Colorimetria y espectrofotometria
COLORIMETRIA
Muchos de los experimentos bioquimicos incluyen la medicién de un
compuesto 0 un grupo de compuestos que hacen parte de una mezcla. Quizés
la técnica mds usada para determinar la concentraci6n de dichos compuestos
es la colorimetria. El fundamento de la técnica consiste en que si se pasa luz
blanca a través de una solucién coloreada, algunas longitudes de onda se ab-
sorben con preferencia sobre las otras (figura 4.1). Muchos compuestos no son
coloreados, pero pueden absorber liz en la region visible si se someten a la
accién de un reactivo apropiado. Estas reacciones son a menudo especificas y
muy sensibles, hasta el punto de poder medir cantidades de material en con-
centraciones de milimol por litro. La mayor ventaja consiste en que no es
necesario el aislamiento del compuesto y que se pueden determinar los cons-
tituyentes de una mezela compleja tal como sangre, sin que se requiera
mucho tratamiento previo. Tal como se discute a continuacién, la intensidad
del color es proporcional a la concentracién del compuesto que se mide, mien-
tras que la cantidad de luz absorbida es proporcional ala intensidad del color y
por lo tanto a la concentracién.
Ley de Beer-Lambert
Cuando se pasa un rayo de luz monocromatica de intensidad inicial Ip a través
de una solucion en un recipiente transparente, parte de la luz es absorbida de
manera que la intensidad de la luz transmitida I es menor que I. Ocurre
alguna disminucién en la intensidad de la luz por dispersién de las particulas
oreflexién en las interfases, pero principalmente por absorcién dela solucién
(figura 4.2). La relacion entre Ie Ip depende de la longitud del medioColorimetria y espectrofotometria 95.
Luz incidente _Luz absorbida por Luz emergente y por
(blanca)—_la soluci6n coloreada consiguiente color de
‘roja) Ta solucién (verde)
Amarillo
Verde
+ Azul
Figura 4.1. Por qué son coloreadas las soluciones
absorbente, l, y de la concentraci6n de la solucién absorbente, c. Estos factores
se hallan relacionados en la Ley de Lambert y Beer (figura 4.2).
Ley de Lambert. Cuando un rayo de luz monocromatica pasa a través de un
medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que
la longitud del medio absorbente aumenta.
Ley de Lambert: f= /,e7*1!
)
Ley de Beer. Cuando un rayo de luz monocromatica pasa a través de un
medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que
la concentracién del medio absorbente aumenta.
Ley de Beer Tete
Estas dos leyes se combinan en la ley de Beer-Lambert:
IeIpen beet
Solucién absorbente,
concentracion ¢
Rayo emergente
Intensidad
Rayo incidente
Luz monocromatica
Espesor de la golucién <—/—>
Figura 4.2 Absorcién de la luz por una solucién96 Bloquimica practica
El cociente de las intensidades se conoce como la transmitancia y se
expresa como un porcentaje:
kyl
T= IIo =
Sacando logaritmos:
loge Jo/I = ks cl,
log 0 Zo/f= 2.303 kg cl,
log; 9 Io/I = kel.
La expresién logy, Io/I se conoce como la extincién E, o absorbancia. La
extincién se designa algunas veces como densidad éptica, pero este nombre no
se recomienda actualmente. Por lo tanto,
E=kel.
Sise sigue la Ley de Beer-Lambert y | se mantiene constante, un gréfico
de la extincién en funcién de la concentracién da una linea recta que pasa por
el origen; en tanto que un grafico del porcentaje de transmitancia en funcién
de la concentracién da una curva negativa exponencial (figura 4.3).
Algunos colorimetros y espectrofotémetros tienen dos escalas, una lineal
de porcentaje de transmitancia y otra logaritmica de extincién. Esta ultima
escala es la que esté linealmente relacionada con la concentracién y se usaen
.” vo
q g
2 50 w 05
5 z
a
=
5
i
coventain coneracn
Figura 4.3 Relacién entre la absorcién de la luz y la concentracién de una
solucién absorbenteColorimetria y espectrofotometria 97
las curvas patrones de concentracién (figura 4.4). Con la ayuda de tales curvas
se puede determinar facilmente la concentracién de una muestra problema
conociendo su extincién.
