Unidad IV

Biotecnologa Agrcola

4.1. Produccin industrial de inoculantes

4.1.1. Por qu es necesaria la inoculacin?

Cuando la planta carece de alguno de los nutrimentos esenciales en cantidades

necesarias para su crecimiento, la Ley del Mnimo, enunciada por Justo van Liebrig
y conocida como El principio de factores limitantes, entra en vigor. Este principio
afirma que el nivel de produccin de la cosecha no ser mayor que aquel permitido por
el ms limitante de los factores esenciales para el crecimiento de la planta.

En condiciones naturales, las plantas suelen asociarse con microorganismos para

asegurar una nutricin adecuada ya que normalmente las condiciones edficas limitan el
trnsito y disponibilidad de los nutrimentos. Es por ello que el manejo de la inoculacin
se hace necesario ya que generalmente se busca establecer la asociacin ms adecuada
que resuelva los problemas de nutricin vegetal en los cultivos, procurando obtener el
mximo rendimiento.

4.1.2. Inoculante

En trminos generales un inoculante esta constituido por el inculo, un vehculo,

soporte o sustrato, nutrimentos y un regulador de pH. La variacin en cada uno de los
componentes e incluso la presencia o ausencia depender del microorganismo utilizado
para la elaboracin del biopreparado.

Entre los microorganismos que pueden ser utilizados para la preparacin de un

inoculante destacan: Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Sinorhizobium,
Mesorhizobium, Allorhizobium, Azospirillum, Acetobacter, Pseudomonas, Bacillus,
Burkholderia, Frankia, hongos ectomicorrzicos y hongos micorrzicos arbusculares
entre otros.

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Existe una gran variedad de vehculos, soportes o sustratos para la elaboracin de
inoculantes que incluyen: medio nutritivo lquido, medio nutritivo semislido y slido,
turba neutralizada, vermiculita, agrolita, arena silica, tierra de diatomeas o mezclas de
diferentes soportes. El soporte puede ser empleado tanto en forma no estril como
estril; dependiendo del tipo de biopreparado que se pretenda elaborar.

La arena silica est constituida bsicamente de 99.5% de SiO2 , 0.3% de Al2O3 y 0.3%
de FeO3. Su peso especfico es de 2.65 y su punto de fusin es de 1 750C. La
vermiculita es una arcilla alumino silicatada y la agrolita es una roca volcnica vtrea,
producto de la perlita + agua de cristalizacin que se tritura y calienta a 1 200C,
expandindose aproximadamente veinte veces.

4.1.3. Datos de los inoculantes.

Todos los inoculantes o biopreoparados manejan una serie de datos de gran importancia
en la etiqueta del producto. Los datos incluyen: marca, direccin del fabricante,
microorganismo utilizado, cultivo al que se aplica, fecha de elaboracin, fecha de
caducidad, instrucciones de manejo, contraindicaciones, almacenamiento, aplicacin y
control de calidad expresado como nmero de microorganismos/ gramo de soporte,
gramos del microorganismo/ gramo de soporte, gramos de races infectadas/ gramo de
soporte, nmero de esporas/ gramo de soporte, etc.

4.1.4. Produccin de un inoculante para leguminosas.

Para elaborar un inoculante a nivel industrial es necesario hacer una seleccin estricta
tanto de la bacteria como del soporte. Las caractersticas ideales de la bacteria tales
como: efectividad, infectividad y competitividad debieron ser probadas a nivel de
laboratorio, invernadero y preferentemente de vivero. Trabajar con bacterias que fueron
aisladas y seleccionadas para un determinado ecosistema productivo es lo ms
recomendable ya que introducir un nuevo microorganismo implica una fase de
aclimatacin. La seleccin del soporte, que rena las caractersticas necesarias para
mantener viable el nmero de microorganismos recomendados para que el inoculante
tenga un papel exitoso en el campo es fundamental.

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La tecnologa de produccin contempla la unidad de acondicionamiento de la turba
(soporte), la unidad de multiplicacin de los rizobios y la unidad de fabricacin y
conservacin del inoculante.

La unidad de acondicionamiento de la turba maneja varias etapas en el proceso. La

primera se enfoca a la extraccin y clasificacin de la turba. En la segunda, la turba es
secada en hornos a 80-100 C y posteriormente clasificada, procurando que la humedad
residual est entre 6 y 10%. En la tercera etapa la turba es neutralizada agregando
CaCO3 llevando el pH a 6.5-7.0. En la cuarta etapa la turba se muele para obtener
partculas de 75 m. En la etapa cinco el soporte es envasado en bolsas de plstico para
una determinada capacidad (100-120g), un determinado tamao (12X20 cm) y de un
espesor particular (50 m). El paso siguiente es esterilizar el material envasado usando
rayos gama (4-6 Mrads) o autoclave (4 horas a 121 C). Finalmente la turba seca,
molida, envasada y esterilizada se conserva en un lugar apropiado hasta su uso.

Extraccin y acondicionamiento del soporte.

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La unidad que multiplica los rizobios, maneja un estricto control de pureza de la cepa
que se va a propagar a gran escala. El primer paso es preparar el inculo o Starter. A
partir de un cultivo madre, se hace una transferencia a un tubo de agar inclinado de
medio ELMA, tambin conocido como YEM o M-79. El tubo se deja incubar de 3 a 5
das si es un Rhizobium y hasta 8 das si es un Bradyrhizobium. Una vez que se tiene
crecimiento, ste se resuspende en 10 ml de suero fisiolgico estril y se utiliza ste
para inocular 500 ml de medio de cultivo. El cultivo se realiza en agitacin a 28-30 C
durante 3 a 5 das, logrndose una concentracin final de 5X109 ufc/ml.

Multiplicacin de los rizobios

En la segunda etapa se inocula el fermentador procurando mantener una relacin del

inculo de 1%. Para rizobios de crecimiento lento se recomienda usar la formulacin de
Lopreto y colaboradores de 1972 y modificada por lvarez y colaboradores cuya
composicin es la siguiente: K2PO4, 1g/l; MgSO4 . 7H2O, 0.15 g/l; CaCl2, 0.1 g/l; KNO3,
0.7 g/l; (NH4)2HPO4, 0.3 g/l; MnSO4 . H2O, 0.005 g/l y FeCl3, 0.005 g/l. En este medio
se utiliza glicerol como fuente carbono a una concentracin de 10 ml/l, agua de levadura
100 ml/l y agua destilada. El pH se ajusta a 6.8-7.2 con NaOH y HCl, el medio se

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esteriliza a 120 C durante 60 minutos para el fermentador y 20 minutos para los
cultivos iniciadores.

Si el microorganismo es un rizobio de crecimiento rpido, se recomienda el medio de

Vincent (1975), cuya composicin es la siguiente: K 2HPO4, 0.5 g/l; MgSO4 . 7H2O, 0.2
g/l y NaCl, 0.1 g/l. Este medio utiliza sacarosa como fuente de carbono en una
concentracin de 10 g/l, agua de levadura 100 ml/l y agua destilada para completar el
litro. El pH se ajusta entre 6.8 y 7.2 con NaOH y HCl.

