IR- i UV/ VIS-analiza pripadaju molekulskoj apsorpcijskoj spektrometriji.

Apsorpcija elektromagnetskog zraenja

opisana je Lambert-Beerovim zakonom:

A = apsorbancija
= molarni apsorpcijski koeficijent
A = cl (ekstinkcija stari naziv; L cm-1 mol-1)
c = molarna koncentracija uzorka (mol/L)
l = duljina puta zrake kroz uzorak (debljina
kivete) (cm)

1
 IR SPEKTROSKOPIJA
Infracrvena regija spektra
lat. infra ispod crvene; znai regija u spektru koja korespondira frekvenciji
tono ispod frekvencije vidljivog dijela spektra (crvena boja), odnosno iznad
najvie frekvencije mikrovalova: ~ 8 x 10-5 do 1 x 10-2 cm.

IR-spektrometri operiraju u sredini IR regije: = 2,5 x 10-4 do 25 x 10-4 cm.

Infracrveni fotoni nemaju toliku energiju za izazivanje elektronskog prijelaza,

ali uzrokuju vibraciju grupe atoma ovisno o prirodi njihovih meusobnih veza.

Kao i elektronski prijelazi, razliite vibracije odgovaraju razliitim energijama

i molekule apsorbiraju infracrveno zraenje (toplinsko zraenje) pri tono
odreenim valnim duljinama i frekvencijama.

2
 Valna duljina () se unutar IR-podruja iskazuje u mikrometrima
(1m = 10-6 m = 10-4 cm).

Umjesto frekvencije izraene u Hz u apsorpcijskim IR-spektrima koristi se

frekvenciji srodna jedinica, tzv. valni broj ( ) izraen u cm-1 omjer
frekvencije () i brzine svjetlosti (c). Valni broj je reciproan valnoj duljini.

( cm-1) = c= x
c
1 10 000 m/cm
( cm-1) = = (jer 1 m = 10-4 cm)
(cm) (m)

Za razliku od valne duljine, valni broj je direktno proporcionalan

frekvenciji vala, a time i energiji fotona dane frekvencije (E=h).

Zakljuno: Energija fotona (zraenja) raste porastom frekvencije, odnosno

valnog broja, a smanjenjem valne duljine.
3
 Razlikujemo:
RASTEZNE VIBRACIJE dogaaju se uz samu liniju veze uzrokujui promjenu
duljine veze
DEFORMACIJSKE VIBRACIJE ne dogaaju se uzdu veze, ali uzrokuju
promjenu veznog kuta (svijanje veze)

Kod dvoatomnih molekula, kao npr: HCl dogaaju se samo rastezne

vibracije, poto molekula nema veznog kuta:

rastezne vibracije

Kod troatomnih i vieatomnih molekula vibracije su mnogo kompleksnije:

rastezene vibracije mogu biti simetrine i nesimetrine, a deformacijske
vibracije se dogaaju ili u ravnini ili izvan ravnine.

4
APSORPCIJA ZRAENJA

Svaka se rastezna ili deformacijska vibracija odreene kovalentne veze

u molekuli dogaa pri odreenoj karakteristinoj frekvenciji.

Kada se molekula podvrgne zraenju frekvencije koja tono odgovara

frekvenciji jedne od spomenutih vibracija veze, dolazi do apsorpcije
energije i veze jae zavibriraju.

npr: i C-H veza i C-O veza e apsorbirati IR-zraenje, no C-H veza

apsorbirat e foton vee energije (vie frekvencije). 9
 Apsorbirana energija poveava amplitudu vibracije (frekvencija se
ne mijenja), te eksperimentalnim odreivanjem valnog broja ( )
apsorbirane energije moemo ustanoviti koju vrstu veza molekula sadri.

npr: rastezna vibracija C=O veze apsorbira energiju valnog broja 1700 cm-1,
a O-H veze 3350 cm-1

Apsorpcija IR-zraenja se ne dogaa kod svih molekulskih vibracija.

Da bi vibracija apsorbirala zraenje, molekula mora imati polarnu vezu

(odreeni dipolni moment).

= dipolni moment (Debye)

e = jaina parcijalnih naboja
d = udaljenost izmeu naboja

6
 Dipolni moment je ustvari elektrino polje koje okruuje polarnu vezu.
Kako dipolni moment oscilira, polarna veza okruena je oscilirajuim
elektrinim poljem koji slui kao antena za apsorpciju IR zraenja.

Kako se elektromagnetsko zraenje takoer sastoji od oscilirajueg

elektrinog polja, polarna veza apsorbira foton odreene energije
jer dolazi do meudjelovanja oscilirajuih elektrinih polja veze i zraenja.

Efikasnost polarne veze da apsorbira IR zraenje ovisi direktno o jaini

dipolnog momenta.

7
 Vrijeme (vibracije veze) Vrijeme (vibracije veze)

Usporedba oscilirajuih elektrinih polja za C=O i C=C vezu

C=O veza polarnija, vei , oscilirajue elektrino polje je jae, te je C=O

skupina bolja antena za apsorpciju IR zraenja i daje jau apsorpcijsku
vrpcu u IR-spektru.
8
 Razlikujemo:
IR-aktivne vibracije veza - one koji pokazuju dipolni moment i apsorbiraju
IR zraenje
IR-neaktivne vibracije veza - veze koje su simetrine sa = 0, (npr: CC veza
u molekuli etina HCCH), kao i homonuklearne dvoatomne molekule (H2,
N2, O2) koje nemaju niti trajni niti promjenjivi dipol.

U IR-spektru etina biti e vidljive jedino rastezne vibracije C-H veza, no

nee se moi zakljuiti da se radi o molekuli alkina (CC veza u ovom spoju
nema dipolni moment).

