TEMA 2: BIOLOGA DE LAS CLUASL EN CULTIVO.

INTRODUCCIN

Vamos a utilizar unas cluasl del crvix uterino donde se prodijo un tumor en la
sclulas epiteliales. Si hacemos un corte histolgico observamos un epitelio
estratificado queratinizado donde tenemos clulas unidas por una matrz
extracelular donde todo el tejido forma una polaridad muy clara. Todas estas
clulas las vamos a crecer en unas placas sobre un sustrato slido como el plstico
( no tiene nada que ver con la matriz extracelular). Podemos diferenciar la
estructura que tienen las clulas cuando forman el rgano de origen y cuando las
cultivamos a baja densidad , donde habr espacios entre ellas individualizadas. Y
cuando sube la densidad comenzara a parecerse s a la organizacin natural, peor
sigue siendo una mono capa de clulas.

Por tanto para hacer un cultivo celular hay que entender el medio y la disposicin (
la biologa celular)de las clulas en su medio natural para tratar de reproducirlo a
la hora de hacer cultivos. Y eso se tiene en cuenta ( la biologa celular) a al hora de
elaborar tanto instrumentos y reactivos para tratar de simular la biologa de las
clulas al mximo.

Cuales son las condiciones ambientales que van a determinar el

funcionamiento y la diferenciacin de las clulas y como podemos simularlas
in vitro.

1) Tensin de oxgeno: la tensin de oxgeno ( cantidad de O2 que hay) que tienen

las clulas in vivo ( en el organismo) es la que haya llegado en la matriz
extracelular y al medio extracelular a partir de los glbulos rojos. De manera que la
tensin de oxgeno que hay en los tejidos es muy baja excepto en los alveolos
pulmonares.

Como vamos a simular esa baja tensin de oxgeno? Las clulas en cultivo estn
sumergidas en un medio de cultivo, donde crecern en la base de la placa o flash y
ya por encima estar el medio de cultivo. Fuera del flash hay un 21% de oxgeno y
tiene unos tapones perforados con un filtro que permite el intercambio gaseoso, de
forma que dentro del frasco tendremos ese 21%. Pero aqu ese oxgeno no va a
poder difundir libremente por el medio de cultivo y cuanta ms sustancia ( medio)
haya ms le costar difundir a las clulas. De manera que cuando se disean los
flash de cultivo se hacen pensando en como optimizar la cantidad de medio que
vamos a gastar, pero que llegue tambin oxgeno a las clulas y por tanto simular
esa baja tensin de oxgeno. Por ejemplo en un flash pequeo se ponen 5 ml.
Tambin para simular esa condicin se utiliza un control de cuanto oxgeno hay en
el aire mediante incubadores de hipoxia que estn cerrados y que modulan la
concentracin de oxgeno. Algunas alteraciones genticas que se producen en los
embriones se pueden evitar usando eso ltimo. Por tanto o podemos controlar los
aditivos del medio o la concentracin de oxgeno del medio para simular la tensin
baja de O2.
2) Las clulas estn polarizadas , eso indica que pueden llevar a cabo funciones
diferentes en diferentes regiones. Para simular el invitro debemos recrear
sistemas que nos permitan una colocacin espacial de las clulas adecuada, para
que sigas siendo clulas polarizadas. Esto se llama scapof. Por ejemplo simular la
disposicin de las clulas seas en la trabculas, para ello creas unos andamiajes
basados en polmeros especficos para obtener una colocacin adecuada de las
clulas y simular su orientacin original.

3) Las clulas crecen sobre la matriz extracelular que contiene colgeno, laminina
y otras protenas. Para simular esas condiciones hay que tratar la superficie del
recipiente , como por ejemplo poner gelatina o colgeno al plstico y poder
colocar las clulas. Por otro lado las vitaminas, hormonas y factores de
crecimiento tambin son importante, puesto que baan la matriz extracelular. Para
recrear eso habr que aadir aditivos al medio de cultivo, seales de traduccin,
modificadores de cromatina como PMA y cido valproico.

4) Las interacciones clula-clula. Las clulas normalmente cuando son del mismo
tipo, a travs de gap junctions o factores homocrinos, reciben informacin de las
clulas vecinas. Por tanto en algunas ocasiones habr que hacer cultivos a
elevadas densidades para darse esos contactos y poder hacer los experimentos.

Adhesin celular

Tenemos diferentes molculas que llevan a cabo las uniones entre clulas y clulas
con el sustrato. Estas molculas o protenas determinan la adhesin celular celula-
clula llamadas caderinas que necesitan calcio.
Hay cuatro protenas transmembrana que estn involucradas in la adhesin celula-
celula y clula sustrato.