El fermentador industrial es de acero inoxidable con capacidad de 1000 a 2000 litros

equipado con un sistema de aireacin adecuado y aberturas para inoculacin y toma de
muestra. El volumen til del fermentador es de aproximadamente 2/3. El fermentador
tiene 4 filtros. Uno para la entrada de aire filtrado conectado a un difusor, el otro para la
salida de aire remanente, uno ms para inocular el medio con el cultivo starter y el
ltimo para toma de muestras y descarga del tanque. Se recomienda que el fondo del
tanque sea convexo para facilitar la descarga total y limpieza del mismo. El rea donde
se encuentra el fermentador debe mantenerse a temperatura controlada entre 28-30 C.
El suministro de aire para el proceso se mantiene a travs de un compresor que se
conecta al fermentador con una tubera que tiene acoplada un sistema de filtros. El flujo
de aire recomendado es de 5.6 l/s. El compresor de aire debe de ser de 2 HP, no
lubricado, de 1.4 Kg/cm2.

Unidad de fermentacin.

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El aire que sale del fermentador se barbota en una solucin de H 2SO4, que absorbe
eficazmente el vapor de agua y evita la contaminacin del ambiente.

En la unidad de fabricacin y conservacin del inoculante, se inocula aspticamente el

soporte con el caldo de cultivo, inmediatamente el inoculante debe de madurar a 28 C
por una semana. Despus de la maduracin se recomienda conservar el inoculante a 4
C.

La etapa de inoculacin es inmediata a la etapa de multiplicacin de los rizobios, no

pudindose desfasar una de otra. La supervivencia de los rizobios en el soporte est
ntimamente ligada a la humedad final del inoculante, la cual se regula ajustando la
relacin soporte-caldo. Para preparar inoculantes con turba no estril se agrega la
proporcin requerida de caldo de cultivo a mxima concentracin (conteos mayores a
109 ufc/ml), ya que la multiplicacin de los rizobios es mnima y la fase de senescencia
comienza en un tiempo relativamente corto.

En un inoculante preparado con turba estril, la concentracin de rizobios en el caldo es

un factor secundario, ya que normalmente ocurre una segunda multiplicacin de los
rizobios en el soporte luego de la impregnacin. Esta multiplicacin puede ser de ms
de una unidad logartmica. Consecuentemente un inoculante a base de turba estril
podra prepararse inyectando el volumen total requerido del caldo diluido a una alcuota
del caldo concentrado suficiente para alcanzar la humedad final requerida.

En las presentaciones comerciales se manejan 1X109 ufc/ml si el inoculante es lquido y

1X109 ufc/g si la presentacin es en slido (polvo).

4.1.5 Produccin de un inoculante para rboles de inters forestal con hongos

ectomicorrzicos.

La produccin de inoculantes de hongos ectomicorrzicos debe de considerar el tipo de

propgulo que se emplear para la elaboracin del biopreparado. Si se desea utilizar
esporas provenientes de carpforos colectados en el bosque, primero se deben de elegir
las tcnicas ms adecuadas de transporte, secado y almacenamiento del material
biolgico para evitar la prdida de la viabilidad en las esporas. Una vez que los

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carpforos se encuentran listos para ser disectados, se extraen las esporas y se
almacenan en bolsas de polipapel, polietileno, polipropileno o en viales de vidrio a
temperatura de refrigeracin (4 C) hasta su uso en la elaboracin del inoculante.

Es recomendable que para facilitar el manejo de esporas, stas se mezclen con un

soporte (tierra de diatomeas o turba con pH ajustado a 5.0-6.0) que permita la adsorcin
de las mismas. Debe de ajustarse el nmero de esporas por unidad de sustrato. En los
inoculantes comerciales se manejan valores de 1X109 esporas/g de soporte.

Las esporas deben ser separadas del resto de tejido del carpforo a travs de un sistema
de cribado. Una vez separadas las esporas pueden ser usadas directamente sin ningn
tratamiento previo cuando se va a utilizar un soporte no estril. Si la intencin es
obtener un inoculante con soporte estril es recomendable esterilizar el sustrato
previamente en autoclave a 15 lb por 30 minutos. Para este tipo de inoculantes es
recomendable dar un tratamiento de desinfeccin a las esporas del hongo
ectomicorrzico con una solucin de cloramina T al 2% por 5 a 10 minutos y/o con una
solucin acuosa de antibiticos que contiene Gentamicina al 1% y Estreptomicina al 2%
antes de hacer la mezcla con el soporte.

Si se maneja micelio para la elaboracin del inoculante, como en el caso de Pisolithus

tinctorius (Pt), se recomienda el cultivo en una mezcla de Vermiculita-Turba. El
iniciador se puede obtener haciendo un cultivo en medio MNM lquido con agitacin
orbital o magntica o bien en placas de agar MNM. Si el cultivo lquido se hace en
agitacin orbital el crecimiento se da en esfrulas y si el cultivo se hace con agitacin
magntica se obtiene un crecimiento difuso. En el caso del cultivo en placas de agar
MNM se obtienen discos miceliales que pueden ser usados para inocular la mezcla del
soporte con la siguiente formulacin: vermiculita = 840g, Turba neutralizada = 60g y
solucin de MNM = 600 ml., empacada en frascos conserveros o en bolsas de polipapel.

El medio de Meln y Norkrans Modificado (MNM) presenta la siguiente formulacin:

Extracto de malta, 3.0 g/l; D-glucosa, 10 g/l; (NH4)2HPO4, 0.25 g/l; KH2PO4, 0.50 g/l;
MgSO4 . 7H2O, 0.15 g/l; CaCl2, 0.05 g/l; FeCl3 (1% en solucin acuosa), 1.2 ml; NaCl,
0.03 g/l; Clohidrato de tiamina, 100 mg y agar bacteriolgico 18 g/l. El medio debe
esterilizarse a 15 lb, 121 C por 15 minutos.

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Cuando se inocula la mezcla de soportes en frascos conserveros o en bolsas se debe
incubar por lo menos 3 meses a 20-25 C o cuando sea evidente la colonizacin del
micelio en el soporte. Una ves que se tiene el crecimiento necesario el material es
lavado con agua destilada estril para eliminar los metabolitos y la solucin MNM
remanente. Se elimina el exceso de agua y se empaca en bolsas de polietileno o
polipapel, agregando los datos necesarios a la etiqueta del contenedor. El inoculante se
almacena a 5 C hasta su uso.

4.1.6 Produccin de un inoculante para plantas de inters agrcola y forestal con

hongos endomicorrzicos arbusculares.

Para obtener un inoculante de un hongo micorrzico arbuscular es necesario recordar

que estos hongos son bitrofos obligados. Hasta el momento no se han podido propagar
in vitro como otros hongos. Para la propagacin de estos hongos es necesaria la
participacin de plantas trampa o de races transgnicas de zanahoria. Esta ltima
opcin encarece el producto ya que los requerimientos para mantener un cultivo de
races transgnicas que permitan la propagacin del hongo micorrzico arbuscular son
muy caros. Por lo tanto con el fin de obtener un inoculante comercial que pueda
competir con productos similares se tiene que echar mano de plantas que son manejadas
en invernadero con estos propsitos tales como: poro, cebolla o algn tipo de pasto.