9
 IR-spektar (graf) dijelimo na dva podruja:

podruje funkcijskih skupina od 4000-1400 cm-1

- veina funkcijskih skupina apsorbira zraenje u ovom podruju.

podruje otiska prsta od 1400 - 600 cm-1

- karakteristian za svaki pojedini spoj kao cjelina; svaki spoj u
ovom podruju pokazuje jedinstveni oblik apsorpcijskih vrpci.

10
 Rastezne i deformacijske vibracije svake veze u molekuli daju jako
puno apsorpcijskih vrpci, pa IR-spektar izgleda vrlo kompleksno.

Zato je kod tumaenja spektra nemogue uzeti u obzir sve vrpce,

ve samo one koje su karakteristine za pojedine skupine.

Na taj nain se iz IR-spektra mogu:

- odrediti funkcijske skupine koje molekula sadri ili
- usporediti dobiveni spektar sa onime u katalogu (bazi) ili
- pratiti promjene unutar molekule koje nastaju radi primijene nekih
kemijskih, fizikalnih ili mehanikih metoda (nestanak nekih
funkcijskih skupina i pojava novih).

No, ne moe se samo na temelju IR-spektra odrediti tona struktura

spoja. Zato se IR-spektar koristi u kombinaciji s ostalim spektroskopskim
metodama (NMR, UV, X-analiza itd.).

11
 Svaki signal (apsorpcijska vrpca) u IR-spektru ima 3 karakteristike koje
su vane kod tumaenja spektra:
VALNI BROJ
INTENZITET
OBLIK

VALNI BROJ

Za rastezanje veze u molekuli potrebno je vie energije nego za

deformaciju kuta, pa se zato rastezne vibracije nalaze u podruju
funkcijskih skupina, a deformacijske u podruju otiska prsta.

Rastezne vibracije su pritom najkorisnije vibracije za odreivanje

vrste veza koje molekula sadri.

12
 Hookov zakon

Koliina energije potrebna za istezanje veze (rastezne vibracije) ovisi o:

- jaini veze (to je veza jaa, potrebno vie energije za njeno istezanje) i
- masi veznih atoma (atomi vee mase vibriraju kod niih frekvencija)

Apsorpcijski maksimumi izraunavaju se iz jednadbe prema

Hookovom zakonu:

c = brzina svjetlosti cm/s

= 1 f (m1 + m2) = valni broj cm-1
2c m1 x m 2 f = konstanta jakosti veze din/cm
m = masa atomske skupine u
promatranoj vezi

Jae veze i atomi manje mase apsorbiraju pri viim frekvencijama

= VEI VALNI BROJ
13
INTENZITET APSORPCIJSKIH VRPCI ovisi o:
veliini promjene dipolnog momenta povezanog sa vibracijom.
to je promjena dipolnog momenta VEA, intenzitet apsorpcije je VEI.
npr: intenzitet vrpci opada ovim redosljedom:

OH > NH > CH
Poto je OH veza u usporedbi sa NH i CH vezom najpolarnija, tokom
rasteznih vibracija razmak izmeu atoma u takvoj vezi je najvei, rezultirajui
najboljim poveanjem dipolnog momenta i najveim intenzitetom apsorpcijske
vrpce.

broju veza odgovornih za apsorpciju (vie veza, vei intenzitet)

npr: apsorpcijska vrpca istezanja C-H veza bit e intenzivnija u
oktil-jodidu (17 C-H veza) nego u metil-jodidu (3 C-H veze)

koncentraciji uzorka (koncentriraniji uzorak sadri vei broj

molekula koje apsorbiraju, pa time su i vrpce intenzivnije).

14
 OBLIK APSORPCIJSKIH VRPCI

iroki signal uzak signal

Na oblik apsorpcijskih vrpci utjeu razni faktori, a jedan od vanijih je

vodikova veza.

U alkoholima:

Ova veza je slabija

kao rezultat H-veze 26
 Koncentrirani alkoholi dovode do stvaranja irokog signala O-H veze
zbog efekta slabljenja veze.
Uzak signal O-H veze dobiva se u sluaju da je alkohol otopljen u
otapalu s kojim ne moe tvoriti H-veze.
Ako otopina alkohola nije niti koncentrirana niti razrijeena, esto se
uoavaju dva signala: jedan uski (O-H veza koja ne sudjeluje u H-vezama)
i jedan iroki (O-H veza sudjeluje u H-vezama).

16
 U nekom prosjenom vremenu, jedan dio molekula amina e vibrirati
simetrino, a drugi dio asimetrino. Simetrina vibracija e apsorbirati
odreenu frekvenciju IR- zraenja potrebnu za vibracijsko pobuivanje,
dok e asimetrina vibracija apsorbirati drugu frekvenciju.

Znai, jednu apsorpcijsku vrpcu NH2-skupine stvara jedna polovica

molekula, a drugu apsorpcijsku vrpcu, druga polovica molekula 1amina.

Iz istog razloga C-H veze CH3-skupine u IR spektru preteno pokazuju

set apsorpcijskih vrpci radije nego jednu i koji se obino pojavljuju
ispod 3000 cm-1.