1) Las cadherinas que son Ca dependientes estn involucradas en conecsiones

entre clulas homlogas bien sea por las gap junctions ( cadherina E, N,P) o
va desmosomas. Los desmosomas unen los filamentos intermedios de una
 clula con los filamentos intermedios de la otra. Los complejos de unin
(clulas adherents) unen los filamentos de actina de una clula con los
filamentos de otra. En ambos participan como molcula de adhesin la
caderina. Las caderinas de los desmosomas son la desmogleina y
desmocolina.
Concretamente las caderinas son molculas homlogas que permite a
diferentes clulas unirse entre ellas. Por un lado las caderinas E,N,P y VE
conectan con los citoesqueletos de actina y llevan a cabo funciones de
sealizacin y estructural. Y por otro lado las cadherinas desmosomales se
conenctan va plakofilina, plakobilina y desmoplakina a los filamentos
intermedios del citoesqueleto y son las que median las uniones celula-clula
a travs de las uniones junctiond para peromitir que las clulas se
ensamblen en tejidos.
En general las cadherinas se activan en presencia de calcio y cuando este no
existe quedan sueltas y no producen unin clula-clula, por tanto en el
medio de cultivo para que se de esa unin necesitaremos calcio y si no
queremos que se unan eliminamos el calcio a travs de EDTA.

(A veces hay que re suspender las clulas en el medio de cultivo para

subcultivarlas, para ello hay que eliminar el calcio de l medio. Usamos un
lavado con una solucin salina ( Tampn fosfato) modificado sin clcio ni
magnesio DPBS. Por tanto lavaremos nuestras clulas con este tampn
DPBS y EDTA de forma que las uniones entre las clulas se relajan y se
separarn.

2) Las molecuals de adhesin independientes de clcio ( CAMs) como las

NCAM presentes en sinapsis neuronales y las ICAM que interaccionan con
las integrinas en sinapsis inmunologcas ( unin linfocitos a celula
presentadora de antgeno).
3) Las integrinas ( unen las clulas al sustrato a travs de complejos de unin
como hemidesmosomas ( unin de filamentos intermedis con sustrato) o por
medo medio de contactos focales que une los filamentos de actina con el
sustrato) que median la adhesin de la matriz, interacciona con molculas
como la fibronectina, laminina y colgeno. Estas tienen dos subunidades es
alfa y beta cuyos dominios extracelulares son altamente polimrficos cosa
que genera elevada variabilidad en cuanto a la cantidad de integrinas.Estas
dos subunidades que se unen a los filemntos de colgeno y de actina y esta
unin una vez realizada solo se deshace o libera a travs de seales
intracelulares. Estas seales no se pueden simular, de forma que usamos un
enzima que rompa todas las integrinas como la tripsina ( para separa las
cluals del sustrato una vez hayamos lavado con DPBS usamops esta
enzima que normalmente viene en presencia de EDTA ( quelar calcio).A la
tcnica de subcultivo o resuspensin de las clulas se llama tripsinizacin.
La tripsina no es especfica de las integrinas con lo cual rompe cualquier
tipo de protena o cadena polipeptdica, eso supone que cada ve que
hagamos un cultivo daaremos protenas de la clula con lo cual no
podemos dejar las clulas en tripsina durante un tiempo prolongado, con lo
cual la tripsinizacin es un proceso rpido y controlado. Las integrinas
conectan con la actina del citoesqueleto en adhesiones focales y enva
 seales al ncleo durante la adhesin celular y la proliferacin de tal forma
que permite entrar a las clulas en el ciclo.
4) Proteoglicanos transmembrana que contacta con los constituyentes de la
matriz como por ejemplo otros proteoglicanos o colgeno. Algunos de estos
actan como receptores de factores de crecimiento de baja afinidad y
estabilizan, activan y traslocan el factor de crecimiento a los receptores de
mayor afinidad. Adems participan en la dimerizacin. Prtoducen unionen
muy dbiles, por tanto liberamos las cluals por accin mecnica ( golpe).

Hay que conocer la makinaria de adhesin de nuestro cultivo para poder

trabajar correctamente con el porque a lo mejor si en esas uniones estn
implicads Ig, para separarlas a parte de tripsina hara falta algo ms.

Movimineto celular:

Cuando las clulas estn a baja densidad se pueden inr desplazando por nuestro
flask de forma que hay que hacer un seguimiento fotogrfico cada X minutos. El
movimiento es importante en el cultivo.