Coeficiente molar de extincién. Siles1cmyces 1 mol/l, laabsorbancia sera
igual al coeficiente molar de extincién k, el cual es caracteristico para un
compuesto dado. El coeficiente molar de extincién k, es, por lo tanto, la
extincién producida por 1 mol/l en un recorrido de luz de 1 cm y general-
mente se escribe £}™0!/!; y se expresa en 1mol~! cm™!. :
Coeficiente de extincién espectfica. No se puede conocer facilmente el peso
molecular de algunos compuestos tales como proteinas y dcidos nucleicos
presentes en una mezcla y en este caso se usa el coeficiente de extincién
especifica. Este se define como la extincién de 10 g/1 (antes conocido como 1%
p/v) del compuesto en un recorrido de luz de 1 em, £198,
Limitaciones de la Ley de Beer-Lambert. Algunas veces no son lineales los
grficos de la extincién en funcién de la concentracién y esto probablemente
se debe a que no se cumple alguna de las siguientes condiciones
1. La luz debe ser preferiblemente monocromatica o la longitud de onda
debe estar entre limites muy estrechos.
2. La longitud de onda de la luz empleada debe coincidir con el maximo de
absorcién de la soluci6n. Esto permite también conseguir la sensibilidad
éptima. :
3. No debe haber ionizacién, asociacién, disociacién 0 solvata¢ién del
soluto con respecto a la concentracién o al tiempo.
4, La solucién es muy concentrada, originando un color muy intenso. La :
ley sélo se cumple hasta cierto limite maximo de concentraci6n, carac-
teristico para cada sustancia.
Escala lineal del porcentaje de transmitancia
0.2 03 04 06 0810
80%
logaritmica de ta extincién
Figura 4.4 Relacion entre el porcentaje de transmitancia y la extincién98 — Bloquimica préctica
Medicién de la extinclén
Los primeros colorimetros se calibraban “a ojo” comparando el color de una
solucién con los de una serie de discos coloreados. Los resultados obtenidos
eran muy subjetivos y no muy exactos. Los colorimetros visuales s6lo tienen
ahora un interés histérico y no se describen en este libro. La célula fotoeléctri-
ca tiene la ventaja sobre el ojo humano de poder determinar el grado de
absorcién de un color y de ser mucho més objetiva.
El colorimetro fotoeléctrico. En la figura 4.5 se presenta un diagrama de las
partes bdsicas de un colorimetro tipico. La luz blanca de una lémpara de
tungsteno pasa a través de una rendija, luego a través de un lente condensa-
dor, hasta obtener un rayo paralelo que incide sobre la solucién que se
investiga, la cual se ha colocado en una celda de absorcién o cubeta. Lacubeta
es generalmente de vidrio y las paredes a través de las cuales pasa el haz de luz
son paralelas. En muchos casos, las cubetas tienen una base de 1 cm cuadrado
y pueden contener facilmente 3 ml de liquido.
Después de la cubeta se encuentra el filtro, el cual se selecciona para
permitir la transmisi6n maxima del color no absorbido. Si se quiere exami-
nar una solucién azul, entonces se absorbe el rojo y por lo tanto se selecciona
un filtro rojo. El color del filtro es, pues, complementario a la solucion que se
estudia (tabla 4.1). En algunos instrumentos el filtro se encuentra antes de la
cubeta. El filtro produce bandas angostas de transmisién y, por Jo tanto, da
luz aproximadamente monocromitica. Los filtros Ilford son los mas comunes
y algunas de sus propiedades se dan en la tabla 4.2.
Los filtros se seleccionan en forma tal que cumplan la Ley de Beer.
Galvanémetro
Célula de absorcién
Apertura . de Fotocétula
y VY ;
Condensador Amplificador
Lampara de Fittro
‘tungsteno
: Figura 4.5 Diagrama de un fotocolorimetroColorimetria y espectrototometria 99
Tabla 4.1 Relacién entre el color de la
solucién estudiada y el filtro escogido parael
andlisis colorimétrico
Color de la solucién —_Filtro
rojo-naranja azul-azul verdoso
azul rojo
verde rojo
purpura verde
amarillo violeta
A continuacién la luz Hega a una fotocélula que genera una corriente
eléctrica en proporcién directa a la intensidad de la luz incidente. Esta sefial
eléctrica pequefia se incrementa mediante un amplificador, y la sefial
amplificada pasa a un galvanémetro calibrado en una escala logaritmica que
da directamente medidas de absorbancia. Las fotocélulas usadas en colorime-
tros no muy finos tienen una precision de aproximadamente 0.5%. Lasolucién
blanco se coloca primero en el colorimetro y se ajusta el galvanémetro a una
absorbancia de cero. Luego se coloca la muestra y se lee directamente la
absorbancia.