17
 IR-spektrometri

Vrsta uzoraka: tekui, kruti ili plinoviti

tekui uzorak kap tekuine stavlja se kao tanki film izmeu

dvije ploice napravljene od NaCl ili KBr (sol ne apsorbira IR zraenje)
kruti uzorak usitni se i pomijea sa KBr te stlai u pastilu (disk) ili
se otopi u otapalu kao to je CH2Cl2 ili CCl4 (koji vie-manje ne
apsorbiraju IR-zraenje u podruju od interesa), te se njome puni
elija koja se stavlja u ureaj
plinoviti uzorak stavlja se u dugu eliju sa poliranim prozorima
od NaCl ili KBr

18
 IR-spektrometre dijelimo na:
Disperzijske s optikom reetkom (primarno se koriste za
kvalitativnu analizu)
FT-IR-ureaje (i za kvalitativnu i za kvantitativnu analizu)
Nedisperzijske fotometre (za kvantitativno odreivanje
organskih spojeva u atmosferi)
Refleksijske ureaje (najee za analizu krutina u poljoprivredi i
industriji)

Disperzijski IR-spektrometar s optikom reetkom

U instrumentu dolazi do disperzije zraenja na razliite frekvencije,

koje se onda mjere pojedinano.

Zahtjeva odreene dijelove koji su skupi kao to je prizma i optika

reetka, koji se redovito moraju manualno kalibrirati.
19
 Instrumentu je potreban i jaki izvor zraenja, kao i due vrijeme snimanja
(2-10 minuta potrebnih za skeniranje kroz kompletan spektar).

FT-IR-spektrometar (Fourier Transform IR Spectrometer)

Prati ga brzi razvoj zadnjih godina zbog brzine, visoke resolucije,

osjetljivosti i tonosti.

Prvi instrumenti su bili glomazni i skupi (>100.000 USD) s ogranienom

primjenom.

Danas su to ureaji koji ne zauzimaju puno prostora, dostupni su i

lagani za koritenje.

Srednje kvalitetni modeli cijene 15.000-20.000 USD istisnuli su

disperzijske ureaje iz laboratorijske uporabe.
20
 Izvor (Nernstov atpi) proizvodi IR-zraenje (5000-400 cm-1) koje dolazi
do razdvajaa zrake nainjenog od poliranog kalijeva bromida postavljenog
pod kutem od 45. Dio zrake prolazi kroz razdvaja, a dio se reflektira.
Zraka koja se reflektira udara u fiksno ogledalo, a prolazea zraka udara u
ogledalo koje se pomie konstantnom brzinom. Zrake se vraaju sa ogledala
ponovo u razdvaja zrake, gdje se kombiniraju. Kako povratna zraka sa
pominog ogledala prelazi razliitu duljinu puta nego povratna zraka sa
fiksnog ogledala, kombinacijom (nizom konstruktivnih i destruktivnih
interferencija) tih dvaju snopova nastaje interferogram. Takav interferogram
koji sadri simultano sve frekvencije prolazi kroz uzorak i dolazi do
detektora, te se uz pomo Fourierovih transformacija pretvara iz vremenske
domene u IR-spektar frekvencijske domene (jaina apsorpcije kao funkcija
frekvencije).

FT-IR spektrometar + interferogram

21
 Prednosti FT-IR-tehnike:
1. Kratkoa postupka (par sekundi, sve frekvencije IR
zraenja simultano prolaze kroz uzorak)
2. Visoka resolucija ( 0,01 cm-1)
3. Odlini spektri (s nekoliko skeniranja izbjegavaju se sluajne
apsorpcije)
4. Mala koliina uzorka (ng, kombinacija s GC, HPLC)
5. Kompjutor pohranjuje spektre istih uzoraka i otapala
(analiza smjesa), te je takoer mogue usporeivanje spektara
sa onima u bazi (katalozima)
6. Mogua je linearnost u ili , odn. kompjutorska obrada spektra
(poveanje i izdvajanje pojedinih dijelova, itd.).

Video - IR-spektroskopija

22
 Podsjetnik:

Spektroskopske instrumentalne metode slue za prouavanje

atomske i molekulske strukture spojeva.
Baziraju se preteno na interakciji elektromagnetskog zraenja sa
uzorkom, pri emu promatrana (mjerena) tvar emitira ili apsorbira
tono odreenu koliinu zraenja koja se mjeri i interpretira.

Elektromagnetsko zraenje karakterizirano je valnom duljinom

(/cm) i frekvencijom (/Hz).

Sunevo (bijelo) svijetlo sastoji se od ultraljubiastog (UV),

vidljivog (Vis) i dijela infracrvenog elektromagnetskog zraenja.

23
Spektralno podruje Valna duljina, Raspon energije, kJ/ mol (kcal/ mol)

ultraljubiasto 200 400 nm (2 4 x 10-5 cm) 300 600 (70 140)

vidljivo 400 800 nm (4 8 x 10-5 cm) 150 300 (35 70)

infracrveno 2,5 25 m (2,5 25 x 10-4 cm) 4,6 46 (1,1 11)

NMR (radio) 0,3 5 m 2 40 x 10-5 (0,5 10 x 10-5)

UV/Vis spektrometri operiraju unutar podruja 200-800 nm

24
 Apsorpcija UV/Vis energije zraenja

UV/Vis zraenje (E = h) u molekuli uzrokuje prijelaz valentnih elektrona

u vie nepopunjene energetske orbitale.
Razlikujemo 3 tipa elektrona: , i n-elektroni
-elektroni ukljueni u zasiene -veze
zahtjevaju puno viu energiju za pobuivanje nego to je
to energija UV-zraenja
zato spojevi koji sadre zasiene veze ne apsorbiraju
UV zraenje

-elektroni ukljueni u nezasiene -veze ugljikovodika

prisutni u dienima, trienima i aromatskim spojevima

n-elektroni nevezni elektroni (nisu ukljueni u veze izmeu atoma)

sadre ih organski spojevi koji sadre atome sa neveznim
elektronskim parovima (kisik, duik, halogen)
25
 Prijelaz elektrona n u * karakteristian je za nezasiene molekule koje
sadre kisik, duik ili sumpor. U UV/Vis-spektrima daju slabu vrpcu.

