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    Mantenimiento de Cepario de Microbiologia

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    $A MIC 0B 101061) CONSERVACION Y MANTENIMIENTO DE CEPAS MICROBIANAS CON FINES DOCENTES E INVESTIGATIVOS ‘Martin Alonso Bayona R. MSc.* INTRODUCCION medida que la biotecnologia avanza en todos los. ‘esquemas de la innovacién moderna, la sociedad lebe adaptarse alas caracteristicas partculares de sta, En el desarrollo de cualquier trabajo que implique el uso de los microorganismos, es deseable contar con una fuente pura y viable del agente de interés, va que es fre- cuente afrontar problemas de pureza y viabilidad de las cepas.asi como de pérdida de microorganismos por el sim- pile hecho de no contar con copias adicionales del mismo. Uno de os problemas inherentesal mantenimiento y pre servacién de microorganismos es el fenémeno de muta- ci6n espontanea que ocurre en los cultivos. Con transfe- rencias repetidas, su viabilidad dectece gradualmente cuan- do es comparada con la cepa made y finalmente lega a una continua eimeversible degeneracion, es por esto que al abordar el tema del mantenimiento y conservacion de microorganismos se deben desarrolla técnicas especticas para su preservacién con el fin de mantenerias puras, via- bles, sin variaciones y mutaciones, que se asemejen en fo posible a su aislamiento inicial. Una de las condiciones para asequrar el éxito de la preservacién de las cepas es la utlizacion del medio de mantenimiento 0 soporte adecua- do y la edad del cutivo que se va a preservar. Dentro de los objetivos que se deben alcanzar para conservar correc tamente los microorganismos en los laboratorios de mi- crobiolog{a se tienen: que el cultivo a conservar sea puro, evitando asf que se produzcan contaminaciones durante «el proceso de preservacién; que durante el tiempo de con- servacién sobrevivan al menos el 70-80% de las células, y “Profesor Facultad de Clenelas de la Salud. Programa de Medicina (Corporacén Universtara de Cencias Apbcadasy Ambientales UDCA Labor Ata Ao 20H, $5 Novi de 2008, por titimo que estas eélulas permaneacan genéticamente estables. Los dos primeros objetivos no son difcles de conseguir cuando se conoce y se tiene experiencia en la técnica microbiolbgica que seré empleada, pero el tercero puede presentar dficultades, siendo este el motivo por el cual existen varios métodos de conservacién, y ninguno de ellos es de empleo general. A continuacion se abordara el tera en mencién haciendo énfasis en la historia y los, bbeneficios de los diferentes métodos empleados con fines docentes e investigativos para la conservacién de los rmieroorganismos. ANTECEDENTES: Lacexplotacién de los microorganismos por el hombre es un hecho bien conocido desde hace muchos afios. El mantenimiento de cultivos y las técnicas de preservacién han sido objeto de interés cientifco desde 1930, Numero- sas colecciones privadas se establecieron en Inglaterra, Ho- landa, Alemania, Japén y Estados Unidos. Estas colec- ciones se fueron reemplazando por colecciones piiblicas. En Holanda por ejemplo, a Asociacién Internacional Bo- ténica fundé un Instituto que recolect6 y almacené nue- vas especies de hongos para investigacion y en 1906, se publicé un catélago con las cepas recolectadas. Este fue el primer paso para el establecimiento del Central Bureau ‘voor Schimmelcultures (CBS), una de las colecciones mas grandes de hongos del mundo. En 1899, cuando se orga- niz6 la Sociedad Americana de Bacteriologia, se propuso luna coleccién en el museo nacional histérico de Nueva York. Este fue el predecesor de la Coleccién Americana de tipos de cultives (ATCC- American Type Culture Colecction) en 1928, la cual hoy dia es una de las més grandes co- lecciones en el mundo. En Japén, los microorganismos 35 caracterzacos eran originalmente mantenidos en las uni- versidades, Institutes de investigacién y en compatilas privadas. Pero en 1944, por tequerimiento de Cabinet e industrias quimicas Takeda Lida., se fund6 el Instituto para fermentacién aérea, para colactar,almacenar y dis tribuir microorganismos tiles para investigacién, produc ci6n de combustibles, drogas y alimentos. El nombre del Instituto cambis a Instituto para fermentacién, Osaka (IFO) spués de la segunda guerra mundialy hy dia es una de las colecciones més grandes de Japs. Las