Experimento 3

MICROBIOLOGIA E SADE

Relevncia

Os alunos tm a oportunidade de realizar procedimentos com micro-organismos, meios de cul-

tura e avaliar a eficcia de meios antisspticos. O resultado depende da realizao efetiva de uma
srie de procedimentos comuns nas reas de biologia e sade. Trata-se de um experimento que
desafia o trabalho em grupo e a organizao sequencial de procedimentos.

Materiais utilizados

s Balana semianaltica
s Esptulas de pesagem
s Bqueres de 100 mL
s Proveta de 100 mL
s 1 garrafa de vidro com tampa autoclavvel
s Reagentes para preparao do meio de cultura (LB, gar e glicose)
s Colnia de micro-organismos (E. coli)
s Autoclave
s Tubos Falcon de 50 mL estreis
s 2 placas de Petri pequenas
s Caneta de retroprojetor
s Cotonetes estreis
s Filme de PVC
s gua destilada
s Ampicilina (antibitico) 50 mg mL-1

reas envolvidas

s Biologia
s Sade

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 Introduo
A microbiologia o estudo de micro-organismos que so denidos, em princpio, como se-
res com dimenses microscpicas. Apesar de essa ser uma viso bastante simplicada, de modo
geral, correta. Esses seres englobam uma grande diversidade biolgica, cujos principais grupos
so os vrus, as bactrias, as rqueas, os protozorios e os fungos.
Os micro-organismos so encontrados em praticamente todos os ambientes naturais, como o
solo, o ar, a gua, o esgoto, as plantas, os seres humanos e outros animais. Dessa forma, para estudar
os micro-organismos de um determinado material/ambiente, todo o procedimento deve ser realiza-
do em um ambiente livre de outros micro-organismos (chamado ambiente estril). Isso signica que
o micro-organismo encontrado no experimento ser oriundo do material/ambiente estudado.
Existem algumas manobras durante a manipulao do material que impedem a entrada de
micro-organismos no sistema em estudo, conhecidas como manobras asspticas. Tais manobras en-
volvem basicamente o bico de Bunsen (Figura 3.1), e a realizao de toda a manipulao dever ser
realizada dentro da zona de segurana. Essa zona a regio do entorno que est mais prxima
chama, sem que haja perigo de superaquecimento ou queimaduras.
A utilizao do bico de Bunsen essencial, pois visa diminuio de micro-organismos no
campo de trabalho atravs do calor. Para isso, ele apresenta uma regulagem que torna possvel se-
lecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da microbiologia, deve ser utilizada a chama
azul, j que esta atinge maiores temperaturas e no apresenta fuligem. importante ressaltar que a
chama apresenta diferentes zonas, e tal fato importante para que o processo de ambagem seja
executado adequadamente. As zonas da chama so: zona neutra ( uma regio mais fria e no deve
ser utilizada para a ambagem), zona redutora e zona oxidante (so zonas em que ocorre a combus-
to e podem ser utilizadas para a ambagem).

Figura 3.1 Grfico de contorno indicando a

variao de temperatura e as zonas da chama
produzida pela combusto de GLP e ar

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BASE EXPERIMENTAL DAS CINCIAS NATURAIS
 O material utilizado na manipulao (meios de cultura, vidraria, entre outros) tambm deve
ser livre de micro-organismos. Para torn-lo estril ou para controlar o crescimento bacteriano nesse
material, diversos mtodos de assepsia e desinfeco, qumicos ou fsicos, so utilizados. Os quadros
3.1 e 3.2 mostram os principais mtodos de assepsia de desinfeco.

Quadro 3.1 Mtodos qumicos de assepsia e desinfeco

Agente Uso Modo de ao Tempo de exposio

Desnaturao proteica
Antisspticos
lcoois (70-80%) Curto (10-15 min)
Desinfectantes
Dissoluo de lipdios

Fenis Desinfectantes Desnaturao proteica Efeito imediato

Antisspticos
Compostos
Sanitizantes Alterao da membrana celular
quaternrios de Curto (10-30 min)
Desinfectantes (instrumentos bacteriana
amnio
cirrgicos)

Inativao enzimtica
Cloro Tratamento de gua Efeito imediato
Agente oxidante

Antisspticos
Iodo Inativao enzimtica Efeito imediato
Desinfectantes

Antisspticos
Iodforos Inativao enzimtica Efeito imediato
Desinfectantes

Curto (formas vegeta-

Desinfectantes (instrumentos e Desnaturao proteica
Aldedos tivas)
superfcies) Agente alquilante
Prolongado (esporos)