Prijelaz elektrona u * dogaa se u molekulama u kojima su svi elektroni

ukljueni u jednostruku vezu i nema slobodnih elektronskih parova, znai
u zasienim ugljikovodicima.
Potrebna je via energija, niih valnih duljina (115 nm) za njihov prijelaz,
pa apsorpcijske vrpce nisu vidljive u UV/Vis-spektrima.

Prijelaz elektrona n u * pokazuju zasiene molekule sa slobodnim

parom elektrona. Za njihov prijelaz potrebna je energija valnih duljina od
150-220 nm, pa se apsorpcijske vrpce obino pojavljuju u dalekom UV
podruju.

Prijelaz elektrona u * pokazuju molekule sa -elektronskim sustavom

(nezasieni ugljikovodici i njihovi derivati) i vidljiv je u UV/Vis podruju
(200-700 nm). Znai, ovakav prijelaz karakteristian je za
KONJUGIRANE SUSTAVE.
26
 Zakljuno u UV/Vis podruju apsorbirat e zraenje:
1. organske molekule koje sadre skupine koje omoguavaju * prijelaz
elektrona (npr: etilen, acetileni, konjugirani ugljikovodici)
2. organske molekule koje sadre i n i -elektrone, pa je omoguen n
* i * prijelaz elektrona (nezasieni sustavi sa heteroatomima
koji sadre nevezne elektronske parove).

Konjugirani sustavi: konjugirani dieni, polieni ( sadre naizmjenino

postavljene dvostruke i jednostruke veze), kod kojih je omogueno
preklapanje p-orbitala ( sp2-hibridizirani atomi).

izolirane = veze konjugirane = veze

27
 *

Energija

elektronska elektronska
konfiguracija konfiguracija
osnovnog stanja pobuenog stanja

Prolazak UV/Vis zraenja kroz molekulu uzrokuje pobuivanje elektrona

uz njihov prelazak iz najvie popunjene MO u najniu nepopunjenu MO
HOMO LUMO 28
 Dio molekule koji je apsorbirao UV/Vis zraenje naziva se KROMOFOR
(nezasieni dio molekule C=C, C=O, NO2 itd).

Apsorpcija zraenja dana je Lambert-Beerovim zakonom:

A = apsorbancija
Io = intenzitet ulazne zrake
A = log (Io /I) = cl I = intenzitet zrake nakon prolaska
kroz uzorak
= molarni apsorpcijski koeficijent
(ekstinkcija stari naziv; L cm-1 mol-1)
c = koncentracija mol/L
l = duljina puta svjetlosti kroz uzorak / cm
(debljina kivete)

Uzorak je apsorbirao zraenje kada je intenzitet zrake prole kroz uzorak (I)
manji od intenziteta ulazne zrake (Io) i omjer Io /I je vei od 1.

Kada je omjer Io /I = 1, A = 0 NEMA APSORPCIJE

29
 UV/Vis spektar je graf apsorbancije uzorka (A) u ovisnosti o valnoj duljini ().
[alternativno se moe registrirati transmitancija (propusnost) T = I / Io
u ovisnosti o ]

Spektralni podaci karakteristini za uzorak su:

1. valna duljina(e) pri max apsorbanciji max
2. vrijednost molarnog apsorpcijskog koeficijenta pri max apsorbanciji

Molarni apsorpcijski koeficijent () je mjera za intenzitet (koliko je jako

molekula apsorbirala zraenje pri nekoj ).
Za spojeve sa veim (> 10 000 koja je karakteristina za * prijelaze
konjugiranih polienskih sustava) potrebna je manja c (npr: 10-5 mol/ L)
i obrnuto (c = 10-2 mol/ L za 10-100).

Vrijednost se rauna iz jednadbe: A

=
c .l

30
 Veliina ovisit e o veliini kromofora, te o vjerojatnosti da e zraenje
odreene biti apsorbirano kada pogodi kromofor (P = 0-1).

= 0,87 . 1020 P . a P = vjerojatnost prijelaza

a = presjek kromofora (cm2)

Faktori koji utjeu na vjerojatnost prijelaza opisani su selekcijskim pravilom.

Npr: n * prijelazi elektrona su nii u energiji od * prijelaza, no im
je do 1000x manji. Razlog tomu je to se n orbitale ne preklapaju dobro
sa * orbitalom, pa je vjerojatnost prijelaza vrlo mala. Suprotno, kod *
prijelaza se orbitale znaajno preklapaju, pa je vjerojatnost prijelaza P blizu
1.

31
 EFEKT KONJUGACIJE na vrijednost valne duljine apsorbiranog UV-zraenja

protuvezna
Energija
vezna

Poveanjem konjugiranosti poveava se energija HOMO, a smanjuje energija

LUMO orbitale, pa je potrebno manje energije za elektronski prijelaz u visoko
konjugiranim, nego u nekonjugiranim ili manje konjugiranim sustavima.
Posljedino apsorpcija zraenja e biti pri viim kod vie konjugiranog sustava.
32
 Supstituenti (auksokromi) vezani na kromofor takoer utjeu
na apsorpciju zraenja:

UV-spektar izoprena

max = 20 000
apsorbancija

buta-1,3-dien

max = 217 nm

metilna skupina kod izoprena pomie apsorpciju prema viim

s obzirom na butadien (za 5 nm).