Un método mejor consiste en dividir el haz de luz en dos partes, una de las
cuales pasa a través de la mezcla y otra a través del blanco; los circuitos se
equilibran hasta que no se mueva la aguja del galvanémetro. La extincién
esté dada por la lectura del potenciémetro cuando el circuito queda en
equilibrio.
Tabla 4.2 Transmisién maxima para filtros Ilford
Numero del Transmisién
filtro [ford Color maxima (nm)
600 ioleta intenso 420
601 violeta 430
602 azul 470
603 azul verdoso 490
604 verde 520
605 amarillo verdoso 550
606 amarillo 580
607 naranja 600
608 rojo 680
609 rojo fuerte 700
Con permiso de Ilford Ltd.100 Bloduimica practica
ESPECTROFOTOMETRIA
Analisis por medicién de la absorcién
Un espectrofotémetro es un colorimetro més sofisticado en el cual la luz
monocromatica se obtiene mediante una rejilla o prisma. La banda de
longitudes de onda de la luz que pasa a través de un filtro es bastante ancha y
por lo tanto, puede ser dificil distinguir entre dos compuestos que posean
absorcién parecida usando un colorimetro. En estos casos se necesita un
pectrofotémetro, ya’ que éste permite separar los dos picos de absorcién
usando el monocromador.
Algunos compuestos absorben fuertemente en la regién ultravioleta y su
concentracién se puede determinar lo mismo que en el caso de los
colorimetros usando un espectrofotémetro més amplio que pueda funcio-
| nar hasta longitudes ‘de onda de 190 nm. Por ejemplo, la concentracién
de Acido urico puede ser determinada midiendo la extincién de la solucién a
293 nm antes y después de habérsele tratado con un exceso de la enzima
uricasa. El acido trrico es oxidado por la uricasa a pH 9 dando alantoina la cual
: no absorbe a esta longitud de onda.
La longitud de onda usada mas comunmente en la regién del ultravioleta
es quizds 340 nm. A esta longitud de onda las formas reducidas de los
nucleétidos de piridina, NADH, y NADPH, absorben fuertemente, mientras
que las formas oxidadas de estas coenzimas no lo hacen, (figura 4.6). El NAD
tiene la estructura tipica de los dinucleétidos:
Reducido —___
Oxidado --- =
Coeficiente de extincién molar x 10>
Longitud de onda (nm)
Figura 4.6 Espectro de absorcién de las formas
reducidas y oxidadas de NAD y NADPColorimetria y espectrofotometria 101
HLH HOH
eee ee cen.
woz econ, 44, . HE“S*G—conn, __. HE~CSe—cONH, | 4,
Hos cH HOCH HC\y-CH
1 I
A a R
Figura 4.7 Reduccién de la nicotinamida-adenina-dinucleétido
Nicotinamida—ribosa—fosfato
Adenina—ribosa—fosfato
El NADP tiene la misma estructura, excepto que posee un fosfato en la
posicién 2’ de la ribosa de la adenina. Los dos H reaccionan con la
nicotinamida, pero al pH fisiolégico uno de los H se disocia tal como se muestra
en la figura 4.7.
La forma reducida tiene una estructura quinoide, y es la responsable de
la absorcién a 340 nm.
El progreso de una reaccién catalizada por enzimas que utilicen estas
coenzimas, puede ser medido facilmente siguiendo la velocidad de aparicién o
desaparicién del NADH, a partir de su extincién a 340 nm. El método es muy
sensible ya que el coeficiente de extincién molar del NADH, a 340 nm es 6.3 x
10? mol-! cm-!, Esto significa que la conversién de un pmol de substrato/ml
produce un cambio de 6.3 en la absorbancia. Por lo tanto es posible medir
reacciones catalizadas por enzimas que involucran cambios de solo nanomo-
les de substrato por minuto.