El iniciador puede obtenerse a partir de races previamente colonizadas, obtenidas por

una donacin o por la compra de un producto comercial. Otra forma de obtener un
cultivo iniciador es a travs de esporas previamente separadas y seleccionadas a partir
de una muestra de suelo; incluso la planta trampa puede ser utilizada como receptora del
hongo de inters para poder extraer el microorganismo del suelo. La separacin de las
esporas se realiza a travs del uso de tamices con aberturas de aproximadamente 44 a 75
m, lavando la muestra del suelo y aplicando el principio de flotacin de las esporas es
posible recuperar las esporas, clasificarlas e inocularlas a la planta trampa elegida. Otra
alternativa antes de inocular la planta trampa es hacer germinar la espora y ya
germinada ponerla en contacto con el sistema radical de la planta receptora.

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Una ves inoculada la planta receptora, es necesario monitorear la colonizacin del
sistema radical aproximadamente un mes despus de la inoculacin. Una vez verificada
la colonizacin, se recupera el sistema radical colonizado, se desinfecta
superficialmente con una solucin de cloramina T al 20% y enjuagada con agua
destilada estril. La raz se corta en fragmentos de aproximadamente 1 o 2 cm y se
utiliza como inculo para otras plantas. Este mecanismo se repite el nmero de veces
que sea necesario para obtener la cantidad de raz colonizada necesaria para el
inoculante.

El soporte utilizado para la propagacin del hongo en la planta puede ser suelo estril,
vermiculita, agrolita, arena estril o una mezcla de varios soportes. Si se utiliza suelo es
necesario conocer las caractersticas fsicas y qumicas del mismo as como la
disponibilidad de nitrgeno, fsforo y potasio. Recuerde que el nivel de fsforo
intercambiable es fundamental para el establecimiento de la asociacin. Si se utiliza un
soporte diferente al suelo es necesario agregar una solucin nutritiva para plantas con
bajo contenido de fsforo como los es la solucin nutritiva de Long-Ashton. Esta
solucin fue modificada por Hewitt en 1966 y est constituida de: KNO 3, 0.4 g/l; K2SO4,
0.35 g/l; Ca (NO3)2 . 4H2O, 0.9 g/l; NaH2PO4 . H2O, 02 g/l; MgSO4 . 7 H2O, 0.5 g/l;
MNSO4 . H2O, 0.023 g/l; CuSO4 . 5 H2O, 0.003 g/l; ZnSO4 . 7 H2O, 0.003 g/l; H3BO3,
0.03 g/l; NaCl, 0.05 g/l; (NH4)6Mo7O24 . 4 H2O, 8.8X10-5 g/l; EDTA-Na, 0.029 g/l y
FeSO4 . 7 H2O, 0.022 g/l. El pH final de la solucin debe ser de 4.5.

Una vez que se tiene suficiente raz colonizada, se cosecha y se desinfecta con
cloramina T al 20%. Se enjuaga con agua destilada estril y se cortan las races en
trozos de 2 cm de longitud. Se puede agregar como soporte agrolita. Es muy importante
manejar el contenido de humedad en el producto ya que un exceso puede propiciar que
el producto sea atacado por otros hongos que inicien la descomposicin de la raz y
merme la viabilidad del hongo micorrzico arbuscular. La mezcla (soporte y races
colonizadas) es envasada o empaquetada en bolsas de polietileno o polipropileno y se
almacenan a 5 C. Es necesario determinar la vida de anaquel de cualquier bioproducto
antes de comercializarse.

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4.1.7.- Control de calidad de inoculantes y biopreparados.

Introduccin

Gracias a los avances en el conocimiento de las interacciones entre los

microorganismos del suelo y las plantas, se ha podido llevar a cabo el manejo de los
mismos para la obtencin de inoculantes o biofertilizantes que permiten mejorar el
rendimiento en los cultivos, as como de biopreparados utilizados para el control
biolgico de plagas.

La generacin de la informacin que permiti un conocimiento cientfico del

ecosistema suelo vegetacin fue un paso crucial para la domesticacin de
microorganismos con fines biotecnolgicos en la agricultura y posteriormente se
extendi esto hacia el manejo de bosques

Actualmente, existen en el mercado nacional toda una gama de preparados

biolgicos destinados tanto a la produccin agrcola como forestal, los cuales han sido
elaborados tanto por compaas nacionales como por consorcios internacionales.

Compaas tales como: Plant Helth Care de Mxico, Probiomer, Monsanto,

Nitragin, CESAVEG, Ciba-Geigy Mexicana, Laboratorios Buckman y Biorize entre
otros, producen y/o distribuyen biopreparados destinados a la produccin de alimentos,
horticultura, floricultura, jardinera y forestera.

Los preparados biolgicos que se tienen en el mercado contemplan desde el

manejo de un solo microorganismo hasta la manipulacin de consorcios de
microorganismos y preparados hechos a base de productos de plantas y/o
microorganismos. Durante el proceso de produccin de biopreparados, las compaas
llevan un estricto control de calidad, desde la propagacin del microorganismo hasta la
obtencin del producto final que se expender a los posibles compradores.

Sin embargo, Cmo saber si el producto que se ofrece por una determinada
compaa rene las caractersticas que declara en la informacin de la etiqueta del
mismo?

En el terreno legal, existe una instancia federal que somete a escrutinio los
productos que estn disponibles para los consumidores. La Procuradura Federal del
Consumidor (PROFECO) hace pruebas de control de calidad a los diferentes productos
que el consumidor puede adquirir en el mercado y publica sus resultados a travs de su
rgano de difusin La Revista del Consumidor. Sin embargo, la PROFECO hasta donde
se sabe no cuenta con personal capacitado para evaluar los biopreparados que las
compaas ya mencionadas manejan en el mercado de consumo.

Es por ello que se hace necesario preparar personal altamente capacitado con las
tcnicas necesarias para evaluar estos productos ya que son consumidos tanto por el
sector gubernamental a travs de los programas de reforestacin (manejado por la
SEDENA) como por el sector privado a travs de los pequeos productores, asociacin
de productores y comuneros involucrados en la produccin agrcola o forestal.

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 Evaluar inoculantes y biopreparados exige contar con instalaciones
especializadas (laboratorios, invernaderos, viveros y campos experimentales), equipo
adecuado (cmaras de crecimiento para plantas con ambiente controlado, incubadoras,
campanas de flujo laminar, campanas de extraccin de humos, centrifugas, sistemas de
refrigeracin, hornos, sistemas de destilacin y desionizacin de agua, potencimetros,
cromatgrafos de gas, etc.) materiales, reactivos, medios de cultivo, soportes, semillas,
etc., y adems, contar con personal altamente capacitado en las tcnicas que permitan
realizar pruebas de control de calidad que den seguridad a la comercializacin, manejo
y aplicacin de dichos productos.

Los biofertilizantes o inoculantes son mezclas constituidas por un soporte para

los microorganismos que se desean utilizar, nutrimentos y un regulador de pH.

Existen diferentes tipos de soportes, sustratos o vehculos para los inoculantes.

El soporte puede ser desde el medio nutritivo lquido, el medio nutritivo semi-slido o
slido, turba neutralizada, vermiculita, agrolita, arena silica, tierra de diatomeas o una
mezcla de diferentes sustratos.

Entre los microorganismos utilizados para la elaboracin de inoculantes y

biopreparados destacan los rizobios (Bradyrhizobium, Rhizobium, Mesorhizobium y
Sinorhizobium), Azospirillum, Pseudomonas, Trichoderma harzianum, Bacillus
thuringiensis, Bacillus spp., Streptomyces spp., Gliocladium sp., hongos
ectomicorrzicos y hongos endomicorrzicos arbusculares.