33
 Terminologija za apsorpcijske pomake
Priroda supstituenta i polarnost otapala utjeu na poloaj
apsorpcijskog maksimuma. Kako bi odredili njihov utjecaj,
upotrebljavaju se sljedei pojmovi:

1. BATOKROMNI POMAK pomak k vioj (crvenom dijelu spektra- nia

energija)
izazivaju ga polarna otapala, poveanje
konjugiranosti, te auksokromne grupe
(supstituenti)
2. HIPSOKROMNI POMAK pomak k nioj (plavom dijelu spektra-via
energija)
3. HIPERKROMNI POMAK k veem (poveanje intenziteta) uslijed
stabilizacije odreene strukture molekule u
polarnom otapalu
4. HIPOKROMNI POMAK k manjem (smanjenje intenziteta)

34
 Woodward-Fieserova pravila

Vrijednosti max i za konjugirane sustave ovise o samoj prirodi

konjugiranog sustava i njegovim supstituentima.
Ova pravila daju korelaciju izmeu molekulske strukture i apsorpcijskog
maksimuma, te koristei ih moemo izraunom pretpostaviti max
apsorpcije za pojedinu molekulu.

KROMOFOR
AUKSOKROM

Auksokrom je supstituent koji sam po sebi nije kromofor, ali poveava

ili kada je vezan na kromofor (npr: alkilna, hidroksidna, alkoksi i amino-
skupina, halogeni).
35
 Poveanje broja konjugiranih veza izaziva BATOKROMNI EFEKT, pa
takvi spojevi apsorbiraju pri viim valnim duljinama, u Vis podruju,
=400-800 nm (vidi efekt konjugacije).

VIDLJIVI DIO SPEKTRA

ljubiasto-indigo plavo zeleno uto naranasto crveno

Kada bijelo sunevo svjetlo prolazi ili se reflektira kroz obojani spoj
(otopinu), jedan se dio Vis-spektra apsorbira.

Onaj dio spektra koji preostane, a registrira ga ljudsko oko je

komplementarna boja.

36
 BOJILA organski spojevi koriteni za bojanje tkanina, plastike,
prehrambenih proizvoda i sl.
prvotno ekstrahirani iz biljaka, a danas se dobivaju sintetski
struktura: konjugirani spojevi sa heteroatomima koji sadre
nevezne elektronske parove.

O2

bezbojni prekursor INDIGO (602 nm)

PREHRAMBENE BOJE:

Indigo Carmine
Sunset Yellow
37
 Primjena UV/Vis spektroskopije u biokemijskim procesima

Za razumijevanje staninih procesa, potrebno je detektirati spojeve koji

se nalaze u vrlo malim koncentracijama (mikromolarnim) i to bez da
se uzorak uniti ili vaporizira.

UV/Vis spektroskopija je metoda u kojoj uzorak ostaje sauvan, a

mjerenja se mogu izvoditi pri izrazito niskim koncentracijama analita.

Proteini, DNA, ATP i druge biomolekule sadre konjugirane sustave

-veza, na koje su esto vezani heteroatomi (O,N). Takvi sustavi daju
jake, karakteristine apsorpcije u UV-podruju spektra.

Ako znamo max i promatrane molekule, koristei Lambert-Beerov zakon

moemo izraunati vrlo niske koncentracije tih biomolekula (u rangu
10-4 mol/L), koji se esto nalaze u izrazito kompleksnim smjesama.

38
Primjena UV/Vis spektroskopije u analizi anorganskih kompleksa
s ionima prijelaznih metala

Osim za analizu konjugiranih organskih molekula i biomolekula,

UV/Vis spektroskopija koristi se i za kvantitativnu analizu anorganskih
kompleksa sa ionima prijelaznih metala (imaju djelomino popunjenu
d-orbitalu).

Prijelazi elektrona izmeu d-orbitala metalnog kationa (d-d prijelazi)

Nastankom kompleksa sa prijelaznim metalom, dolazi do interakcije

d-orbitale metala sa elektronskim oblakom liganda na takav nain, da
dolazi do razdiobe prethodno degeneriranih d-orbitala metala u orbitale
razliitih nivoa energije.
Kako je d-nivo djelomino popunjen, mogu je prijelaz elektrona iz
d-orbitale nie energije u d-orbitalu vie energije, uz apsorpciju zraenja
odreene energije.

39
Kompleksi s prijenosom naboja (prijelazi izmeu orbitala metala i liganda)

Udruivanjem dvije ili vie molekula, pri emu izmeu njih dolazi do
prijelaza dijela naboja, stvara se elektrostatska privlana sila koja
stabilizira nastali kompleks.
prijelaz naboja sa liganda na metal LMCT (ligand to metal charge transfer)
- ligand je donor elektrona, zbog nieg nivoa energije orbitala
- primjeri liganada: F-, Cl-, Br-, I-, H2O, OH- itd.

prijelaz naboja sa metala na ligand MLCT (metal to ligand charge transfer)

- metal je donor elektrona
- rjei, jer metal radije prima elektrone nego to ih daje
- ligandi akceptori: CO, NO, CN-, N2, C=C, CC itd.

UV/Vis spektri su jakog intenziteta ( 50 000)

40
UV/ Vis SPEKTROFOTOMETAR

Pojednostavljena shema dvosnopnog spektrofotometra:

(pogledaj na:
http://www.youtube.com/watch?v=O39avevqndU&feature=relmfu)

mono- referentni
---- -------- uzorak
----- detektor
kromator ------
izvor omjer
---- uzorak ----- detektor

izvor zraenja volframova lampa, deuterijeva

lampa
monokromator za izbor valnih duljina
dvosnopni jedan snop zraka prolazi kroz ispitivani
uzorak, a drugi kroz referentni uzorak (slijepa proba)
detektor fotoelija: mjeri intenzitet zraka
A = log I0 / I 43
 U kratkom vremenu, spektrofotometar skenira UV/ Vis spektar i na
detektoru registrira (nm) pri kojoj nastupa apsorpcija.