diferentes cepas de microorganisms que deben ser almacenadas por largos periodos, y que necesitan ser uitizadas repetidamente para investigacién ylo produccion, deben ser cultivos puros los cuales estarén propensos @ rmutaciones esponténeas. Un cepario institucional se hace necesario e imprescin- _ dible puesto que establece un valor de referencia para di- ‘verss pos de estudio dentro de una comunidad universi- taria con fines docentes, investigativos y de extensién. Planteamiento del problema Elhecho de poder contar con tuna coleccién microbiana, dle dptima calidad realza la importancia de este aspecto puesto que favorece a la comunidad universitaria, permi- tiendo obtener una infraestructura adecuada con el fin de ofrecer diverzos servicios para investigadores y docentes de diferentes campos de la salud. Millones de cepas han sido estudiadas en diversos gra- dos de profundidad dentro de programas de investigacin tanto basica como aplicada. Dichos programas, practica- dos de! mismo modo en estructuras académicas como industiales han enriquecido respectivamente tanto elco- nocimiento cientfico, como abierto nuevas posiblidades en un intento de explotacién de los microorganismos en bbeneficio del hombre. HUNTER -CEVERA (1996) Durante los primeros afios se empleé el caldo nutritive vy extracto de malta para el cultivo de bacterias y hongos respectivamente, Estos cultivos eran mantenidos en me- dios sélidos eaborados con agar o gelatina e incubado a temperatura ambiente en e! laboratorio con lo cual eran requeridos transferencias o subcultivos en apropiados in- tervalos de tiempo. Era posible que las actividades fsiold- Gicas iniciales cambiaran en respuesta a la frecuencia de transferencias y cuando aumentaba el crecimiento celu- lay. Se descubrié que la solucién a éste problema era mini- rmizar el crecimiento microbiano y suprimirlas actividades ‘metabélicas. Los primeros datos de almacenamiento fueron repor- tados por Will en 1907; varias especies de levaduras, re- ign cultivadas y resuspendidas en solucién de sacarosa al 10% sobrevivian en almacenamiento por 8 afos. Sin em- 36 bargo, sus actividades fisiolgicas se reducian significa tivamente yno se recobraban después de repetidas inocu- laciones en medio fresco. Hansen y Lund en 1939 reco- ‘mendaron la suspensién de levaduras en 10% de sacarosa yalmacenada en frio v en lugar oscuro, reportando que éste método era aplicable a hongos cuando crecian en agar nutrtivo inclinado, Otros ejemplos en los primeros afios del siglo XX son por ejemplo, Shackell en 1909 eva- |u6 métodos e secamiento por aspiracion en materiales vivos como virus dela rabia, Hammer en 1911 introdujo por primera vez métodos de secado en frio para aisla- mmiento de E. coli, S. aureus y Pseudomonas aeruginosa. Lumiere y Cherrotier en 1914 desarrollaron un método para almacenar Gonococcus en el cual el medio contenia suero superpuesto con parafina liquida. ONIONS, AHS (1994) En estudios realizados para entender la mutagénesis, durante el almacenamiento, en 1940, se investigé en la produccién de anticuempos, lo cual levé a ciertos cambios enlas técnicas de preservaci6n, Actuaimente las coleccio- nes microbianas han enfocado su interés mayoritariamente al érea de la salud con el fin de obtener un ntimero mayor de microorganismos que puedan a mediano y largo plazo coadyuvar en las actividades de los especialistas en ésta ‘rea, SMITH (1994) — México cuenta con un total de 10 colecciones, las cuales poseen las siguientes claves: CDBB-500, CENACUMI757, CFQ- 100, CISM95, ENCB 449, FLACC 584, INDRE 121, INIF 104, ITD 99, UNAM-48, —_ElReino Unido posee actualmente 25 colecciones ‘microbianas. = Lacoleccién de cultivos microbianos de interés bio- médico se encuentra integrada al Wordl Directory of Collections of Culture of Microorganisms dede 1981, con Ja clave UNAM-48 y forma parte de las 756 coleeciones reconocidas en el mundo. El objetivo principal dela preservacién de las cepas es mantenerlas puras,viables, sin variaciones y mutaciones, que se asemejen en lo posible a su aislamiento inical Una de las condiciones para asegurar el éxito de la preser- vacién de las cepas es la utiizacién del medio de almace- namiento 0 soporte adecuado y la edad del cultivo que se va preservar. La edad del cultivo es un aspecto a tener en cuenta en aquellos microorganismos que contienen plésmidos