El tipo de nutrimento que ser agregado al inoculante depender del

microorganismo a utilizar para la elaboracin del biopreparado. Generalmente los
nutrimentos deben permitir la supervivencia del microorganismo en el soporte por un
tiempo que asegure el xito del biofertilizante. La adicin de nutrimentos al soporte no
es obligatoria si estamos trabajando con esporas de hongos.

Otro componente importante que permite la supervivencia del microorganismo

en el inoculante es el regulador de pH, el cual puede ser un sistema de amortiguacin a
base de fosfatos o carbonato de calcio.

Generalmente todos los biopreparados comerciales muestran una serie de datos

importantes en su etiqueta. Entre los datos que usted puede encontrar destacan: nombre
del producto, marca, direccin del fabricante, microorganismo utilizado, cultivo al que
se aplica, fecha de elaboracin, fecha de caducidad, nmero de propgulos/unidad de
soporte, instrucciones de manejo, toxicidad, condiciones de almacenamiento y
transporte, contraindicaciones, lote, precauciones, advertencias y primeros auxilios entre
otros.

De los datos exhibidos en la etiqueta del biopreparado, algunos son muy

importantes para realizar pruebas de control de calidad. Conocer el tipo de
microorganismo utilizado para la elaboracin del inoculante, el tipo de planta al que se
aplica, la fecha de caducidad, el nmero de propgalos/unidad de soporte y las
condiciones de almacenamiento, permite hacer una buena seleccin del tipo de
evaluacin que se va a aplicar.

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 Tener conocimiento del tipo de propgulo que viene en el inoculante nos
permite elegir el medio de cultivo adecuado para intentar su aislamiento para verificar
su pureza y viabilidad, dos variables que tienen que ser estimadas en cualquier
biopreparado, cuando esto es factible. En este punto es necesario sealar que existen
inoculantes en donde el soporte o sustrato se esteriliz previamente antes de colocar el
microorganismo. Sin embargo existen inoculantes en donde el vehculo utilizado no se
esteriliza y por lo tanto en un aislamiento para verificar la pureza y viabilidad se deber
diferenciar entre las colonias del microorganismo de inters y la microbiota
acompaante.

Por lo anterior, podemos concluir que el control de calidad de un inoculante se

inicia a partir de la determinacin de la presencia y viabilidad del microorganismo de
inters in vitro. Sin embargo, existe otro dato importante que se seal anteriormente y
que se refiere al tipo de planta hospedero al que va dirigido. Esta informacin nos
permite probar el biopreparado con la planta a la que va dirigido en condiciones de:
cmara de crecimiento para plantas con ambiente controlado, invernadero o en parcelas
de produccin. Generalmente, en estos ensayos in vivo, se recomienda el uso del
nmero ms probable (NMP).

La fecha de caducidad es un dato que nos indica si la viabilidad del producto es

confiable para su aplicacin. Este dato junto con las condiciones de manejo, nos
permiten hacer una manipulacin adecuada del producto durante el proceso de
evaluacin.

El nmero de propgulos por unidad de soporte nos est indicando el nmero de

unidades biolgicas que debemos tener como mnimo antes de que se alcance la fecha
lmite para que el producto caduque. Es importante constatar este dato durante la
evaluacin para poder asegurar el xito en la aplicacin del producto.

Actualmente se manejan inoculantes para leguminosas que llevan cepas de

rizobios seleccionadas para una leguminosa particular. Tambin existen inoculantes
hechos a base de Azospirillum para inocular gramneas y en particular cereales. Estos
dos tipos de inoculantes favorecen el incremento en el rendimiento y la productividad
del cultivo al que se le aplica.

Otro producto que se est comercializando es el bioinsecticida orgnico

preparado con Bacillus thuringiensis, el cual controla larvas u orugas de lepidpteros
que afectan a la horticultura.

Tambin existen inoculantes con bacterias que favorecen el crecimiento vegetal,

tales como Bacillus y Pseudomonas, las cuales en ocasiones van mezcladas con
microorganismos que permiten prevenir enfermedades radicales tales como
Streptomyces, Trichoderma y Gliocladium.

Los inoculantes elaborados con hongos micorrzicos arbusculares y hongos

ectomicorrzicos estn ubicando su nicho dentro del mercado de consumo como
productos que pueden ser empleados tanto en agricultura como en forestera.

Otros biopreparados incluyen compuestos obtenidos a partir de plantas y de

microorganismos, como es el caso de un bioinsecticida extrado del rbol de Neem; el

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biofertilizante y agente humectante para terrenos compactados, obtenido de Yucca
schidigera; un regulador del crecimiento vegetal hecho a base cido giberlico,
obtenidos de Giberella fijikuroi; y un producto formulado con un grupo de compuestos
bioactivos denominado alomonas, derivado de extractos orgnicos de especies botnicas
aromticas, que funciona como repelente de insectos plaga y atrayente de especies
benficas en cultivos.

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 Control de calidad de un inoculante elaborado con Rhizobium

Los rizobios son bacilos Gram negativos, de 0.5 a 0.9 micrmetros por 1.2 a 3.0
micrmetros. Las clulas pueden encontrarse aisladas o en pares, generalmente son
mviles cuando son jvenes debido a la presencia de flagelos pertricos, polares y
subpolares. Los rizobios no forman endosporas, sin embargo, las clulas contienen
grnulos de cido poli--hidroxibutirato (PHB) que se tie de negro con el colorante
negro de Sudn y aparecen refringentes al microscopio de contraste de fases. Algunas
cepas poseen grnulos metacromticos de polifosfatos .

La mayora de las cepas producen abundantes polisacridos extracelulares

mucilaginosos, de composicin variable segn la cepa y el medio de cultivo.

El aspecto de las colonias depende del medio de cultivo y de la especie de rizobio. En

medio de extracto de levadura agar (ELMA), las cepas de crecimiento rpido
(Rhizobium) originan colonias de 1-5 mm despus de 3 a 5 das de incubacin, mientras
que las de crecimiento lento (Bradyrhizobium) no exceden 1 mm de dimetro despus
de 10 das de incubacin. La forma de las colonias va desde plana a convexa con bordes
enteros. El color puede ser blanco opaco, poco gomosas a blanco lechosa, translcidas,
con abundante cantidad de polisacridos.

Generalmente cuando Rhizobium se hace crecer en medio ELMA (Extracto de levadura

manitol) con azul de bromotimol produce metabolitos cidos, los cuales hacen que vire
el indicado de verde a amarillo. Bradyrhizobium produce metabolitos alcalinos que se
evidencian en el medio ELMA con azul de bromotimol, haciendo virar el indicador de
verde a azul.

Rhizobium sp

La calidad de un inoculante para leguminosas preparado con Rhizobium, puede ser

evaluado a travs del conteo de rizobios viables e infectivos que contiene. Tambin se
puede determinar su efectividad en la fijacin de nitrgeno.

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 Determinacin del nmero de clulas viables en un inoculante comercial por el
mtodo de plaqueo

Antes de iniciar el trabajo procure verificar la fecha de caducidad del inoculante (dato
marcado en la etiqueta del paquete). El inoculante debe contener por lo menos la dcima
parte del nmero original del inoculante recin preparado. No se recomienda almacenar
el inoculante por ms de 6 meses.