Espectros de absorcién
‘Muchos compuestos tienen espectros caracteristicos de absorcién en laregin
visible y ultravioleta y esto hace posible la identificacién de dichos materiales
en una mezcla. Este punto se ilustra varias veces a través del texto.
Proteinas. Los aminodcidos triptéfano y tirosina absorben a 280 nm, lo cual
constituye el fundamento de una técnica muy sensible para determinar
protefnas sin que se destruya la muestra. Las proteinas también absorben en
el ultravioleta lejano, debido a los enlaces peptidicos.
Acidos nucleicos. Los Acidos nucleicos y las bases que los componen
presentan una absorcién maxima en la region de 260 nm. La magnitud de
absorcién de estos cidos constituye una medida de su integridad, ya que los
dcidos nucleicos parcialmente degradados absorben més fuertemente que los
materiales nativos. Las bases que componen los Acidos poseen un espectro de
absorcién suficientemente diferente, lo cual permite usarlo en su identifica-
cién,
Hemoglobinas. Cuando se modifican las hemoglobinas por medio de ciertas
drogas o de monéxido de carbono, se presenta un cambio caracteristico en la102 Bloquimica préctica
absorcién maxima, y por lo tanto la presencia de estos agentes modificantes
puede ser detectada y medida.
p-Nitrofenilfosfato. Es un substrato usado en la determinacién de fosfatasas
Jas cuales catalizan la hidrélisis del compuesto para dar p-nitrofenol y fosfato
inorgnico. En solucién alcalina el producto p-nitrofenol da un tipico color
amarillo con una absorcién maxima a 405 nm. El substrato no absorbe en esta
region permitiendo asi seguir el progreso de la reaccién en solucién alcalina
Algunos consejos practicos. Los detalles de la operacién de un instrumento
particular deben ser buscados en el manual de instrucciones; sin embargo, a
continuacién se dan algunas reglas generales referentes al uso y cuidado de
los colorimetros y espectrofotometros.
1. Limpieza de las cubetas. Las cubetas se lavan sumergiéndolas en acido
nitrico 50% v/v y luego enjuagdndolas cuidadosamente en agua
destilada.
2. Uso de las cubetas. Antes que todo, llene las cubetas con agua destilada
y compérelas unas con otras para corregir cualquier pequefia dife-
rencia en las propiedades épticas. Seque siempre con papel para
limpiar lentes la parte externa de la cubeta antes de colocarla en la
celdilla y no toque con la mano las dos paredes de la cubetaa través de las
cuales pasa el rayo de luz. Cuando se hayan tomado todas las medidas,
ldvelas con agua destilada y déjelas en posicién invertida hasta que se
sequen. :
3. Absorcién de radiacién por las cubetas. Las cubetas de vidrio son
mucho més baratas que las de silica y se usan cuando quiera que sea
posible. Su limitacion principal esté en que el vidrio absorbe radiacién
ultravioleta y no puede usarse por debajo de 360 nm; para estos casos se
emplean cubetas de silica.
Cubetas de vidrio: 360 — 800 nm.
Cubetas de silic 200 — 800 nm.
4, Fuente de luz. Las lémparas de tungsteno producen un espectro amplio
de energia radiante hasta de 360 nm. Para trabajar en la region ultravio-
leta del espectro se usan lamparas de deuterio. Si se usa la lampara de
tungsteno en el intervalo 360—400 nm, es necesario colocar un filtro azul
en frente del haz de luz.
5, Fotocélulas. Una fotocélula azul recibe luz emitida hasta 625 nm y una
fotocélula roja recibe luz por encima de esta longitud de onda. Las
fotocélulas se exponen a la luz sdlo por el tiempo que sea necesario para
tomar una lectura evitando asf la fatiga de las mismas.
6. Blancos, La extincién de una solucién se mide en contra de un blanco
que contiene todas las sustancias usadas en la prueba, excepto el.com-
puesto que se quiere medir. El blanco se coloca primero en el instru-
mento y se ajusta luego la extincién a cero (100% de transmitancia)Colorimetria y espectrofotometria 103
antes de tomar las lecturas para la muestra. Alternativamente se puede
leer la extincién en contra de agua destilada y a la absorbancia de la
solucién problema se le resta la del blanco.