Otapalo koje se koristi ne smije apsorbirati UV/ Vis zraenje:

etanol, heksan, voda, CH2Cl2.

Kivete (drai za otopine uzorka) su izraene od kvarcnog stakla, koji

proputa UV/ Vis zraenje.

UV/Vis spektroskopija

42
 Nuklearna magnetska rezonancija (NMR): najmonija metoda za odreivanje strukture
organskih i anorganskih spojeva,

slino IR-spektroskopiji, NMR-analiza je izvediva s vrlo malom SJEVER

koliinom uzorka koji se pri tom ne oteuje,

NMR se koristi za analizu razliitih jezgri (1H, 13C, 15N, 19F i 31P), a
temelji se na njihovim magnetskim svojstvima, JUG

vodikov atom kao mali magnet 1H NMR,

Bo
igla na kompasu usmjerava se prema sjeveru, u smjeru Zemljinog vodikov atom usmjeren
suprotno u odnosu
na vanjsko magnetsko
magnetskog polja; prisilno usmjerenje prema jugu je nestabilno te se polje

igla, nakon otputanja, brzo izvre prema sjeveru, energija

rezonancije
vodikova jezgra (mali magnet), nakon izlaganja vanjskom mag. polju
Bo orjentira se u njegovom smjeru (stabilniji poloaj), ali je mogue, vodikov atom orjentiran
u smjeru vanjskog
vanjsko
izlaganjem dodatnom elektromagnetskom zraenju Brf, postii i magnetsko polje
magnetskog polja

izvrtanje u suprotnom smjeru (nestabilniji poloaj),

frekvencija zraenja Brf, potrebna za izvrtanje jezgre ovisi o jakosti vanjskog magnetskog polja, a odgovara
frekvenciji radiovalova (radio frequency, rf),

izvrtanje jezgre iz jednog magnetskog usmjerenja u drugo primjenom radiovalova naziva se

rezonancijom.
 Teorija NMR

Jezgre s neparnim atomskim brojem ili neparnim masenim brojem imaju nuklearni spin koji se moe
detektirati NMR-spektrometrom (engl. spin, brzo okretanje zvrka, okretanje oko svoje osi),

spin se moe vizualizirati kao rotirajua lopta pozitivnog naboja

(takvo gibanje naboja izgleda kao tok struje u ianoj petlji),
spin generira magnetsko polje B (magnetski moment) nalik
polju malog ipkastog magneta,
 nakon umetanja u polje veeg vanjskog magneta
Bo, dolazi do izvrtanja malog ipkastog magneta i
njegovog izravnavanja u smjeru vanjskog polja
(paralelno) stabilniji poloaj,

isti se efekt postie umetanjem protona u vanjsko

magnetsko polje Bo; magnetski moment protona
usmjerava se paralelno u odnosu na vanjsko polje
(-spin, stabilniji) ili antiparalelno (-spin, manje
stabilan),

u odsutnosti vanjskog polja, protonski magnetski

moment ima nasuminu orjentaciju; primjenom
vanjskog polja Bo postie se - ili -spin (vie -
spina jer je stabilniji).
 rezonancija: kada se jezgra usmjerena u pravcu polja B0 izloi djelovanju elektromagnetskog
(radiofrekventnog) zraenja Brf ija frekvencija odgovara maloj energetskoj razlici izmeu - i -spina,
dolazi do izvrtanja jezgre iz - u -spin; slijedi relaksacija i ponovno usmjeravanje u pravcu polja pri emu
se emitira elektromagnetski signal kojeg biljei NMR-spektrometar,

energetska razlika izmeu spinova proporcionalna je jakosti vanjskog mag. polja B0,

apsorpcija RF zraenja uzrokuje spin nukleusa

-spin, vie energetsko stanje
nie energetsko stanje
-spin
E=h =h B0
2
E = razlika u energiji izmeu - i -spina,
h = Planckova konstanta
= frekvencija polja Brf (frekvencija
rezonancije)
= iromagnetski omjer, konstanta ovisna
o magnetskom momentu ispitivane jezgre

NMR-spektrometar opremljen magnetom ije je mag. polje

B0
jakosti 7.046 T, podrazumijeva frekvenciju rezonancije 300 MHz:
 do sada su razmatrani ogoljeni protoni; u organskim molekulama protoni nisu ogoljeni, ve su okrueni
elektronima koji ih djelomino zaklanjaju od utjecaja vanjskog magnetskog polja,

elektroni se gibaju, generirajui mala lokalna (inducirana) magnetska polja koja se orjentiraju suprotno u
odnosu na primijenjeno vanjsko polje
primijenjeno mag. polje
(ako se dva magneta postave u neposrednu blizinu, (vanjski magnet)
lokalno zasjenjujue mag. polje
sjeverni pol jednog magneta usmjerava se prema (inducirano gibanjem elektrona)

junom polu drugog magneta!),

na taj se nain lokalno mag. polje inducirano

gibanjem elektrona suprotstavlja vanjskom mag.
Befektivno = Bprimijenjeno Blokalno
polju B0, odnosno titi ili zaklanja jezgru od utjecaja efektivno mag. polje
(kojeg jezgraosjea)
jakog vanjskog polja (to je vea elektronska
gustoa oko protona jae je lokalno polje, a
ovi protoni jae osjeaju ovi protoni slabije osjeaju
smanjen je utjecaj vanjskog primijenjenog polja, vanjsko mag. polje vanjsko mag. polje

odnosno proton osjea slabije efektivno mag.