Despus de homogenizar el inoculante, se deben pesar 3 porciones de 1g de inoculante

para hacer diluciones decimales desde 10-1 hasta 10-8. La intencin de la evaluacin es
hacerla por triplicado. Una cuarta porcin de 10g se llevar a peso constante,
colocndola en el horno a 80 C.

Cada una de las tres porciones pesadas anteriormente se colocan separadamente en un

frasco de dilucin que contenga 90 ml de agua destilada estril. A estos tres frascos de
dilucin o matraces se les agita vigorosamente 50 veces. La dilucin de esta serie de
frascos corresponde a 10-2.

Una vez que la muestra se ha dispersado homogneamente, se toma una alcuota de 1 ml

y se transfiere a un segundo frasco de dilucin que contiene 90 ml de agua destilada
estril, a esta serie se le agita vigorosamente 10 veces. La dilucin final de esta serie
corresponde a 10-4.

Posteriormente, se utilizan tubos de dilucin que contienen 9 ml de agua destilada

estril y a los cuales se les agrega una alcuota de 1 ml, partiendo de la dilucin 10 -4 del
ltimo frasco de dilucin. Los tubos son agitados subiendo y bajando 6 veces la
suspensin. Se debe utilizar una pipeta o una punta de micropipeta diferente en cada
cepa o en cada dilucin.

Procedimiento de la dilucin seriada

15
Una vez que se tiene la serie de diluciones de 10 -1 hasta 10-8, se inocula la superficie del
medio de cultivo con alcuotas de 0.1 ml de las diluciones 10 -6, 10-7 y 10-8. El inculo
debe ser uniformemente distribuido en la superficie del medio de cultivo (agar-
levadura-manitol) auxilindose de una varilla de vidrio (adems del mtodo de
espatulado, puede aplicarse el mtodo de vaciado en placa). Se recomienda hacer tres
repeticiones por dilucin.

Las placas deben ser incubadas a 28 C, procurando hacer lecturas a los 2 5 das
despus, si est trabajando con rizobios de rpido crecimiento y de 5 a 8 das para los
inoculantes elaborados con rizobios de crecimiento lento. El uso de un contador de
colonias con lupa puede facilitar el reconocimiento de las colonias de rizobios, cuando
los inoculantes estn fabricados con turba no estril.

El intervalos de confianza para el conteo en placa va de 30 a 300 clulas/ ml. Si el

nmero promedio de colonias en la dilucin 10-7 es de 50 y el volumen de inculo fue
de 0.1 ml, entonces si partimos de 1g de inoculante tendremos:

(nmero de colonias) x (factor de dilucin) x (volumen del inculo)

(50 colonias) x (107) x (0.1 ml)

= 50 x 107 clulas por ml = 5 x 108 clulas/ml o g

Dado que la evaluacin se est realizando por triplicado, si en una de las cuentas el
nmero de rizobios es inferior a 10X106 bacterias/g de soporte, el inoculante se debe
considerar deficiente.

Una variante de la evaluacin anterior es el mtodo de la gota en placa de Miles y

Misra, tiene la ventaja de ser ms rpido y de requerir menos material. La tcnica
consiste en utilizar placas de agar levadura manitol con al menos 3 das de incubacin o
que hayan sido secadas a 37 C por 2 horas.

Para aplicar esta tcnica se requiere de una micropipeta de 20 l y un contador de

colonias con lupa integrada. En la base de las cajas Petri se hacen divisiones radiales
equidistantes para obtener 8 sectores. Puede utilizar 4 sectores para replicas de una
dilucin y 4 para otra, permitindose as dos diluciones por placa.

Se pueden utilizar las diluciones 10-7, 10-6 y 10-5, colocando 20 l de la dilucin en cada
4 sectores de la placa. Utilice 4 sectores para la siguiente dilucin. Espere que las gotas
se sequen por absorcin en el agar antes de invertir las cajas para incubarlas a 26 o a 28
C durante 4 5 das para los rizobios de crecimiento rpido y durante un lapso de hasta
10 das para los ms lentos.

El mtodo de conteo en placa por gota requiere ms prctica que los otros mtodos. Los
resultados pueden no ser iguales a los mtodos de espatulado y de inclusin en placa en
el primer intento. Se recomienda practicar la colocacin de los 20 l, utilizando agua
antes de utilizar el cultivo o el inoculante. Un nmero menor de colonias por gota
requiere de ms gotas para que el conteo tenga la misma precisin estadstica que los
otros mtodos.

16
Se recomienda hacer observaciones diarias en las placas, para vigilar la aparicin de las
colonias. El conteo se realiza en las reas en donde las colonias estn claramente
diferenciadas (no confluentes) con la ayuda de un contador de colonias. Se recomienda
que el intervalo de conteo sea de 10 a 30 colonias por gota.

Para calcular el nmero de clulas por mililitro, se divide 1 ml entre 20 l (0.02ml) y se

multiplica esto por el factor de dilucin y el nmero de colonias por gota. Por ejemplo,
si el nmero promedio de colonias por gota es 30 a una dilucin de 10 -5, el nmero de
clulas viables ser:

1/0.02 x 30 x 105 = 1 500 x 105 = 1.5x108UFC/ml

Se puede comparar la cuenta viable y la cuenta total (conteo en cmara de Petroff-

Hausser) y calcular el porcentaje de viabilidad en un cultivo original.

Es necesario mantener en la mente que el conteo en placa es valioso slo para contar los
rizobios viables en cultivo puro. No existe un medio selectivo que permita nicamente
el crecimiento de Rhizobium. Por lo tanto, es muy difcil cuantificar Rhizobium en
suelo. Otra limitante del mtodo de plaqueo es que no podemos distinguir entre las
cepas o las especies de rizobios ya que las caractersticas culturales son similares en el
medio de agar levadura manitol. Se recomienda utilizar el mtodo de infeccin en planta
cuando se requiera cuantificas la presencia de clulas viables de un rizobio particular en
materiales o soportes no estriles como los inoculantes.

Colonias de Rhizobium sp., utilizando el mtodo de gota en placa

17
Conteo de rizobios por el mtodo de infeccin en planta.

El conteo de la infeccin en planta, que tambin se le conoce como conteo del nmero
ms probable, se utiliza para determinar el nmero de rizobios viables en la presencia de
otros microorganismos. Este mtodo indirecto es usado para determinar la calidad de un
inoculante, cuando ste ha sido preparado con un soporte no-estril.

Tipos de contenedores para el ensayo.

Entre los contenedores que se pueden utilizar para hacer esta evaluacin destacan los
tubos de crecimiento, macetas, jarras de Leonard y bolsas de crecimiento. Estas ltimas
estn hechas de polipropileno (16X18 cm) con papel estraza en su interior. Son
susceptibles a la contaminacin introducida por el aire y los insectos, adems no tienen
una proteccin contra el calor radiante. Por lo tanto se recomienda su manejo en
cmaras o cuartos de crecimiento con ambiente controlado. Al igual que con los tubos
de crecimiento, las plantas no pueden crecer hasta su madurez en un sistema como ste.