. Duplicados. Es absolutamente esencial preparar en duplicado todas las
soluciones blancos y patrones en forma tal que se pueda construir una
curva patron exacta. Ademés, las muestras deben prepararse también
en duplicado siempre que sea posible.
x
EXPERIMENTO 4.1 Curvas de absorbancia de dos colorantes
Fundamento
Los compuestos coloreados presentan espectros de absorcién caracteristica y
la seleccién cuidadosa de las longitudes de onda maxima permite analizar los
componentes de una mezcla de estas sustancias coloreadas.
Materiales 100
1. Colorimetros con una serie de filtros diferentes. 50
2. Azul de bromofenol (10 mg/l). 11
3. Anaranjado de metilo (10 mg/l). 11
4. Mezcla problema de los dos colorantes. 11
Método
Determine la extincién de cada colorante usando los diferentes filtros que
vienen con el colorimetro. Recuerde que cada vez que se cambie el filtro es
necesario graduar el instrumento en cero con agua destilada en la cubeta.
Anote cuidadosamente la longitud de onda de transmisién maxima (absor-
bancia minima) para cada filtro y haga un grafico de la absorbancia observada
en funcién de la longitud de onda.
iCuél es la longitud de onda que produce la absorbancia maxima para cada
colorante? :
aEn qué forma la mezcla de los dos colorantes afecta el espectro de
absorcién?
EXPERIMENTO 4.2 Demostracidn de la Ley de Beer
Materiales
1. Los mismos del experimento 4.1.
Método
Prepare varias concentraciones de uno de los colorantes disponiendo una
serie de tubos en la siguiente forma:
Azul de bromofenol (10 mg/!) (ml) 1 2 3 4 5
Agua destilada (ml) ¢3 2770
Coloque el filtro que dio la m4xima extincién y gradie el colorimetro a
cero con agua destilada. En seguida anote la extincién de cada solucion y haga104 Bloquimica préctica
un gréfico de ésta en funcién de la concentracién del colorante en cada tubo
(mg/l 0 ug/ml).
1. Repita el experimento anterior usando el filtro que dio la maxima
absorbancia con anaranjado de metilo, haga lo mismo con otrofiltroy si
es posible con luz blanca sin filtro. ;Qué tanto se ajustan ala ley de Beer
las curvas de extincién en funcién de la concentracién?
2. Repita todo el éxperimento usando el colorante anaranjado de metilo.
3, Finalmente, use la informacién obtenida en estos experimentos para
determinar la concentracién de cada colorante presente en la muestra.
EXPERIMENTO 4.3 Determinacién colorimétrica de fosfato inorganico
Fundamento
A diferencia de los colorantes anteriores, la mayoria de los compuestos
bioquimicos no tienen coloracién y pueden ser analizados colorimétrica-
mente pero sélo después de someterlos a la accién de un reactivo quimico
especifico que origine un producto coloreado. Este aspecto puede ilustrarse
midiendo fésforo inorganico, que es, probablemente, una de las determina-
ciones més usuales en los laboratorios de bioquimica. La curva patrén obte-
nida seré empleada en experimentos posteriores.
El fésforo inorganico reacciona con molibdato de amonio en soluci6n acida
para formar dcido fosfomol{bdico. La adicién de un agente reductor reduce el
molibdeno presente en el fosfomolibdato produciendo un color azul, sin
afectar el Acido molibdico libre. En este método el agente reductor es el sulfato
de p-metilaminofenol. La presencia de cobre en la solucién amortiguadora
aumenta la velocidad de aparicién del color.
Materiales 100
1. Molibdato de amonio (50 g/1). 11
2. Amortiguador de acetato de cobre pH 4.0 (Disuelva 21
2.5 g de sulfato de cobre (CuSO, -5H,0),y 46 g de
acetato de sodio (CH,;COONa - 3H,0) en 1 litro de
Acido acético 2 mol/l. Verifique el pH y ajustelo a 4.0
si es necesario.)
. Agente reductor. (Disuelva 20 g de p-metilaminofenol 11
sulfato en una solucién de sulfito de sodio (Na,SO,. 7H,O)
100 g/l y complete hasta 1 ).Guardelo en un frasco
oscuro hasta cuando se necesite.
