PCR

MARCADORES MOLECULARES

Prof. Dr. Jos Luis da C. Silva

 Histrico da PCR
Kornberg (1960) Isolou e caracterizou a DNA polimerase. O isolamento
desta enzima possibilitou o desenvolvimento da sntese in vitro de cadeias
de DNA. Em poucos anos, o sequenciamento e a sntese de
oligonucleotdeos tornaram-se rotina nos laboratrios de pesquisa;

Karl Mullis (1983) Tcnica de PCR polymerase chain reaction

possibilita a amplificao in vitro de cidos nuclicos. O advento da PCR
acelerou os estudos de genomas de vrios organismos, pois possibilitou a
clonagem e o sequenciamento de DNA.

Karl Mullis (1987) Patenteou a tcnica e vendeu para a empresa

Hoffmann-La Roche em 1991.
Kary Mullis 1983 (Prmio Nobel 1993)
 Princpios da tcnica de PCR
Sntese enzimtica in vitro de cpias de DNA a
partir da seqncia alvo;
A especificidade dada pelo uso de primers
(iniciadores) especficos para o gene ou regio
do DNA de interesse;
A utilizao de dois primers delimitam o alvo e a
repetio dos ciclos da PCR d origem a bilhes
de cpias do alvo.
 Amplificao de seqncias pela
Reao em cadeia da polimerase (PCR)

Uma DNA polimerase resiste a temperatura, a

Taq polimerase, da bactria Thermus
aquaticus usada para catalisar o crescimento
a partir de primers de DNA. Pares de primers
em filamentos opostos so ampliados um em
cada direo ao outro. Aps o trmino da
replicao do segmento entre dois primer (um
ciclo), dois novos dplices so desnaturados
por aquecimento para gerar moldes
unifilamentares.
 Etapas da PCR

1) Desnaturao abertura da dupla fita do DNA (94

C/100 C)

2) Anelamento (hibridizao) dos primers em T C mais

baixa

3) Reao de polimerizao (sntese) da fita complementar

pela Taq DNA polimerase

Repetio por 30 a 40 ciclos animao

Reao de PCR em Termociclador
Eletroforese em gel de agarose visualizao
dos amplicons (fragmentos amplificados)
 Variaes da PCR
RT-PCR
Nested-PCR
PCR Multiplex
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Real time PCR ( PCR em tempo real)
 RT PCR
Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
RT PCR
RT PCR
Cycle threshold
Limiar da fase
exponencial
Fluorforos: absorvem e emitem luz em especfico
Taq-Man (Fluorforo + Quencher)
Taq-Man
Molecular Beacon : primers em estrutura secundria
Diferentes cores
 Marcadores moleculares
Marcador molecular todo e qualquer fentipo molecular
oriundo de um gene expresso (como em isoenzimas) ou de um
segmento especfico de DNA (expresso ou no).

Marcadores genticos so unidades herdveis

Quando o comportamento do marcador segue as leis de herana

de Mendel (quando analisado o seu comportamento em uma
populao segregante), ele pode adicionalmente ser definido
como um marcador gentico.
 A molcula de DNA sofre alteraes (mutaes). As mutaes
so mais toleradas quando acontecem em regies no-
codificantes, e as mutaes tornam-se estveis, sendo
transmitidas aos seus descentes.

Como muito grande a variao no nmero e no tipo de mutaes

estveis do DNA fenmeno conhecido como polimorfismo
gentico possvel identificar uma pessoa com base no seu
padro de polimorfismo.

Para reconhecer os locos (stios) onde ocorrem essas mutaes,

h diferentes tcnicas.

marcadores
cromossoma
 Origem do Polimorfismo Molecular

1. Mutaes pontuais - SNPs

A. ATCTCGTGATTCCTAGTCGTA
TAGAGCACTAAGGGATCAGCAT ex. Stio EcoRI

B. ATCTCGTGATTATAGTCGTA
TAGAGCACTAATATCAGCAT

2. Pequenas delees e/ou inseres - InDels

A. ATCTCGTCTAGTCGTA
TAGAGCAGATCAGCAT

B. ATCTCGT---GTCGTA
TAGAGCA---CAGCAT
Classificao de Marcadores
Moleculares
 Marcadores de DNA (moleculares)

Vantagens:
- No objeto de influncias ambientais;
- Potencialmente ilimitado em nmero;

Desvantagem:
Maior desvantagem a necessidade de tcnicas
e equipamentos mais complexos.
 Marcadores moleculares
Hibridao
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Minissatlites VNTR (Variable Number of Tandem Repeats)

Amplificao de DNA (Tcnica de PCR)

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions)
Microssatlites SSR (Simple Sequence Repeats)
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
- SNPs (Single Nucleotide Polymorphism)
 RFLP - Restriction Fragment Length
Polymorphism

RFLP examina diferena em tamanho de

fragmentos de restrio de DNA
especficos
Polimorfismo deriva de mutao pontual,
insero, deleo
Utiliza-se DNA celular total
Requer DNA puro de alto peso molecular
 Polimorfismo evidenciado pela fragmentao do DNA com

enzimas de restrio e observado pela hibridizao de sondas

marcadas de DNA (Southern blots) com radioatividade ou

compostos que desencadeiam uma reao luminescncia.