Las jarras de Leonard y los tubos de crecimiento son utilizados frecuentemente para el
conteo por el nmero ms probable (NMP). Las jarras de Leonard son unidades de
crecimiento para leguminosas de semillas grandes y son manejadas preferentemente en
el invernadero. Los tubos de crecimiento son usados en solarios y cmaras de
crecimiento, donde el espacio es limitado. Generalmente se utiliza un medio nutritivo
para plantas al cual se le elimina la fuente de nitrgeno (Medio de Jensen), agregndole
agar bacteriolgico para obtener un soporte slido para la planta. El uso de los tubos de
crecimiento nos permite ahorrar espacio y trabajo.

Si va a utilizar bolsas de crecimiento, se recomienda colocar 30 ml de solucin nutritiva

libre de nitrgeno mineral (Broughton y Dillworth, 1970) en cada bolsa de crecimiento.
Si las bolsas de crecimiento no vienen estriles y usted sospecha de una posible
contaminacin, puede esterilizarlas despus de agregar la solucin nutritiva para
plantas.

Colocacin de los germinados en las bolsas de crecimiento.

Se seleccionan 100 semillas, de la leguminosa a probar, que presenten un tamao

uniforme se desinfectan superficialmente y se hacen germinar. Verifique si la viabilidad
es alta (entre 95 y 100%). Si la viabilidad es baja, utilice ms semillas.

Seleccione 60 semillas bien germinadas que tengan tamao similar y una longitud de
raz de 1-1.5 cm. En condiciones aspticas se transfieren los germinados, colocndolos
en el doblez del papel.

Para evitar que la raz crezca hacia fuera de la bolsa se debe hacer un agujero en el papel
para que la raz pase a travs de l. El agujero puede hacerse utilizando un aguja de
diseccin o un bistur estril cuando el papel est hmedo.

Cuando las plantas alcanzan los 5 7 das de edad son seleccionadas, desechndose las
que presenten crecimiento pobre. Se deben seleccionar 50 plantas que estn saludables.
Se requieren 40 bolsas para hacer el conteo de las diluciones de 10-1 a 10-10 en

18
cuadruplicado mas una bolsa control en cada grupo de cuatro. Es por ello que requiere
de 50 unidades experimentales.

Inoculacin para el conteo del NMP.

Prepare las diluciones del inoculante transfiriendo el contenido de la bolsa

(aproximadamente 100g) en una botella o matraz Erlenmeyer con tapa de rosca
conteniendo 900 ml de agua destilada estril. Vaci el contenido de la bolsa del
inoculante cortando en una esquina de la misma. Agite vigorosamente la botella por 10
minutos. La dilucin quedar a 10-1. Las siguientes diluciones (10-2-10-10) las obtendr
transfiriendo alcuotas de 100 ml a botellas que contienen 900 ml de agua destilada
estril. Para obtener la segunda dilucin agite vigorosamente el frasco por cinco
minutos y para las diluciones restantes agite por tres minutos.

Si se quiere hacer conteo en placa, utilice las diluciones 10 -5, 10-6 y 10-7. El mtodo de
la gota en la placa puede ser utilizado para inoculantes en donde el soporte (turba) se
esteriliz. Las placas de agar levadura manitol se utilizarn por cuadruplicado y deben
de contener rojo congo.

Los inoculantes que se prepararon con un soporte no estril deben ser plaqueados por el
mtodo del espatulado en placas de agar levadura manitol conteniendo un funguicida
como el verde brillante en una concentracin de 1.26 p.p.m., o pentacloronitrobenceno
(PCNB) a una concentracin de 0.5 g de PCNB en 100 ml de acetona mas una gota de
Tween 80, por cada 400 ml de medio. Las placas se manejan por duplicado y se sugiere
incluir una placa de agar levadura manitol que contenga rojo congo por cada dilucin.
La incubacin se hace a 25-30 C por 5 a 8 das.

Para el conteo por el nmero mas probable, se toma 1 ml de cada disolucin (10 -1-10-10)
para cada una de las cuatro replicas en cada grupo. Empiece tomando la alcuota de la
dilucin ms alta y proceda con las menos diluidas en forma progresiva, utilizando la
misma pipeta.

Se deben hacer observaciones peridicas y agregar la solucin nutritiva cuando sea

necesario. La nodulacin puede hacerse evidente despus de la segunda semana. Haga
las observaciones finales despus de la cuarta o quinta semana y anote presencia o
ausencia de ndulos.

Determinacin del nmero ms probable (NMP).

Para cada grupo de plantas se debe llevar un registro de la dilucin utilizada y del
resultado de nodulacin. El nmero de ndulos por planta no participa en el clculo del
NMP. Si las replicas son por cuadruplicado, la lectura debe ser 4, 3, 2, 1 0 unidades
noduladas. La dilucin mas alta no debe mostrar nodulacin en ninguna de las replicas,
indicando esto la ausencia del rizobio.

19
Resultados obtenidos de un inoculante para soya preparado con turba no estril

Dilucin Nodulacin Nmero total de unidades

(+) o (-) noduladas
I II III IV
-1
10 + + + + 4
10-2 + + + + 4
10-3 + + + + 4
10-4 + - + + 3
10-5 - - + + 2
10-6 + - + - 2
10-7 - - + - 1
10-8 + - - - 1
10-9 - - - - 0
10-10 - - - - 0
_____
21

A = nmero de diluciones usadas A = 10

n = nmero de replicas utilizadas n=4
s = pasos de dilucin usados s = 10

Nmero total de unidades noduladas = 21

Se debe buscar el nmero 21 en la tabla A.10 (calculada para 10 diluciones) en la

columna donde n = 4

Ahora ubique el nmero probable (m) en la interseccin entre la columna donde s

= 10 y el rengln ocupado por el nmero 21.

El valor de m = 3.1X104

Enseguida se debe calcular el NMP a partir del valor de m utilizando la siguiente

frmula:

x = (m) (d) / v

donde: x = NMP
m = nmero probable de la tabla de Fisher y Yates modificada en
1970
d = la menor dilucin (primera unidad)
v = volumen o alcuota aplicada a la planta

entonces:

x = (3.1X104) (101) / 1 = 3.1X105 rizobios/gramo de inoculante

20
 Nmero (m) de rizobios estimados para el conteo de infeccin en planta
(despus de Vincent, 1970)
Para 10 diluciones (A = 10)
Tubos positivos Pasos de dilucin (s)
n=4 n=2 s=10
40 20 7X108
39
38 19 6.9
37 3.4
36 18 1.8
35 1.0
34 17 5.0X107
33 3.1 s=8
32 16 1.7 7X106
31 1.0
30 15 5.8X106 6.9
29 3.1 3.4
28 14 1.7 1.8
27 1.0 1.0
26 13 5.8X105 5.9X105
25 3.1 3.1 s=6
24 12 1.7 1.7 7X104
23 1.0 1.0
22 11 5.8X104 5.8X104 6.9
21 3.1 3.1 3.4
20 10 1.7 1.7 1.8
19 1.0 1.0 1.0
18 09 5.8X103 5.8X103 5.9X103
17 3.1 3.1 3.1 s=4
16 08 1.7 1.7 1.7 7X102
15 1.0 1.0 1.0
14 07 5.8X102 5.8X102 5.8X102 6.9
13 3.1 3.1 3.1 3.4
12 06 1.7 1.7 1.7 1.8
11 1.0 1.0 1.0 1.0
10 05 5.8X101 5.8X101 5.8X101 5.9X101
09 3.1 3.1 3.1 3.1
08 04 1.7 1.7 1.7 1.7
07 1.0 1.0 1.0 1.0
06 03 5.8X1 5.8X1 5.8X1 5.8X1
05 3.1 3.1 3.1 3.1
04 02 1.7 1.7 1.7 1.7
03 1.0 1.0 1.0 1.0
02 01 0.6 0.6 0.6 0.6
01 0.6 0.6 0.6 0.6
00 00
Intervalo aproximado 109 107 105 103
Factor, 95%
Lmite de confianza + n=2 6.6
(x, /) n=4 3.8
Calculado de la tabla VIII2 de Fisher y Yates (1963)
Cochran; Biometrics, 1950, 6, 105.