. Acido tricloroacético (TCA), (100 g/1). 250 ml
. Solucién de fosfato que contenga 100 mg de 100 ml
fésforo/100 ml. (Disuelva 438 mg de fosfato de potasio
monobisico en agua y complete hasta 100 ml.) Guardela
en el refrigerador.
»
oeColorimetria y espectrofotometria. 105
6. Solucién de trabajo de fosfato que contenga 1 mg 11
fésforo/100 ml. (Diluya la solucién anterior 1 a 100
con TCA 50 g/l).
7. Colorimetros. 50
Método
En varios tubos de ensayo pipetee de 0.1 a 1 ml de la solucién patrén de fosfato
y complete con agua hasta un volumen de 1 ml en los que sea necesario,
‘Agregue luego 3 ml de amortiguador de acetato de cobre, 0.5ml de molibdato
de amonio y 0.5 ml del agente reductor. Mezcle vigorosamente después de
cada adicién. Deje reposar por 10 minutos y lea la extincién a 880nm. Prepare
un blanco en el cual se reemplaza el fosfato por 1 ml de TCA 50 g/l.
Haga un gréfico de la extincién en funcién de la concentracién de fosfato.
Cuando se mide la concentracién de fosfato en una solucién que contiene
proteina, la muestra se mezcla con un volumen igual de TCA 20 g/l, luego se
separa el precipitado por centrifugaci6n y se trata una alicuota del sobrena-
dante en la forma como se indicé anteriormente.
EXPERIMENTO 4.4 Validez de la Ley de Beer en la determinacién colorimé-
trica de creatinina
Fundamento
La creatinina en presencia de Acido picrico y en soluci6n alcalina forma un
tautémero rojo de picrato de creatinina.
Materiales 100
1. Acido picrico (solucién acuosa saturada). 21
2. Hidréxido de sodio (1 mol/I). 11
3. Patrén de creatinina (2 g/l). 11
4. Colorimetros. 50
5. Matraces volumétricos (100 ml). 250
Método
Prepare diferentes soluciones de creatinina diluyendo adecuadamente el
patron y coloque 1 ml de cada solucién en un matraz aforado de 100 ml.
‘Agregue 1 ml de hidréxido de sodio 1 mol/l y 2 ml de solucin saturada de
Acido pfcrico, mezcle vigorosamente y déje reposar durante 10 minutos.
Complete con agua hasta la marca y mida la extincién a 530 nm.
Haga un grafico de la extincién en funcién de la concentracién de
creatinina.
EXPERIMENTO 4.5 Espectro de absorcién del p-nitrofenol
Materiales 10
1. p-nitrofenol (10 mmol/1). 50 ml
2. Acido clorhidrico (10 mmol/1). 1)106 —_Bloquimica préctica
OH 9)
= + Ht
oD
JN AN,
oo “8
°
Ul
i
ooo
Figura 4.8 Disociacién del p-nitrofenol
3. Hidréxido de sodio (10 mmol/1). a
4. Espectrofotémetros. 5
5. Matraces volumétricos (100 ml). 10
Método
Diluya la solucién de p-nitrofenol 0.2—50 ml con (a) HCl 10 mmol/I y (b)
NaOH 10 mmol/l. Determine el espectro de absorcién de cada solucién en el
intervalo de 250 a 500 nm. Analice las diferencias entre los dos espectros y
caleule el coeficiente de extincién molar a la longitud de onda que dé la
absorcién maxima.
EXPERIMENTO 4.6 Determinacién de los valores pK, del p-nitrofenol
Fundamento
El p-nitrofenol se disocia como se muestra arriba (figura 4.8). Como se anoté
en el experimento anterior, la forma no disociada que esta presente en la
solucién 4cida, no absorbe en la regién visible mientras que la estructura
quinoide, presente en la solucién alcalina, absorbe fuertemente. El valor de
pK es el pH al cual hay 50% de ionizacién, o, en otras palabras, el pH al cual se
produce la mitad del valor de la absorbancia obtenida en solucién alcalina
suponiendo que en Alcali se produce el 100% de ionizacién.