Metais pesados Antisspticos Inativao enzimtica

Quadro 3.2 Mtodos fsicos de assepsia e desinfeco

Calor mido Vidraria, meios de cultura,

Desnaturao proteica 20 min
(autoclave) artigos hospitalares

Calor seco Instrumentos metlicos, Desnaturao proteica

2h
(estufa a 170C) leos e vidrarias Oxidao

Reteno de partculas
Filtrao Lquidos e meios de cultura Efeito imediato
maiores que o poro do filtro

Radiao
Vidraria, plsticos, superfcies, Formao de dmeros de piridina
ionizante, 15 min (UV)
preservao de alimentos no DNA e de radicais livres
ultravioleta)

Outros procedimentos podem ser realizados para evitar ou restringir o crescimento de

micro-organismos em meios de cultura. Um exemplo a adio de antibiticos, compostos que tm
efeito citotxico ou citosttico sobre clulas bacterianas. Os antibiticos mais utilizados so os que
inibem a sntese da parede celular bacteriana (ex.: beta-lactmicos), os que inibem a sntese proteica
das bactrias (ex.: aminoglicosdicos), os que inibem a replicao bacteriana (quinolonas) e os que
apresentam a citotoxicidade por produo de intermedirios reativos (ex.: nitrofuranos).

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MICROBIOLOGIA E SADE
 Figura 3.2 Chave de identificao dos micro-organismos

Para identicar se as colnias de micro-organismos em um meio de cultura so fungos ou

bactrias, uma anlise preliminar pode ser feita analisando-se apenas caractersticas macroscpicas
(Figura 3.2). De acordo com as caractersticas observadas, como tamanho, forma e resistncia ao anti-
bitico, possvel identicar a provvel natureza de alguns micro-organismos. Para sabermos se um
determinado micro-organismo bactria ou fungo, testes mais sosticados podem ser necessrios.
Uma forma simples de diferenciar fungos (Eukarya) de bactrias (Procarya) observando
sua morfologia macro e microscpica. Os fungos podem ser morfologicamente divididos em dois
grandes grupos: lamentosos e no lamentosos (Figura 3.3). Os fungos lamentosos so multice-
lulares e formam estruturas em formato de tubos chamados hifas. Estes fungos formam colnias
com aspectos morfolgicos semelhantes a apos de algodo, veludos, pelos. Os fungos no la-
mentosos so geralmente organismos unicelulares confundidos com colnias de bactrias. A diferen-
ciao realizada pela observao em microscpico ptico: as clulas eucariticas so maiores que as
procariticas. Alm disso, as bactrias podem ser de diversas formas: cocos (esfricas ou arredondadas),
bacilos (forma de basto), vibrio (forma de vrgula), espirilo (forma espiral).

Figura 3.3 Fotomicrografias de fungos observados

ao microscpio ptico de contraste interferencial. A, fungo
filamentoso Chytridiumconfervae. As setas indicam
as hifas desse fungo. B, fungo no filamentoso
(leveduriforme) do gnero Saccharomyces

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BASE EXPERIMENTAL DAS CINCIAS NATURAIS
 Objetivo
Vericar a presena de micro-organismos em diversos objetos/ambientes em meios de cultu-
ra com ou sem antibitico. Para tal, todo o procedimento dever ser realizado utilizando manobras
asspticas em ambiente estril.

Parte experimental
Materiais

s Balana semianaltica
s Esptulas de pesagem
s Bqueres de 100 mL
s Proveta de 100 mL
s 1 garrafa de vidro com tampa autoclavvel (ex.: garrafa de suco)
s Reagentes para preparao do meio de cultura (LB, gar e glicose)
s Colnia de micro-organismos (E. coli)
s Autoclave
s Tubos Falcon de 50 mL estreis
s 2 placas de Petri pequenas
s Caneta de retroprojetor
s Cotonetes estreis
s Fita crepe
s Filme de PVC
s Fita de autoclave
s gua destilada
s Ampicilina (antibitico) 50 mg mL-1

Procedimento

PARTE A Preparo do meio de cultura para micro-organismos

Sempre que zer um experimento, faa apenas a quantidade de meio de cultura que for usar.
Nesta prtica, sero utilizadas duas placas de Petri contendo meio de cultura constitudo por LB, gar
e glicose.
Calcule quanto de cada reagente voc precisar para preparar 30 mL de meio, sendo 15 mL
para cada placa de Petri. Pese cada reagente separadamente (LB, gar e glicose), respeitando as pro-
pores, e junte-os em um becker. Em uma proveta, acrescente o volume nal de gua destilada (i.e.,
se voc preparar 30 mL de meio, mea 30 mL de gua). Insira os valores na Tabela 3.1.

