articulos LA BIODEGRADACION ANAEROBIA DE COMPUESTOS AROMATICOS (BTEX) Wiverth Vilatoro Monzén’, Ana Ma, Mesta Howard y Ellas Razo Flores! ‘Programa de Biotecnologia del Petréieo, Instituto Mexicano del Petréleo. Eig Central Lazaro Cardenas 152, C.P. 07730, Mexico DF. Tel. 52 (58) 20 03 69 13 ‘Escuela Nacional de Ciencias Biolégicas, Departamento de Microbiologia, |.P.N., rol. de Carpio y Plan de Ayala. México, D.F.C.P.11340, ‘emolk: wom. imp@hotmal. com" Palabras clave: Nitrato, Suifeto, Reduccién de Fe(II) y Mn(IV), Metanogénesis, Keywords: Nitrate, Sulphate, Fe(III) and Mn(IV) reduction, Methanogenesis Resumen EI benceno, tolueno, etilbenceno y los isémeros del xileno (BTEX), son hidrocarburos volétiles monoarométicos, que se encuentran en el petréleo crude y derivados como Ia gasolina. Los BTEX son producides a gran escala como materia prima para varias industrias. Son una de las principales causas de contaminacién ambiental debido a las frecuentes fugas y derrames de combustibles. La contaminacién de ambientes subterréneos por BTEX es dificil de eliminar, ya que estos compuestos son relativamente solubles en agua, y se difunden répidamente en los aculferos. Generalmente, se utiliza la biorremediacién in situ para la eliminacién de BTEX de los sistemas contaminados, La degradacién anaerobia de BTEX es importante, ya que tales condiciones pueden facilmente ‘encontrarse en sedimentos de los cuerpos de agua, aguas subterréneas y en el suelo, La biodegradacién anaerobia de BTEX ha sido reportada en condiciones de metanogénesis, reduccién de nitratos, sulfatos, Fe(ill) y Mn(IV). Las rutas de biodegradacién del benceno, tolueno y etilbenceno solo se ‘conacen bajo condiciones de reduccién de sulfatos 0 nitratos, pero se desconocen las rutas de degradacién de los xilenos. Abstract Benzene, toluene, ethylbenzene, and xylene isomers (BTEX) are volatile monoaromatic hydrocarbons, Which are found in crude oil and derivates such as gasoline. The BTEX are produced on a large scale as bulk chemicals for many industries. They are some of the major cause of environmental pollution because of widespread occurrences of fue! leakage and spills. ‘Contamination of groundwater with BTEX compounds is difficult to eliminate, because these compounds are relatively soluble in water and diffuse rapidly once introduced into the aquifers. Generally, techniques for in situ bioremediation of BTEX compounds are used to eliminate them from contaminated sites, Anaerobic fate of BTEX compounds is important because these compounds are frequently found in sediments of natural bodies of water, groundwater and sometimes soi BIOTECNOLOGIA 2002 VOL. 7 No. 3 izarticulos Anaerobic biodegradation of BTEX has been reported under methanogenic, sulphate, nitrate and Fe(lll) and Mn(IV) reducing condition. Anaerobic biodegradation pathways of benzene, toluene and ethylbezene are only know under sulphate or nitrate reducing conditions, but biodegradation pathways of xylenes are unknown. ORIGEN Y PRODUCCION DE AROMATICOS: La industria petrotera, que incluye entre otras 2 fa petroquimica, es fuente de la mayorla de los productos quimicos en uso, siendo la gasolina uno de los derivados de esta industria que en mayor cantidad se produce y consume. En México las ventas diarias de gasolina son en promedio de 647 400 barriles (Pemex Petroquimica, 2001). La gasolina esta constituida aproximadamente por 70% de compuestos aliféticos saturados y 30% son hidrocarburos aromatics como el benceno, tolueno, etilbenceno, ¢ isémeros del xileno (en su Conjunto se denominan 8TEX), ademas de aditives Oxigenados como el met Hbutil éter (Hartley & Englande, 1992), ‘A escala mundial y especificamente en México, la industria petrolera es una de las mayores productoras, con capacidad actual instalada de 13.2 