21
Evaluacin de la calidad de un inoculante elaborado con un hongo micorrzico
(ecto o endomicorrzico arbscular)

La micorriza es una estructura radical producida por la asociacin simbitica mutualista

entre los pelos radicales y hongos especficos del suelo. Literalmente la palabra
micorriza significa hongo-raz. La mayora de las plantas forman micorriza y existen
descritas hasta el momento siete tipos diferentes, de los cuales las ms estudiadas son la
ectomicorriza (EM) y la endomicorriza arbuscular (MA).

La importancia del establecimiento de la asociacin micorrizica radica en que sta

influye directamente en el crecimiento y estado de salud de la planta. En la literatura
especializada acerca de este tema diversos beneficios para las plantas hospederas tales
como: incremento en la eficiencia de captacin de agua y nutrimentos, debido a que a
travs de esta estructura la planta incrementa su superficie de contacto y por lo tanto su
rea de exploracin en el suelo. Tambin se ha detectado un incremento en la
longevidad de los pelos radicales y tolerancia a condiciones adversas entre otras.

La ectomicorriza puede ser detectada a simple vista debido a que se producen

deformaciones en los pelos radicales, incrementndose considerablemente su tamao.
Se ha observado que el morfotipo de la ectomicorriza (tamao, forma y color) depende
de la planta y del hongo que se asocia con ella. En algunos casos, es factible que con la
experiencia acumulada, se pueda distinguir a travs del morfotipo de la ectomicorriza la
especie de hongo que la produce. Si se desea corroborar la presencia de la ectomicorriza
en las races de las plantas, se pueden hacer observaciones al microcopio esterescpico
o hacer cortes transversales muy finos de los pices micorrzicos con una navaja de
doble filo, teir con azul de algodn y observar al microscopio compuesto para
cerciorarnos de la presencia del manto fngico y de la red de Hartig, dos estructuras
diagnsticas de este tipo de micorriza.

pices ectomicorrzicos

Manto fngico

22
Para poder verificar la micorriza arbuscular, es necesario hidrolizar, teir (Tcnica de
Phillips y Hayman) y examinar las races al microscopio para constatar la presencia de
las estructuras diagnsticas que son los arbsculos y las vesculas. Estas ltimas para
aquellos hongos que las presentan.

Arbsculos y vesculas

La ectomicorriza puede ser encontrada en rboles de la familia Pinaceae (pino, abeto y

alerce), Fagaceae (roble y castao), Betulaceae (aile y abedul), Salicaceae (chopo),
Juglandaceae (nogal), Myrtaceae (eucalipto), entre otros. Los hongos que participan en
esta asociacin pertenecen a los ascomicetos y a los basidiomicetos.

La micorriza arbuscular est ampliamente distribuida en la mayora de las plantas

domesticadas para la agricultura tales como: gramneas (cereales y pastos), leguminosas
(frijol, soya, alfalfa, trbol, etc) y solanaceas (papa y jitomate). Tambin puede
encontrarse en la mayora de los rboles frutales como ctricos, perales, manzanos, parra
y almendros; en muchos rboles de inters forestal como el arce, caoba y liquidambar.
Esta micorriza se ha localizado en las hortalizas como cebolla, poro y espinaca, en las
plantas arvenses y en las cactceas. Los hongos que participan en este tipo de micorriza
pertenecen al orden glomales e incluyen las familias Gigasporaceae, Acaulosporaceae y
Glomaceae.

Debido a que en el mercado existen diferentes productos elaborados con estos

microorganismos, es necesario medir el potencial de inculo de dichos productos as
como la efectividad del hongo con el que est preparado.

El potencial de inoculo se refiere a la capacidad que tiene un inoculante para permitir el

establecimiento de la micorriza en el hospedero al que est dirigido. Dicha variable
puede determinarse cultivando plantas en presencia del inoculante intacto o diluido.
Este mtodo es preciso por que mide la capacidad infectiva de los propgulos fngicos.

Los propgulos fngicos en la ectomicorriza incluyen hifas, races micorrizadas,

esclerocios y esporas. En la endomicorriza arbuscular se incluyen esporas y races
micorrizadas.

La efectividad del hongo puede ser determinada a travs del efecto que tiene la
asociacin sobre su hospedero, midindose en funcin de la altura, dimetro, volumen,

23
peso fresco de la raz y del rea foliar, peso seco de la parte area y de la raz, contenido
de nitrgeno total o de fsforo, etc.

El potencial de inculo puede ser determinado por el clculo del nmero ms probable
(NMP). Los protocolos establecidos recomiendan utilizar diluciones cuaternarias (1/4)
del biopreparado. Para ello, se toman 85g del inoculante y se mezclan con 340g de suelo
previamente esterilizado (diluyente), para obtener la dilucin 4-1. De esta mezcla se
toman 85g y se mezclan con 340g de suelo diluyente estril para obtener la dilucin 4 -2,
y as sucesivamente hasta la dilucin 4-9. (ver el esquema de diluciones cuaternarias que
est mas abajo).

Si se trata de hacer conteo de propgulos ectomicorrzicos se recomienda utilizar como

diluyente suelo de bosque y si el conteo contempla propgulos de hongos
endomicorrzicos arbusculares, el diluyente a usar es suelo agrcola. El suelo puede ser
esterilizado en autoclave a 15 lb de presin por 20 minutos, procurando tres ciclos de
esterilizacin, con descansos de un da entre la primera y la segunda etapa de
esterilizacin. Despus de la tercera etapa de esterilizacin el suelo se deja reposar por
10 das.

Se recomienda utilizar de tres a cinco replicas por dilucin y manejando una planta por
contenedor, si se est utilizando almacigo. La humedad del suelo debe ser mantenida a
60% de la capacidad de campo.

Para facilitar la germinacin de la semilla elegida para el bioensayo, es necesario

verificar las recomendaciones de los expertos ya que en ocasiones antes de desinfectar
superficialmente la semilla es necesario aplicar un mtodo de escarificacin para
facilitar la hidratacin de la misma.

Los almcigos pueden ser mantenidos en invernadero o en cmara con ambiente

controlado, procurando manejar las condiciones de humedad relativa, fotoperiodo y
temperatura mas propicios para el establecimiento de la asociacin (se recomienda
verificar esto en la literatura). El bioensayo deber permanecer en estas condiciones de
4 a 8 semanas para biopreparados hechos con hongos micorrzicos arbusculares y de 2 a
4 meses para aquellos elaborados con hongos ectomicorrzicos.

Para verificar la micorrizacin, recuerde que si se trata de la ectomicorriza, puede

observarse sta a simple vista o bajo el microscopio estereoscpico. Puede teir un corte
transversal de la misma utilizando azul de algodn y observar al microscopio las
estructuras caractersticas. Si se trata de una infeccin con hongo micorrzico
arbuscular, las races deben procesarse segn el mtodo de Phillips y Hayman que se
describe a continuacin.

