24:9. Control metabélico. Las enzimas alostéricas tienen sitios especificos para la unin de activadores e inhibidores los cuales pueden actuar causando unEnzimas 243 Actividad enzimatica, v Coneentracién de sustrato, s. Figura 9.5 Efecto de la concentracién de sustrato sobre la actividad de una enzima alostérica cambio en la conformacién'de la proteina. Esto permite a los compuestos que no estan quimicamente relacionados con el sustrato unirse a la enzima y afectar su actividad. Por tanto, las enzimas alostéricas se encontrarén en muchos puntos de control metabdlico. Por ejemplo, el citrato es un inhibidor alostérico de la fosfofructocinasa, una enzima clave en el control de la gli- célisis, asi que, cuando el citrato se acumula en el ciclo de los dcidos tricar- boxilicos, la velocidad de la glicélisis disminuye para evitar la acumulacién de intermediarios del mismo ciclo. Por el contrario, AMP y ADP son acti- vadores alostéricos de la fosfofructocinasa, asi que cuando la concentracién de ATP es baja (ADP y AMP altos), la velocidad de la glicélisis aumenta. Cinética alostérica. La derivacién de una ecuacién exacta’ para la curva sigmoidea de las enzimas alostéricas es complicada, pero se puede obtener una ecuacién simplificada en la forma sugerida por Atkinson, si se hacen los siguientes supuestos: 1. Los intermediarios ES, ES,, ES,, etc., tienen sélo una existencia transi- toria. 2. El equilibrio entre la enzima y las moléculas de sustrato se obtiene répidamente. Si hay n sitios de unién para el sustrato S, entonces: E+nS = ES, 4+ E+ Productos. Suponiendo condiciones de equilibrio, ka _(EMS)" | ku: (ES, ] °244° Bloquimica practica reordenando, [B} = ae (1) Ahora, si la cantidad total de enzima presente es [Ep], entonces: [Eo] = [E] + [ES,], y reordenando, [E] = [Eo] —[ES,,]. Multiplicando por ks: 3 [E] = k3 [Eo] —k3[ES, ]. (9-2) Ahora v=k3[ES,] (9-3) Bd V= ks [Eo]. (94) Sustituyendo (9-3) y (9-4) en (9-2) se obtiene: kes [E] = V—v. (9-5) Sustituyendo (9-1) en @-5) tenemos: Sustituyendo (9-3) en (9-6): V-v= a . (9-7)Enzimas 245 Reordenando la ecuacién, v[s]” - VIS" BG K+ [s]" Si hay un solo sitio de unién parael sustrato(n = 1),entonces esta ecuacidn se transforma en la ecuacién de Michaelis y se obtiene una curva hiperbilica. Constantes cinéticas. Se puede obtener una transformacién lineal facil de usar tomando los logaritmos de la Eq. (9.7). Las constantes cinéticas se pueden calcular a partir del grafico de linea recta (figura 9.6). log u/(V — v) = nlog [S] —log K nda el ntimero de sitios de unién si los supuestos originales son correctos, pero en la préctica n es usualmente menor, puesto que la existencia de intermediarios no es transitoria. n puede ser considerado como el grado de cooperatividad: a medida que se incrementa el valor de n, el grafico v con respecto a [S] se hace més sigmoideo. Kes en la préctica una constante de equilibrio dinémico complicada, y pa- ra las enzimas alostéricas, cuando [S] = K, v no es V/2; pero, cuando v = V/2, podemos obtener a partir de la Eq. (9.7): 2[S]}" =K. Figura 9.6 Determinacién de las constantes cinéticas para una enzima alostérica246 © Bloquimica practica Por consiguiente, la concentracién de sustrato que da el 50% de la actividad méxima se relaciona con la constante K en la siguiente forma: K=[S]3o0 0, usando logaritmos, : log K = n log{S]} 50 EXPERIMENTO 9.5 Deshidrogenasa isocitrica de levadura: una enzima alos- térica* Fundamento La deshidrogenasa isocitrica de levadura cataliza la conversi6n de L-iso- citrato aa -cetoglutarato y diéxido de carbono usando NAD como coenzima. Este es un punto de control fundamental en el ciclo del Acido tricarboxilico que puede ser modificado por un numero de efectores incluyendo NAD, AMP y Mg”. La actividad enzimatica se mide siguiendo el incremento en ‘extincién a 340 nm a medida que el NAD se reduce a NADH). coo" coo" bu, bu, u-t-coo-+NaD ==> i + NADH, +C0, Ht H 0: 007 boo- L-Isocitrato a-Cetoglutarato Materiales 10 1. Levadura fresca de panaderia. 150 g 2. Arena lavada. = 3. Bicarbonato de sodio (0,1 mol/1). 200 ml 4. Amortiguador de tris-HCI (30 mmol/1, pH 7.4). 500 ml 5. D, L-isocitrato de sodio en amortiguador de tris, pH 7.4. 200 ml 6. NAD (2 mmol/l) en amortiguador de tris, pH 7.4. 250 ml 7, AMP (3 mmol/l) en amortiguador tris, pH 7.4. 50 ml 8 MgCl, (0.1 mol/l). 50 ml 9. Morteros y manos de mortero. 5 10. Espectrofotémetros ultravioleta con registrador. 5 11. Bafios de agua a 30°C. 5 *Con permiso del Dr. P. J. Butterworth.