millones de toneladas de petroquimicos al ato (Pemex Petroquimica, 2001), por lo que cualquier {reccién relativamente pequefia que escape durante los procesos productives, de manejo, transporte, distribuci6n o consumo significa grandes cantidedes de compuestos que entran al ambiente, contaminando agua, aire y suelo (Swoboda- Colberg, 1996). ‘Actualmente existen reportes de la Agencia de Proteccién Ambiental de los Estados Unidos de Norteamérica (EPA), sobre la presencia de altas concentraciones de hidrocerburos en agua, aire y suelo debidos a derrames y fugas. En especial, el benoeno ha sido considerado por la misma agencia como altamente carcinogénico ain 2 bajas ‘concentraciones (Shen, 1998). Los BTEX son relativamente solubles en agua, por tanto son muy moviles en aculferos, prevaleciendo més tiempo en los sedimentos (Collins & Daugulis, 1999). Por fo anterior es de interés conocer cual es el destino de ‘estos contaminantes después de que son liberados. ‘al ambiente. Sin lugar a duda, los procesos de transformacién microbiana son uno de los mas importantes. ‘TRANSFORMACION MICROBIANA En general, los compuestos aromaticos sufren una gran serie de transformaciones quimicas y biolégicas tan pronto son dispuestos al ambiente. ‘Aunque las transformaciones quimicas son generalmente parciales, los microorganismos pueden —mineralizar_ completamente —_ estas moléculas. Por tanto, la biotransformacién es uno de los procesos que determinan su eliminacién del ambiente, y esto se aplica tanto en condiciones. aerobias como anaerobias (Deeb & Alvarez-Cohen, 1999). La transformacién microbiana_depende principalmente de las caracteristicas quimicas y estructurales del compuesto a degradar, de los microorganismos implicados y de ios factores ambientales como temperatura, pH, potencial redox, salinidad, etc, La degradacién también es influenciada por la concentracion y disponibilidad de otras fuentes de carbono y energia, presencia de donadores y aceptores de electrones, nutrientes esenciales, humedad y ausencia de compuestos en . BIOTECNOLOGIA 2002 VoL. 7 No. 3concentraciones t6xicas (Grbic-Galic, 1990) Finalmente, el oxigeno determina la via metabélica posible de degradacion (Zehnder & Svensson, 1986). Sin embargo, algunas veces, las transformaciones microbianas sélo dan lugar a cambios estructurales pequefios, que pueden conducir a ta formacién de productos que son atin mas peligrosos al ambiente La biodegradacion aerobia de BTEX ha sido ampliamente estudiada (Thomas & Ward, 1989), no siendo asf en condiciones anaerobias, sin embargo, se ha reportado la degradacion eficiente de algunos aromaticos. La concentracién excesiva. de contaminantes en los ambientes naturales, los convierte répidamente en anaerobios por el agotamiento del oxigeno, por lo tanto es posible que predominen jas bacterias anaerobias, que generaimente uliizan aceptores finales de electrones como NOx, Mn, Fe, SO." 0 CO: para Ja metanogénesis (Wilson & Bouwer, 1997). BIODEGRADACION ANAEROBIA DE COMPUESTOS AROMATICOS Durante la degradacion microbiana de hidrocarburos aromatics bajo condiciones aerobias, el oxigeno sirve no sbio como aceptor final de electrones en Ias reacciones metabélicas, también puede ser incorporado al anillo aromatico por mono y dioxigenasas (Fuchs et al., 1994). Puesto que el oxigeno molecular no puede ser Incorporado a ta estructura del anillo aromatico en condiciones anaerobias, se utilizan mecanismos metabdiicos diferentes para su degradacién (Fig. 1). Bajo condiciones anaerobias, la funcién del oxi ‘como aceptor final de electrones ta asumen otros articulos ‘compuestos como NOs, Mn“*, Fe*, S0,7 0 COz, ‘que pueden considerarse como una altemnativa, por lo tanto tos primeros pasos de la degradacién son diferentes Los compuestos aromaticos. son extremadamente