polje), odsjenjena zasjenjena
jezgra jezgra
zbog slabijeg polja kojeg zaklonjeni proton
stvarnoosjea (Befektivno), primijenjeno vanjsko
JAKOST POLJA
polje mora se pojaati da bi se kompenzirao
FREKVENCIJA
inducirani efekt zaklanjanja,
 kad bi svi protoni u molekuli bili jednako zaklonjeni, njihova rezonancija bi se dogaala pri istoj frekvenciji
i jakosti magnetskog polja i vidjeli bismo samo jedan signal,

protoni su u razliitom kemijskom okruenju razliito zaklonjeni, te se i njihove rezonancije razlikuju,

u MeOH elektronegativni atom kisika odvlai primijenjeno mag. polje lokalno zasjenjujue mag. polje
(vanjski magnet) (inducirano gibanjem elektrona)
elektrone iz veze s hidroksilnim protonom, zbog
ega su protoni iz metilne skupine jae zaklonjeni u
efektivno mag. polje
odnosu na hidroksilni proton, (kojeg jezgraosjea)

zasjenjeni, apsorbiraju
pri viem polju
odsjenjeni, apsorbiraju
pri niem polju

zbog slabije zaklonjenosti (zasjenjenosti),

hidroksilni proton apsorbira pri slabijem polju u
odnosu na metilne protone (kaemo da je
hidroksilni proton odsjenjen),

JAKOST POLJA
 NMR-spektrometar

Sastoji se iz etiri glavna dijela:

1. magnet koji stvara magnetsko polje,
2. odailja elektromagnetskog zraenja (RF-
transmitter) koji emitira radiozraenje frekvencije
dostatne za izvrtanje spinova,

3. detektor: zajednikim djelovanjem vanjskog magnetskog polja i radiozraenja jezgre se

perturbiraju, odnosno prelaze iz paralelnog u antiparalelno stanje; nakon to se energija koju jezgra
apsorbira izjednai s razlikom energija - i -spina, postignut je uvjet za NMR. Energija se apsorbira
zakretanjem jezgre iz jednog stanja spina u drugo; apsorpciju i potom emisiju energije biljei
detektor,

4. pisa: NMR-spektrometar mora varirati

jakost magnetskog polja i iscrtavati graf
koji prikazuje ovisnost apsorbirane
energije o jakosti vanjskog magnetskog
polja spektar.
 1H NMR-spektar prua sljedee informacije:

1. Broj signala odgovara broju razliitih vrsta vodikovih atoma u molekuli.

2. Poloaj signala (kemijski pomak) ukazuje o kojoj se vrsti vodikovih atoma radi.
3. Povrina ispod signala odgovara broju vodikovih atoma odgovarajue vrste.
4. Cijepanje signala upuuje na broj susjednih vodikovih atoma.

tri signala

etiri signala

KEMIJSKI POMAK

dva signala JAKOST POLJA

 Kemijski pomak: poloaj u NMR-spektru pri kojem nastupa rezonancija ovisno pojedine jezgre,
o njezinoj okolini (zasjenjenosti),
uvijek se definira u odnosu na neki standardni rezonancijski signal iji se nulom poloaj oznaava
(TMS, tetrametilsilan),

u molekuli TMS-a [(CH3)4Si], metilne skupine su

bogatije elektronima te su njihovi protoni
zasjenjeni (Si manje elektronegativan od C);
apsorbiraju pri viem polju u odnosu na veinu
protona vezanih za ugljikov ili druge atome, pa
se veina NMR signala javlja pri niem polju
(lijevo) u odnosu na signal TMS,

kemijski pomak pojedinog protona: udaljenost njegova signala od signala TMS-a,

izraava se u ppm (parts per million)

pomak ulijevo od TMS-a (Hz)

kemijski pomak (ppm) =
ukupna frekvencija spektrometra (MHz)
 Utjecaj elektronegativnosti na kemijski pomak: klor odsjenjuje proton
privlaei elektrone; odsjenjeni protoni rezoniraju pri niem polju,
odn. imaju vii kemijski pomak,

s porastom elektronegativnosti
atoma vezanog na metilnu skupinu
smanjuje se njezina zasjenjenost,
odn. raste kemijski pomak,

utjecaj elektronegativnog atoma na

kemijski pomak raste s poveanjem
broja elektronegativnih atoma, a opada
s poveanjem udaljenosti od
promatranih protona,
 Dijamagnetska anizotropija
Neuobiajeni kemijski pomaci vodikovih atoma vezanih s sp2-hibridiziranim C-atomima tumae
se dijamagnetskom anizotropijom,
-elektroni se pod utjecajem vanjskog mag. polja
gibaju kruenjem, inducirajui mag. polje koje
utjee na kemijski pomak protona,
mag. polje, inducirano kruenjem -elektrona u
benzenskom prstenu, usmjereno je u podruju gdje
su locirani protoni jednako kao i vanjsko mag. polje

protoni osjeaju pojaano polje,

mag. polje, inducirano kruenjem -elektrona u
molekuli alkena, u podruju gdje su locirani protoni
vezani za sp2-hibridizirani C-atom, usmjereno je
jednako kao i vanjsko mag. polje protoni osjeaju
pojaano polje,

kako je frekvencija rezonancije proporcionalna

jakosti efektivnog mag. polja, ovi protoni koji

osjeaju pojaano polje rezoniraju pri viim

frekvencijama, odnosno imaju vii kemijski pomak,

 Utjecaj vodikove veze na kemijski pomak

Kemijski pomak OH protona u alkoholima i NH protona u aminima ovisi o koncentraciji,

u koncentriranim otopinama, ovi su protoni odsjenjeni vodikovim vezama, te apsorbiraju pri niem
polju (vodikova veza izduuje vezu OH i reducira gustou valentnih elektrona oko protona,