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MICROBIOLOGIA E SADE
Tabela 3.1 Meio LB-gua suplementado com glicose com ou sem ampicilina

Para 1.000 mL de meio Para 1.000 mL de meio

Reagentes Para 30 mL de meio
sem antibitico com antibitico

LB Broth 25 g 25 g

Ampicilina - 50 g.mL-1

Glicose 20 g 20 g

gua Para completar 1 L Para completar 1 L

Agar bacteriolgico 15 g 15 g

Transra a gua da proveta para a garrafa de vidro j contendo o LB, o gar e a glicose e
mexa at dissolver completamente. Escreva o nome do grupo em um pedao de ta crepe e cole
na garrafa. Autoclave por 15 minutos.

PARTE B Preparo das placas de Petri com o meio de cultura

Enquanto a soluo est na autoclave, anote na parte de baixo das placas de Petri a identica-
o dos quadrantes, uma identicao do grupo e a data. Divida a parte de baixo da placa em quatro
partes iguais com uma caneta de retroprojetor (Figura 3.4). Cuide para no abrir a placa de Petri fora
do bico de Bunsen (zona de segurana).

Figura 3.4 Esquema de diviso das

placas com e sem antibitico

PARTE C Plaqueamento com micro-organismos e verificao do crescimento de colnias de

bactrias
Depois que o meio de cultura foi autoclavado, espere que ele esfrie (at que consiga encostar
a garrafa no antebrao). Enquanto isso, acenda o bico de Bunsen: a partir deste ponto, toda manipu-
lao dever ser realizada em zona de segurana.

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BASE EXPERIMENTAL DAS CINCIAS NATURAIS
 Verta todo o meio da garrafa de vidro em um tubo Falcon e adicione 15 mL em uma das placas
de Petri, deixando-a semiaberta. Aos outros 15 mL restantes do tubo Falcon, adicione o antibitico.
Misture com cuidado e verta o meio com antibitico na placa de Petri determinada, deixando-a se-
miaberta. Espere o meio das duas placas de Petri solidicar por completo.
Sempre perto da chama, faa os testes de maneira que, nos quadrantes Controle n 1 e Con-
trole n 3, no seja esfregado nada. J nos quadrantes Controle n 2 e Controle n 4, passe o coto-
nete que foi previamente esfregado em uma cultura de bactria (neste caso, Escherichia coli).
Ainda na zona de segurana, passe o cotonete que foi previamente esfregado em uma super-
fcie ou soluo que voc queira testar se h micro-organismos nos quadrantes Teste n 1 e Teste
n 2 nos dois meios de cultura (com ou sem antibitico).
Quando terminar, feche as placas de Petri e coloque-as de cabea para baixo na estufa a 37C
para crescimento durante duas noites. Aps a incubao das placas na estufa, verique se houve
crescimento de algum micro-organismo por quatro dias. Registre a evoluo fotogracamente.

Figura 3.5 Fotografias das placas

de Petri assim que preparadas

Figura 3.6 Fotografias das placas

de Petri no primeiro dia

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MICROBIOLOGIA E SADE
 Figura 3.7 Fotografias das placas de Petri no segundo dia

Figura 3.8 Fotografias das placas de Petri no terceiro dia

Figura 3.9 Fotografias das placas de Petri no quarto dia

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BASE EXPERIMENTAL DAS CINCIAS NATURAIS
 Referncias

BLACK, J. G. Microbiology: principles and applications. 3. ed. New Jersey: Prentice-Hall, 1996.

CARLILE, M. J.; WATKINSON, S. C. The fungi. London: Academic Press: Hartcourt Brace & Company Pub-
lishers, 1997.

VERMELHO, A. B. et al. Prticas de microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006.

Questionrio
1. Qual a funo dos controles n 1, 2, 3 e 4?

2. Voc esperaria que houvesse crescimento de micro-organismos nos controles n 1 a 4? Por qu?

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3. No seu experimento, houve crescimento de algum micro-organismo nos controles n 1 a 4? E nos
testes? Justique a partir das imagens.

4. Quais foram os controles negativo e positivo neste experimento? Por qu?

5. Onde foram coletados Teste 1 e Teste 2? O que motivou a escolha?

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6. Aponte nas imagens o crescimento das colnias. possvel realizar uma anlise quantitativa?

7. A partir da observao do crescimento (ou no) de micro-organismos em seus meios de cultura,

quais mtodos de assepsia e desinfeco voc utilizaria para tornar a soluo estudada um ambien-
te estril? E em relao aos procedimentos envolvidos nos experimentos como um todo?

8. Diante dos resultados obtidos, voc julga necessrio repetir o experimento para obter uma con-
cluso mais denitiva? Se voc fosse repetir o experimento, o que voc faria de forma diferente?
(no ser necessrio repetir o experimento de fato)

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