estables, debido a que en su estructura aromética tienen enlaces de! tipo carbono-carbono (Aihara, 1992). De acuerdo con Fuchs et al, (1994), la degradacién anaerobia de ‘compuestos aromaticos solubles se lleva a cabo en tres pasos (Fig. 1). Primero, los compuestos arométicos quimicamente ineries se activan por medio de carboxilaciones, _hidroxilaciones, reducciones, _deshidroxilaciones_reductives, desaminaciones, deshalogenaciones anaerobies, etc., dependiendo del sustituyente del anilo, con la formacién de CoA de écidos aromaticos. Segundo, los compuestos arométicos se transforman a intermeciarios centrales disponibles para el ataque reduetivo al niicleo aromético (Holger & Zehnder, 1986). Estos dos primeros pasos estan restringidos al uso de COz, agua, coenzimas oxidadas o reducidas, ATP y tioésteres de CoA de dcidos _arométicos. Los intermediarios arométicos centrales (benzoi-CoA, benzoato, resorcinol) son atacados, ‘enzimaticamente por las reductasas. Tercero, los. compuestos resultentes son fécilmente degradados por f- oxidacién y finaimente son transformados a ‘compuestos més simples por medio de reacciones hidroliticas, alicicicos BIOTECNOLOGIA 2002 VOL. 7 No. 3 2Transformacion Ac intermediaries Reduceiéa o, = o-56-0 Carboxiinién, Hidrataciéa, Deshidrosiiseléa red, Deshalogensciéa, Nitroreduecsén Deshidratacion, Bie. yy Ry= OH, C1.CH,, COOH, NH, NOx FIGURA 1. Ruta articulos ‘aot Gy (pOridacon 3 Acatl-CoA + CO; de degradacién anaerobia de compuestos aromaticos hasta acetiI-CoA y COz segtin Holliger & Zehnder (1996). CONDICIONES REDOX EI empleo de la energia quimiéa por los ‘organismos implica reacciones de éxido reduccién, la base de este tipo de reacciones es la transferencia de electrones. La tendencia a ceder electrones y oxidarse varia de una sustancia a otra y a esta tendencia se le conoce como patencial redox (Brock et al., 2001). La degradacién de los _hidrocarburos arométicos por bacterias anaerobias depende basicamente de la capacidad que tengan para utilizar aceptores finales de electrones diferentes al coxigeno. La presencia de un aceptor final de electrones con un alto potencial redox proveera a las bacterias, en teoria, de mas energla, respecto a un aceptor de electrones con potencial redox bajo. ‘Si un compuesto se puede degradar en presencia de un aceptor final de electrones, en parte depende de la cantidad de energia que obtendré durante la 10 reacci6n de 6xido/reduccién (Nealson & Myers, 1992), Por otra parte, la energia libre de Gibbs (4G") de la oxidacion de benceno y tolueno (Tabla 1) utilizando diversos aceptores de electrones, demuestra que todas las reacciones redox posibles, bajo condiciones estandares (25°C, 1M, 1 atmésfera y pH 7), son exergénicas. Lo anterior no determina que una reaccién pueda ocurrir, sélo demuestra que en estas condiciones la reaccion es. posible termodinamicamente (Langenhoff, 1997) En presencia de aceptores de electrones las Feacciones capaces de producir mas energia son més favorables (Oz, Fe™), a diferencia de las condiciones metanogénicas (COz) que son las menos favorables (Tabla 1). Hay evidencia de que la baja produccién de energia en estas condiciones da lugar lentas. Ademas, microorganismos no degradan siempre al a reacciones los BIOTECNOLOGIA 2002 VOL. 7 No. 3contaminante al que estan expuestos, es necesaria una fase de adaptacion. Se han propuesto varios mecanismos para explicar estos fenémenos, como la induccion enzimatica, crecimiento de una poblacién degradadora y modificacién genética para desarrollar nuevas vies metabdlicas. En condiciones de baja energia, estos procesos se realizan lentamente, ademas se ha encontrado que articulos la adaptacion de la poblacion microbiana anaerobia a los substratos toma generalmente un tiempo largo. En contraste, en condiciones con alta energia como en la reduccién de nitratos 0 sulfatos, la adaptacion es mas rapida y las bacterias reductoras: de nitratos pueden degradar una amplia variedad de substratos (Schink et al,, 1992). TABLA 1.