Procesamiento de races endomicorrizadas

1. Lavar las races con agua de la llave.

2. Elegir las raicillas ms jvenes y se cortan en trozos de 1 a 2cm.
3. Colocar las raicillas seleccionadas en viales y cubrirlas con solucin de KOH al 10%.
4. Hidrolizar en autoclave (a 15 lb de presin) o en bao mara de 4 a 10 minutos,
dependiendo de la lignificacin de las raicillas. Puede utilizar horno de microondas,

24
utilizando intervalos de 10 segundos hasta completar 30 segundos o 1 minuto. Las
raicillas de algunos rboles pueden requerir hidrlisis de hasta 1 hora.
5. Eliminar el KOH, lavar 3-5 veces con agua de la llave y neutralizar con una solucin
de HCl al 1% por 1 a 5 minutos.
6. Eliminar el cido y agregar Fucsina cida en lactoglicerol hasta cubrirlas.
7. Colocar en autoclave o utilizar la opcin que haya elegido de las arriba sugeridas
manteniendo las raicillas en tincin el tiempo equivalente al utilizado para la hidrlisis.
8. Sacar las raicillas del recipiente y montarlas entre portaobjetos y cubreobjetos.
9. Hacer la observacin en el microscopio compuesto utilizando los objetivos 10X y
40X.

Si existe un exceso de lignina en las muestras, agregue perxido de hidrgeno alcalino

(3 ml de NH4OH + 30 ml de H2O2 al 10% + 567 ml de agua destilada) el tiempo que sea
necesario para blanquear las races.

25
Diagrama de la preparacin de las diluciones cuaternarias para calcular el nmero mas
probable (NMP).

50g del inoculante en cada recipiente

350 g de inoculante

40

50g de la dilucin 4-1 85g de inoculante + 255g de

sustrato se mezclan en una
bolsa y se toman 340g para la
dilucin 4-1

4-1

50g de la dilucin 4-2 85g de la dilucin 4-1 + 255g de

sustrato se mezclan en una
bolsa y se toman 340g para la
dilucin 4-2

4-2

50g de la dilucin 4-3 85g de la dilucin 4-2 + 255g de

sustrato se mezclan en una
bolsa y se toman 340g para la
dilucin 4-3

4-3

85g de la dilucin 4-3 + 255g de

50g de la dilucin 4-4 sustrato se mezclan en una
bolsa y se toman 340g para la
dilucin 4-4

4-4

26
Diagrama de la preparacin de las diluciones cuaternarias para calcular el nmero mas
probable (NMP), continuacin.

50g de la dilucin 4-5

85g de la dilucin 4-4 + 255g de
sustrato se mezclan en una
bolsa y se toman 340g para la
dilucin 4-5

4-5

50g de la dilucin 4-6 85g de la dilucin 4-5 + 255g de

sustrato se mezclan en una
bolsa y se toman 340g para la
dilucin 4-6

4-6

50g de la dilucin 4-7 85g de la dilucin 4-6 + 255g de

sustrato se mezclan en una
bolsa y se toman 340g para la
dilucin 4-7

4-7

50g de la dilucin 4-8 85g de la dilucin 4-7 + 255g de

sustrato se mezclan en una
bolsa y se toman 340g para la
dilucin 4-8

4-8

85g de la dilucin 4-8 + 255g de

50g de la dilucin 4-9 sustrato se mezclan en una
bolsa y se toman 340g para la
dilucin 4-9

4-9

Residuo

27
Si consideramos que los resultados de la presencia de micorriza (ecto o endo) en las
plantas utilizadas fue como se muestra en la siguiente tabla entonces podremos calcular
el NMP.
Dilucin Repeticiones Suma de las replicas infectadas
I II III IV V

40 + + + + + 5
4-1 + + + + + 5
4-2 + + + + + 5
4-3 + + + + - 4
4-4 - + - + + 3
4-5 - + - - - 1
4-6 - - - - - 0
4-7 - - - - - 0
4-8 - - - - - 0
4-9 - - - - - 0
Nmero total de unidades infectadas: 23

Clculo del nmero ms probable, utilizando los datos de la tabla de arriba, en la

ecuacin siguiente.

log = x (log a) K

donde es el nmero de propgulos infectivos.

x es la media del nmero de contenedores con infeccin.

Por lo tanto

x = Nmero total de contenedores infectados / Nmero de replicas por dilucin

y=sx
donde:

y es requerido para definir el valor de K en la tabla de Fisher y Yates,

s es el nmero de los niveles de dilucin ( donde la dilucin 4 0 es el primer

nivel),

a es el factor de dilucin que en el caso de la dilucin cuaternaria es 4,

K es el valor localizado en la tabla VIII de Fisher y Yates (1970),

determinado por los valores de x o y.

Utilizando el ejemplo anterior: x = 23/5 = 4.6

y = 10 4.6 = 5.4
a=4
Como puede observarse los valores de x o y son mayores que los encontrados en la tabla
VIII de Fisher y Yates y por lo tanto K = 0.552.

28
Extracto de la tabla VIII de Fisher y Yates para diluciones cuaternarias y niveles (s) de
las diluciones de 6 mas; si x > 2.5 o alternativamente y > 3.5, el valor aplicado para K
= 0.552.
X Valor de K y Valor de K

0.4 0.707 3.5 0.550

0.6 0.618 3.0 0.548
0.8 0.577 2.5 0.545
1.0 0-559 2.0 0.537
1.5 0.555 1.5 0.522
2.0 0.553 1.0 0.488
2.5 0.552 0.8 0.464
0.6 0.431
0.4 0.375

log = x (log a) K

log = 4.6 (0.6021) 0.552 = 2.7697 0.552

log = 2.2177

= Anti log 2.2177 = 165.1

Como resultado tendremos que 50g de la muestra del inoculante contenan 165.1
propgulos fngicos. Si el inoculante tuviera originalmente 7% de humedad, 100g de
inoculante en peso seco contendr 355 propgulos fngicos infectivos.

Clculo de los lmites de confianza (s superior, i inferior a un lmite de confianza

del 95%):

log s,i = log S/n (z)

S = 0.201 para la dilucin cuaternaria = 0.4483

n = nmero de replicas por dilucin = 5
z = 1.645 para el 95% de probabilidad

Siguiendo el ejemplo: log s,i = log S/n (z)

log s,i = log 355 0.4483/5 (1.645)

log s,i = 2.5502 0.4483/2.2361 (1.645)

log s,i = 2.5502 0.3298

log s = 2.8800

log i = 2.2204

29
s = anti log 2.8800 = 758.6 propgulos infectivos por cada 100g en peso seco de
inoculante (lmite superior de confianza a 95% de probabilidad)

i = anti log 2.2204 = 166.1 propgulos infectivos por cada 100g en peso seco de
inoculante (lmite inferior de confianza a 95% de probabilidad).

Los valores calculados pueden ser expresados de la siguiente forma:

= 355 (166.1 758.6) propgulos infectivos/100g del inoculante seco.

(Ejemplo tomado de Sieverding, 1991).

Referencias Bibliogrficas

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Sieverding, E. 1991. Vesicular-Arbuscular Management in tropical ecosystems. D.G.T.Z.

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