odn. odsjenjuje ga i pomie njegov signal u nie polje),

R

ukoliko se alkoholi ili amini razrijede otapalom s kojim ne mogu

R O
uspostavljati vodikove veze, kidaju se postojee intermolekulske veze, te O
H
njihovi protoni apsorbiraju pri viem polju,

zbog ovisnosti kemijskog pomaka o koncentraciji i otapalu, ponekad je teko zakljuiti odnosi li se
postojei signal u NMR spektru na OH odn. NH protone,

nakon dodatka deuterirane vode dolazi do izmjene

protona:

u naknadno snimljenom spektru signal izmjenjivog

protona se gubi ili se jako smanjuje njegov intenzitet
(atom deuterija nije vidljiv u 1H NMR spektru!),
 Cijepanje signala spregom spinova
NMR-spektri ne sadre samo pojedinane signale; najee su u spektru prisutni viestruki
signali - multipleti,

multipleti su izvor vanih informacija o strukturi spoja.

singlet dublet triplet kvartet pentet sekstet septet

dublet dubleta triplet dubleta kvartet tripleta

Kako dolazi do nastanka multipleta?

Proton je u NMR-spektrometru istovremeno izloen utjecaju vanjskog magnetskog polja i induciranog polja
elektrona koji ga zasjenjuju,
ako u blizini ima drugih protona, njihova mala magnetska polja takoer utjeu na apsorpcijsku frekvenciju
promatranog protona,
signali se cijepaju u multiplete kada su dvije razliite vrste protona dovoljno blizu da mogu
osigurati interakciju njihovih magnetskih polja; za takve protone kaemo da su magnetski
spregnuti.
 Uzrok cijepanja signala?
Spinovi dviju jezgri spreu se kad je kemijski pomak jedne jezgre pod utjecajem spina druge jezgre,

razmatramo neekvivalentne protone (protone s razliitim kemijskim

okruenjem) Ha i Hb na susjednim C-atomima,

Ha je pod utjecajem slabog magnetskog polja Hb; orjentacija polja jezgre Hb moe biti u smjeru polja Ha ili
suprotna smjeru polja Ha DUBLET!

magnetsko polje jezgre Hb usmjereno je suprotno vanjskom polju

jezgra Hb zasjenjuje jezgru Ha Ha apsorbira pri viem polju,

magnetsko polje jezgre Hb usmjereno je kao i vanjsko polje jezgra Ha osjea

blago pojaano ukupno polje odsjenjenje jezgre Ha i pomak njezinog signala
u nie polje,
 N + 1 pravilo

Signal protona cijepa se tako da je broj vrhova za jedan vei od broja

ekvivalentnih susjednih protona (N),

relativni odnos intenziteta signala u multipletu dan je Pascalovim trokutom:

Broj ekvivalentnih Pascalov trokut

protona koji Broj signala (omjer intenziteta signala)

uzrokuju cijepanje
0 1 (singlet)

1 2 (dublet)
2 3 (triplet)
3 4 (kvartet)
4 5 (kvintet)
5 6 (sekstet)
6 7 (septet)
 Konstanta
sprege

Konstant sprege (J), udaljenost izmeu

a
vrhova istog signala i izraava se u
Hz,
u vicinalnim sustavima tipa HaCCHb,
sprega Ha s Hb (Jab) mora biti jednaka sprezi Hb
s Ha (Jba) razmaci izmeu vrhova su jednaki,

signali protona koji cijepaju jedni druge uvijek imaju

jednake konstante sprege, to nam pomae u odreivanju
protona pozicioniranih na susjednim poloajima.
 13C NMR-spektroskopija

Omoguuje detekciju ugljikovih atoma,

13C NMR-spektroskopija manje je
osjetljiva od 1H NMR-spektroskopije
(samo je 1% ugljikovih atoma u uzorku u
stanju 13C izotopa; iromagnetski omjer

za 13C iznosi tek iromagnetskog

omjera za proton), stoga su signali
ugljikovih atoma slabiji od signala

protona, te 13C NMR-spektroskopija

zahtijeva dulje vrijeme snimanja uzorka,
12C ima paran broj neutrona i protona
(nema magnetski spin i ne moe dati
NMR-signal),

13C izotop ima neparan broj neutrona

(ima magnetski spin!),
 2D NMR-spektroskopija

1H NMR-spektri kompleksnijih molekula

esto sadre preklopljenje signale koje je
teko asignirati,
2D NMR-spektri pruaju informacije o
vezama i odnosima atoma u molekuli,
COSY (Correlation Spectroscopy):
metoda za otkrivanje homonuklearnih
korelacija kroz susjedne veze,
NMR u prehrambenoj tehnologiji, biotehnologiji i
nutricionizmu

Okus, miris i izgled hrane (kriteriji vani potroaima) u vezi su s

fizikalno-kemijskim svojstvima hrane,
NMR koriten u kvantifikaciji fizikalnih i kemijskih svojstava
hrane predstavlja mono orue za unapreenje kvalitete
hrane,

primjena NMR u prehrambenoj tehnologiji i znanosti o hrani:

o odreivanje masti, vlage i eera u prirodnim proizvodima
(zrelost i kvaliteta voa i povra),

o sadraj ulja i vlage u itaricama,

o odreivanje masti i vlage u preraenoj hrani (pekarskim
proizvodima), utvrivanje autentinosti vonih sokova i
vina, kontrola kvalitete biljnjih ulja, karakterizacija proteina
i eera, ...

primjena NMR u biotehnologiji omoguuje istraivanje faktora

kljunih za bioloku aktivnost (struktura biomakromolekula,
dinamika reakcija i molekulsko prepoznavanje), te razvoj
lijekova.