- Energia libre de Gibbs (AG) de la oxidacion de tolueno y benceno con diferentes aceptores finales de electrones (25°C, 1M, 1 Atm y pH 7) [Stumm & Morgan, 1981]. “Reoptor final Toluen TAS) Bonceno (AG) de electrones kimot, kaimot, Coe Bi ze — soe 28 aa Feoorr 404 407 oe 03 36 Nos 8 1004 oO 108.3 1088 eee iiss FE(ily Y MN(IV) EN LA DEGRADACION DE BTEX fisicoquimicas de los aceptores finales de electrones, la reduccién de los éxidos metélicos es energéticamente mas favorable que la reduccion de los sulfatos y de! CO2 (Tabla 2). En los sedimentos la reduccién de sulfatos y la metanogénesis son inhibidos por la presencia de los éxidos metdlicos (Nealson & Saffarini, 1994). Actualmente, la degradacién de hidrocarburos arométicos bajo condiciones metanogénicas, reductoras de sulfatos (Harms et al., 1998) y nitratos se considera factibie (Fuchs et all, 1994; Rabus & Widdel, 1995), existiendo algunas cepas que han sido aisladas. Sin embargo, ‘8 sabe menos sobre el uso de los aceptores de electrones sélidos como el éxido de Fe(ill) y del ‘Min(IV) para la degradacion de aromatticos. Los metales como el fierro y el manganeso estan presentes en la corteza terrestre, en ambientes estuarinos y marinos donde las formas oxidedas del Feilll) y Mn(IV) se acumulan Principelmente como 6xidos @ hidréxidos. La reduccién microbiana de estos dos metales a Fe(tl) y Mnill) respectivamente, ocurre de forma natural en ambientes acuéticos con altos indices de carbono orgénnico (Loviey & Stollz, 1987). En la mayoria de los sedimentos acuéticos, suelos inundados y aculferos, la oxidacion de la materia organica esté acoplada a la accién de varios microorganismos reductores (Lovley, 1991). El Fe(tll y el Mn (IV) pueden servir como excslentes aceptores finales de electrones en un proceso de respiracion anaerobia por tener un potencial redox BIOTECNOLOGIA 2002 VOL. 7 No. 3 uwmuy préximo al del nitrato y por arriba del sulfato (Nealson & Myers, 1992). El Fe(III) es uno de los aceptores de electrones con més potencial para ta descomposicin de la materia orgénica en sedimentos acuéticos y ambientes subterréneos (Lovley, 1991). Durante los afios 80, la reduccién del Fe(lll) en los sedimentos se consideraba un proceso no enzimético, actualmente se sabe que en los ambientes anaerobios no sulfidogénicos ta reduccion del Fe(ltl) es el proceso més importante y que los microorganismos reducen el Fe({ll) enzimaticamente a Fe(ll) [Kieft et al., 1999}, Los microorganismos reportados que intervienen en la reduccién del Fe(tt: son Geobacter metallireducens (Lovley et al, 1993), Desufuromonas acetoxidans (Nealson & Seffarini, 1994), Magnetospirilum magnetotacticum (Lovley, 1993), Shewanella putrefaciens (Caccavo et al., 1992), varias especies de Desulfovibrio sp. (Coleman et al., 1993) y también algunas especies de Bacillus (Erhlich, 1996). La reduccién microbiana de Mn(IV) @ Mn(Il) es muy parecida a la reduccion de Fo(lll). La mayoria. de los microorganismos que reducen Feilil) también reducen Mn(1V) y viceversa, aunque ‘se han encontrado algunos microorganismos que reducen preferentemente al Mn (IV) [Erhlich, 1996}, ‘Ademas, el hecho de que Fe(ll) reduce répidamente al Mn(1V), significa que en la mayoria de los ambientes cualquier microorganismo que reduce al Feil) enzimaticamente reducira indirectamente al Mn(1V). Aunque a diferencia del Fe(ll), 10s nitratos no inhiben ta reduccion del Min(IV) [Ethlich, 1996}. Las cepas que han sido reportadas como feductoras de Mn(lV)_ son: Geobacter articulos metalireducens GS-15 (Lovley et al, 1993), 6. sulfurreducens (Caccavo et al., 1994), Desulfovibrio