Materiales 10
1. Los mismos del experimento anterior. .
2. Soluciones amortiguadoras 50 mmol/I. 11 de cada
(a) Amortiguador de citrato (pH 3.0). solucién
(b) Amortiguador de citrato (pH 4.0). amortiguadora
(c) Amortiguador de citrato (pH 5.0).Colorimetria y espectrototometria 107
(d) Amortiguador de citrato (pH 6.0).
(e) Tris-HCl (pH 7.0).
(f) Tris-HCl (pH 7.5).
(g) Tris-HCl (pH 8.0).
(h) Tris-HCl (pH 9.0).
(i) Carbonato-bicarbonato (pH 10.0).
(j) Carbonato-bicarbonato (pH 11,0).
Método
Usando las soluciones amortiguadoras anteriores diluya 0.2 ml de p-nitrofenol
hasta 50 ml y determine la extincién de cada solucién a la longitud de onda de
405 nm, en la cual el fenol no disociado no presenta absorcién. Determine los
valores de pK ,. Titule 25 ml de p-nitrofenol 10 mmol/I con NaOH a un pH de
10.5. Corrija los valores obtenidos después de titular agua destilada y haga una
curva de titulacién. Determine los valores de pk, y comparelos con los
obtenidos anteriormente.
EXPERIMENTO 4.7. Curva de progreso del p-nitrofenil fosfatasa
Si se desea puede hacerse un tercer experimento con el fin de mostrar el uso
de las propiedades de absorcién usando p-nitrofenol, para medir la actividad
de la enzima fosfatasa alcalina. Detalles completos se dan en el experi-
mento 9.2.
EXPERIMENTO 48 Determinacién de barbituratos mediante el espectrofoté-
metro ultravioleta
pH 10.0 ——
eH13.4 --——
Extincién
230 240 250 260 270
Longitud de onda (nm)
Figura 4.9 Espectro de absorcién caracteristica de
algunos barbituratos en solucién alcalina108 Bloquimica practica
Fundamento
Los barbituratos sustituidos en posiciones 5,5’ dan un espectro de absorcién
caracteristico en la region ultravioleta con un maximo a 240 nm a pH 10.
A pH 13.4 la absorbancia maxima se desplaza a 253 nm y se obtiene un minimo
a 235 nm. Para detectar la presencia de barbituratos se hace el espectro de una
solucién en el intervalo 220—270 nm a pH 10.0 y a pH 13.4 (figura 4.9). Las cur-
vas presentan maximos y minimos y se cruzan a 227nm y 250 nm. Los puntos
de cruce se llaman isosbésticos. Hay también una diferencia maxima en la
absorcién a 260 nm la cual se usa para determinar la cantidad de barbiturato
presente. La razén para la diferencia en el espectro de absorcién es que estos
compuestos son Acidos dibasicos con valores pK de aproximadamente 8 y 12,
asi que a pH 10 se encuentra tnicamente una forma ionizada y a pH 13.4 se
encuentra la forma doblemente ionizada (figura 4.10).
La deteccién y determinacién de barbituratos en sangre y orina es muy
importante en aquellos casos en que se sospecha envenenamientoy el método
puede usarse con sangre, plasma u orina. Los barbituratos presentes en los
fluidos corporales se extraen primero en cloroformo y luego en dlcali.
Una solucién ‘desconocida’ de fenobarbitona en plasma puedeser util para
demostrar el método. Las concentraciones plasmaticas que sobrepasen los 100
mg/l son usualmente fatales y por tanto es conveniente que la muestra
‘desconocida’ contenga aproximadamente 10 a60 mg/l.
Materiales 10
1. Cloroformo (grado analitico). 11
2. Amortiguador de fosfato de sodio o potasio (0.4 mol/l, 200 ml
pH 7.4).
3. Hidréxido de sodio (50 mmol/l). 200 ml
4, Solucién de Acido bérico y cloruro potésico. (37.2 g 100 ml
de Acido bérico y 45 g de cloruro de potasio en 1 1).
5. Patron de fenobarbitona (20 mg/l en NaOH 0.45 mol/l). 100 ml
6. Papel de filtro Whatman No. 31. 10
7. Embudos de separacién. 20
8, Espectrofotémetros. 5
9. Acido sulfarico (6 mol/1). 10 ml
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Figura 4.10 Formas ionizadas de barbituratos substituidos en 5,5’