y DNA recombinante. Es importante el uso de luna codifcacién especifica y de la documentacién de la cepa con sus caracteristicas fenotipicas y fecha de aisla- miento. MALIK K. A. (1992). = Métodos de conservacién microbiano Los métodos de conservacién de las cepas esténdar de control de calidad, deben asegurar que las mismas man- LaortioAal Ao 20- Na. 38 -Novembe de 2008 tengan sus caracterstcastipicas y que puedan ser tepro- dducidas después. El medio empleado para su conserva- cin debe mantener un minimo de mutaciones. Las mu- taciones pueden evitarse permitiendo también el minimo ‘crecimiento del microorganismno y aportando 6piimas con- diciones ambientales para su sobrevivencia, can el menor nero de subcultives. DAY (1995) a, Cultivos Stock Estos representan el verdadero “Banco de cepas”. Son ‘mantenidos en un sistema cerrado de conservacién, mini mizando su actividad genética yfisiol6gica, Dentro de es- tos métodos se encuentran la lifilizacién y el ultraconge- lamiento. Liofiltzacién: Se realiza una suspensién de un cultive puro y joven cenleche estrio similar, y se coloca en tubos con rosca y ‘se siguen las instrucciones del aparato liofilizador, que puede ser tan senelo como una simple bomba de vacto, hasta tn sofisticado sistema. Durante este proceso se debe evi- tar que el cultivo se derrame dentro del aparato liofilizador formando aerosoles. Este sistema iene la ventaja de ser el ‘que permite la sobrevivencia por un mayor periodo de tiem- oy mayores faildades para el transporte de las cepa, Utracongelamient: Serealza empleando sustalos aioproteciores para set depositados a -45°C. También se puede utilizar la mocili- cacién de ultracongelamiento en nittégeno liquido, que consist en colocar en una ampolla especial dentro de un aparato espectficamente designado para el mantenimien- to de cepas en nitrégeno liquido. Las bacteras se preser- van porlargos periodos de tiempo. b. Cultivos Semistock Representa la conservacién de cultivos por un periodo intermedio entre el relativamente permanente cultivo en Stock y el culvo de cepas control para el trabajo diario Dentro de las técnicas que incluyen estos culivos se en- cuentran, CCongelamiento en congelador convencional: Mantienen una temperatura entre -10 a 25°C. Los culivos se preparan dela misma manera como en el caso de la ultacongelacién y son colocados en el congelador. Elmétodo permite la sobrevivencia de bacterias y evadu- ras en algunos casos por ios yen la mayorta de as veces poral menos de 6 a 12 meses. Cultivo en CTA: Se preparan tubos con rosca conteniendo Cisteina- Tripticasa-Soja agar: Se inocula el cultivo axénico, incubandose por 18 a 24 horas para obtener un creci- abort Atual- Ato 20- No. 36: Novienbe de 2003 miento moderado, se afloja la tapa y se mantiene a tem- pperatura ambiente o en refrigeracion, si es posible en la ‘oscuridad. Los microorganisms menos delicados sobre viven bien por un aio y los fastidiosos por 6 meses. Secado en discos con gelatina: Este método es conocido también como Stamp. Para locual se cortan pequefios circulos de papel enceradoy se colocan en una caja de petri. Se esteriiza en autoclave por 15 minutos a 15 bras de presi6n. Posteriormente se prepara una suspensién de caldo nutrtivo con 10% de gelatina en polvo y 0.25% de dcido ascérbico. Seguida- mente se suspende un cultivo axénico y joven en este me- dio para dejar en incubacién, Terminada la incubacién se coloca una suspensién de la colonia sobre el disco de pa- pel acerado estéril en una caja de petri. Con una pinza estéril, se transfere el disco a un desecador de vacio con- teniendo Penta6xido de fésforo, Una vez seco el disco, se introduce en un tubo estéril con tapa rosca y se coloca en el refrigerador. HUNTER —CEVERA ( 1996). Conservacién en medio de cutivo inctinado con aceite mineral Es un método especialmente utilizado para hongos, pero es ttl también para algunas bacterias. Enel caso de los hongos, se utiliza un cultivo joven y bien esporulado en tun medio de cultvo inclinado especial. Se cubre comple- tamente con aceite mineral estéril. Elaceite debe ser este- tligao a 15 libres de presion por 45 minutos, para asegu- rar su estetlidad absoluta. Si el método se va a emplear ppara conservar bacterias, se utiliza agar de cerebro cora- 26n o agar Mueller - Hinton suplementados con hemogio- bina al 2% en Isovitaléx al 