desuturicans, — Desulfonicrobium —_baculatum, Desuifobacterium autotrophicum y Desutfuromonas acetoxidans (Lovey & Phillips, 1994). Estos. microorganismos pueden _utiizar__ diferentes. substrates, de hecho G. metallireducens puede Uutlizar butirato, propionato, lactato, succinato y acetato y varios compuestos aromaticos que son oxidados completamente hasta CO; (Lovley, 1991). Algunos experimentos realizados bajo condiciones de reducci6n de Mn(IV) y Fe(lll) han demostrado la mineralizacion de compuestos que se consideraban recalcitrantes (Langenhoff, 1997; Puig-Grajales et al., 2000), BENCENO La degradacién anaerobia del benceno en condiciones metanogénicas fue reportada por primera vez por Grbic-Galic y Vogel en 1987, utiizando He'*O demostraron que el paso inicial para la degradacién del benceno es su transformacién a fenol, No se han aistado microorganismos que oxiden anaerébicamente al benceno, a pesar de que se ha reportado su degradacién por consorcios en condiciones de Teduccién de sulfatos (Loviey et al, 1995), reduccién de Fe(lll) [Lovley et al, 1994], metanogenesis (Vogel & Grbic-Galic, 1987) y reduccién de nitratos (Burland & Edwards, 1999). Aunque las rutas metabélicas on desconocidas, se ha propuesto que el benceno es transformado a benzoato (Fig. 2), un metabolito central via fenol bajo condiciones de reduccién de sulfatos y Fe(II!) [Caldwell & Suflita, 2000} 12 BIOTECNOLOGIA 2002 VOL. 7 No. 3articulos ————_________. ve FIGURA 2, Ruta propuesta para la degradacién anaerobia del benceno con la formacién de benzoato via fenol (Caldwell & Sufita, 2000). En estudios recientes realizados en un acuifero contaminado con petréleo, en Bemidji Minnesota, se reporté la degradacién in situ del benceno séio en ia zona reductora de Fe(II!) (Lovley et al., 1996]. Lo anterior con una estrecha relacion en cuanto a la presencia de microorganismos de la familia Geobacteraceae (Anderson et al, 1998), que incluye @ Geobacter sp. Gnico organismo reportado que realiza la oxidacién de hidrocarburos arométicos, incluyendo al tolueno por reduccién de FeiIll) (Coates ot al., 1996]. Los resultados sugieren que la composicién de la comunidad microbiana en. el aculfero Bemidji jugé un papel clave en la degradacién anaerobia del benceno y, en particular la familia Geobacteraceae, esté asociada con los, Procesos de degradacién de este compuesto (Anderson et al., 1998), Sin embargo, en estudios, més recientes del mismo aculfero, se ha evaluado la diversidad de otros grupos microbianos con métodos moleculares y se encontré que Geobacter ‘sp. est asociado con Geothrix sp. y Variovorax paradoxus en la degradacién del benceno y posiblemente acten como un consorcio (Rooney- Varga et al., 1999) BIOTECNOLOGIA 2002 VOL. 7 No. 3 TOLUENO El tolueno es el alquilbenceno mas facil de ‘degradar en condiciones enaerobias por lo que es ‘el mas estudiado, Desde 1990 se han reportaron cepas puras capaces de degradar tolueno en condiciones de reduccién de nitratos (Dotfing et al., 1990), reduccién de Fe(lll) {Lovley & Lonergan, 1990], reduccién de sulfatos (Beller et al., 1996) y condiciones metanogénicas (Edwards & Grbic- Galic, 1994), Los microorganismos reportados como degradadores de tolueno son Thauere aromatica (Leuthner & Heider, 1998), algunas cepas de Pseudomonas sp. (Hubert et al., 1998), Azoarcus {olulyticus (Chee-Sanford et al, 1995) y Mycobacterium sp. (Tay et al, 1998) ‘Se han propuesto varias rutas metabdlicas para la degradacién de! tolueno, fa mas reciente se muestra en la figura 3, se estableci6 baséndose en studios in vitro con dos bacterias desnitriicantes: Thauera aromatica y Azoarcus sp. Cepa T (Beller & ‘Spormann, 4997). En varias cenas degradadoras de tlueno se ha identificado al benzoato como un producto intermediario, por fo tanto se considera un hecho 13