Para que o polimorfismo seja detectado, necessrio que as

seqncias de nucleotdeos nas fitas de DNA de dois ou mais

indivduos comparados sejam distintas.

 Metodologia de RFLP
1 . Digerir DNA em fragmentos pequenos
2. Separao dos fragmentos por gel
eletroforese
3. Transferncia de fragmentos de DNA para
filtro
 Metodologia de RFLP

4. Visualizao dos fragmentos de DNA

sondas marcadas (32P) ou a frio
5. Anlise dos resultados
bandas analisadas para alelos e/ou
presena/ausncia
diferenas em padro de bandas reflete
diferenas genticas
A escolha de sonda/enzima de restrio
crucial
 Digesto de DNA Genmico e
Separao em Gel
2
digesto 5
4
3
DNA 1
Separao 1
em gel
2
3
4
5
Eletroforese
Transferncia para Membrana de
Nylon ou Nitrocelulose

3
1 5

4
 MARCAO DA SONDA
(EX.: MATERIAL RADIOATIVO [32P] ATP,[32P] dNTP)
Hibridizao com sondas radioativas
em Nylon ou Nitrocelulose
 Hibridizao com sonda marcada
Exposio em filme de Raios-X
Aplicao dos RFLPs na medicina forense
 Interpretao de resultados

1
1 2 3 4 5 6
2

5
Stio alvo para sonda

6 Stio de restrio
Insero
Marcador RFLP na anemia falciforme
Anlise de Diversidade e Filogenia
por RFLP

13 5 6 2 8
A B C

Kb
13 11
A B C
9
8
6
5 4
2
 RAPD - Random Polymorphic DNA
Amplificao Randmica de DNA Polimrfico

Utiliza um nico primer ao invs de um par de primers.

O primer nico tem seqncia arbitrria, e portanto sua seqncia
alvo desconhecida.
Uma caracterstica fundamental dos marcadores RAPD o fato
deles se comportarem como marcadores dominantes. Dominncia
do ponto de vista da interpretao relativa entre gentipo e
fentipo de um indivduo.
Embora a grande maioria dos marcadores RAPD possuam
comportamento "dominante", existe a possibilidade de se
amplificar marcadores co-dominantes , ou seja, amplificar ambos
os alelos de um loco.
 Caractersticas do RAPD:
Obteno de "fingerprinters' (impresses digitais)
genmicos de indivduos, variedades e populaes.
Anlise estrutural e diversidade gentica em populaes
de melhoramento e bancos de germoplasma.
Estabelecimento de relacionamentos filogenticos entre
diferentes espcies.
Construo de mapas genticos de alta cobertura
genmica e a localizao de genes de interesse
econmico.
Base gentica dos marcadores RAPD
 600 pb -
- escada 100 pb
- E. acervulina
- E. tenella
- E. maxima
- E. praecox

J-20
- E. mitis
- E. brunetti
- E. necatrix
- Conrrole
RAPD inter-especfico de Eimeria
 VNTR - Variable Number of Tandem Repeats
Nmero varivel de repeties seriadas

Caractersticas do VNTR:

Seqncias repetitivas agrupadas ou espalhadas ao longo do

genoma.

So constitudas por blocos cujo nmero de unidades

repetitivas varivel, gerando polimorfismos.

Blocos de unidades repetitivas formadas por 1 a 4 pb no locus

hipervarivel so conhecidas como microssatlites. Unidades
de 5 a cerca de 100 pb so denominadas minissatlites.
Caractersticas do VNTR:

So observados atravs de digestes do DNA genmico

seguidas de ensaios de Southern blot com sondas homlogas s
regies do minissatlite.

Obtm-se um padro de mltiplas bandas devido ao carter

multilocus.

Os padres de mltiplas bandas constituem os chamados DNA

fingerprints e permitem discriminar indivduos e estabelecer
graus de parentesco e consanginidade.
Caractersticas do VNTR:

So obtidos atravs de PCR de loci especficos.

Cada "ilha" microssatlite, independente do elemento repetido

(CA, TG, ATG etc.) constitui um loco gentico altamente varivel,
multiallico, de grande contedo informativo.

A anlise de vrios loci permite estabelecer relaes de

paternidade e identificao personalizada, atravs dos alelos
encontrados nos indivduos.

No requerem Southern blots. A anlise consiste no PCR de

vrios loci, eletroforese em gel e interpretao.
Vantagens e limitaes dos marcadores microssatlites

A expresso co-dominante e o multialeslismo, os marcadores

SSR (seqncias simples repetidas = microssatlites) so os que
possuem o mais elevado contedo de informaes de
polimorfismo na terminologia de marcadores moleculares.

Os SSR so muito mais freqentes e distribudos ao acaso,

permitindo a mais completa cobertura de qualquer genoma
eucarioto.

A maior limitao da tecnologia microssatlite a grande

quantidade de trabalho necessrio para o desenvolvimento
prvio dos marcadores.
 Modelos

Eletroforese em gel

Anlise de casos moleculares

Seminrios