1%. Los medios se sirven en tapa rosca. Se esterlizan y luego se les hace coagular en forma inclinada. Las bacterias son inoculadas en el me- die incubadas a 35°C por 24 horas, Luego las cepas son cubiertas con aceite mineral estéril, hasta Lem por encima el final del inclinado, Los cultivos son viables por aiios a temperatura ambiente. KIRSOP (1991) ‘Mantenimiento en tierra esti: Es utilizado inicialmente para hongos y bacterias esporuladas. La tierra se esterliza en autoclave en tubos con roscaa 15 libras de presién por 1 hora, Posteriormen- tese ealiza una suspensién fuerte del microorganismo jo- ven y se coloca en el tubo con tierra estéril. Se deja secar yy se coloca en el refrigerador. Cultivos de trabajo diario: LLos cultivos control para el trabajo diario, son una for- ma conveniente para realizar el control de calidad de prue- ‘bas de uso frecuente y que requieren una lectura compa- rativa al momento de su lectura. Tal es el caso de las pruebas de coagulasa y oxidasa, entre otras. Para este propésito se utiizan cultivos de 24 horas los cuales son ‘ransferidos diariamente. 37 ‘Manejo de bacterias resistentes: Se transfiere una colonia joven de un cultivo en stock © semistock y se transfiere a un tubo con agar nultitivo inclinado para luego ser neubado por un minimo de tiem- po tal que haya crecimiento. Se quarda en reftigeracién, Los cultivs para trabajo diario, son transferdos a otros tubos de agar inclinado cada mes por un intervalo de 6 meses. Después de este tiempo, se debe volver a hacer otro repique del cultivo stock. Hatt (1980) Bocteriasdelicadas: Estos microorganismos son preparados a partir del stock @ incubados por 24 horas en medios apropiados como agar chocolate en ambiente de CO2, para luego ser colo- cados en refrigeracién. Después de una serie de 6 transplantes consecutivos, se debe preparar otto cultivo ppara uso diario a partir de la cepa en stock. Bacterias anaerébicas: LLos cultivos para trabajo diatio de la mayoria de las bacterias anaerobias, pueden ser mantenidos en medio de came cocida o en Tioglicolato con 0.5% de carbonato de sodio adicionado después de esterlizar por autoclave. Los cultivos se incuban por 24 a 48 horas y se quardan a temperatura ambiente. JUARROS (1993). Hongos: Los cultivos de uso diario de hongos, son mantenidos cen tubos con agar Saboureaud o Czapeck, Los cultivos se incuban a temperatura ambiente hasta que haya creci- miento, y ocurra la esporulacién, para luego ser colocados ‘en efrigeracién. Los cultivos de trabajo deben ser transfe- ridos cada 2 meses. Pasado este tiempo se debe preparar ‘otro cultivo de trabajo a partir de la cepa en stock, Cultivos de trabajo comerciales Son preparados por casas comerciales utilizando ce- pas conocidas como la ATCC. Estas presentan buena es- tabilidad en refrigeraci6n por un afio. Como ejemplos se tienen Bact-Chek de Roche Diagnostics, bactrolDisk de Difco, entre otras Mantenimiento del CEPARIO Se debe tener especial cuidado en el mantenimiento del cepario, ya que el mismo constituye una ayuda impot- tante en la validacion de equipos, materiales, reactivos y habilidad del personal. Debe existir un programa met6di- code transferencia de cepas, archivo de cada uno de los caltivos con sus caracteristicas bioquimicas, sensibilidad a los antibidticos, origen de la cepa, método de identifica- cién, fecha de siembra y préximo repique. SMITH (1994). ‘CONCLUSIONES Lacleccién de los métodos de conservacién debe te~ ner en cuenta varios factores, seatin sea el objetivo de la 38 coleccién, asfpues una pequeifa coleccién docente difere dde aquellas que son depositarias nacionales. Si por el con- trario el objetivo es casificar taxondmicamente los cult- vos se precisan métodos que garanticen la estabilidad morfolégica de los microorganismos. Asf mismo una co- leccién de interés industrial debe hacer énfasis en los mé- todos que mantengan la establidad genética, — Losmétodos de conservacién a largo plazo son los mejores va que en ellos se detiene el crecimiento de las células microbianas. Asi se garantiza al maximo la estabi- lidad genética, evitando la aparicién de nuevas generacio- nes, Ain asi no se puede descartar algin cambio origina- do por el método preparatorio en si mismo. Los métodos dle conservacién pertenecientes a este grupo son: Congela-

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