Contros de la Proliferacin celular:

La divisin celular se lleva a cabo a travs de unas etapas que en conjuto forman el
ciclo celular.
El cciclo celular es regulado por una serie de seales que provienen del ambiente.
La baja densidad celular permite que las clulas se dvidad y por tanto entrar en el
ciclo celular siempre y cuando haya factores de crecimiento mitognicos
(estimulador de la divisin) como el factor de crecimiento epidrmico ( EGF),
factor de crecimiento de fibroblasto o factor de crecimiento derivado de plaquetas
( PDGF) que interaccionen con los receptores de las clulas. La elevada densidad
inhibe la proliferacin por contacto celula-celula.
Por un lado el ontrol intracelular es regulado por factores positivos como las
ciclinas las cuales estn reguladas por cascadas de transduccin activadas por
fosforilacion de los dominios intracelulares de los receptores cuando se unen a
factores de crecimiento. Por otro lado los factores de accin negativa como la P53
o el gen del retinoblastoma Rb, bloquean la proliferacin celular en una serie de
puntos de control. La conecsion entre lo elementos de control extracelular (PDGF+
Y TGFB-) y el intracelular es llevada a cabo por los receptores de membrana celular
y las vas de trasduccion de seal que pueden involucrar fosforilaciones y
segundos mensajeros como Camp, Ca y diacilglicerol.

Hay dos elementos o dos momentos ( puntos de control) que la clula controla
para ver si se sigue dividiendo. El primero es el retinoblastoma Rb, si todo esta
bien Rb se fosforila gracias a una quinasa y la clula sigue en el ciclo celular. Si no
hay un estimulo o ambiente adecuado la guinasa no fosforila a Rb y el ciclo se para.
Por tanto hay que asegurarse de que el medio tenga mitgenos, grupos P y que las
condiciones ambientales sean favorables.
La celula una vez pasado el primer punto de control entra en la fase S de sntesis
donde se duplica el material gentico y al final de esta fase, la celula comprueba
que no haya dao en el DNA a taves del
segundo elemento de control, la p53. Es
una protena que comprueba si hay o no
dao en el DNA ( que esta en cadena
sencila), si lo hay detiene la divisin y
recluta a otros elementos como P21 que
repara el DNA a travs del recltamiento
de polimerasas que conferirn al DNA
su condicin de doble hebra. Se puede
conseguir reparar el DNA y si no, en
principio no sigue la divisin celular
pero en algunos casos como el cncer la
p53 esta mutada coa que provoca que
no se detecte el dao en el DNA y se
producir inestabilidad gentica y
proliferarn continuamente.

Diferenciacin celular

Las clulas tienen dos perfiles, con lo cual pueden llevar a cabo dos acciones:
proliferar o diferenciarse, pero no pueden hacer las dos cosas a la vez. ( Una de la
pocas cluasl que una vez diferenciada puede volver a dividirse y proliferar, son las
clulas de hgado, los hepatocitos. Sin embargo una vez que las clulas se han
diferenciado se da silenciamiento de genes y ya no pueden proliferar). Ahora se
puede sobre clulas diferenciadas, desdiferenciarlas. En el cultivo tambin se
puede hacer eso cuando no han acabado de diferenciarse.

Por lo general la mayora de celular en un cultivo estn proliferando. Pueden

diferenciarse cuando hay elevada densidad donde paran de proliferar por
inhibicin por contacto, las uniones por las caderinas dan diferenciacin, cuando
hay factores de crecimiento tambin se ve favorecida. Normalmente la
diferenciacin no es deseable con lo cual hay que mantener las clulas con un perfil
de proliferacin que consiste en mantener una baja densidad, mantenerlas con
factores de crecimiento y mitgenos en el medio.

Cuando las clulas se han inmortalizado pierden la inhibicin por contacto.

Las clulas en un cultivo pueden estn en un estado de equilibrio entre la

proliferacin y la diferenciacin. En condiciones normales ( baja concentracin
celular y mitgenos en el medio) predomina la proliferacin. Mientras que con
elevada densidad y con la adicin de factores de diferenciacin, predomina la
diferenciacin. El equilibrio depender de las condiciones de cultivo. La
desdiferenciacion del cultivo puede ser debito por los efectos de los factores de
crecimiento o de las citosinas.

Sealizacin celular

Las clulas se comunican entre ellas por medio del intercambio de molculas o
seales de diferentes formas. A travs de seales homocrinas (una clula enva
seales a otra que es igual), autocrinas, paracrinas (clulas diferentes) pero no hay
comunicacin endocrina. Puede haber sealizacin a travs del calcio. Y por
ejemplo las caderinas y los complejos de unin tambin se usan para comunicarse.

Energa y metabolismo de las clulas en cultivo.

Las clulas consumen glucosa como fuente primaria de energa como molcula
ms habitual. Esta se degrada por la gluclisis donde se obtiene ATP, hasta obtener
una molcula llamada piruvato y a apartir de el hay tres vas diferentes.
1) La fermentacin alcohlica que llevana acabo las levaduras.
2) En condiciones aerobias se da la va del cido ctrico
 3) En condiciones anaerobias se produce una fermentacin lctica
producindose como residuo el lactado.

Nuestras clulas en cultivo se comportan como si estuvieran en condiciones

anaerbicas porque estn sumergidas en medio de cultivo y el oxgeno difunde mal
en ese medio. Eso provoca que tengan un requerimiento en glucosa muy grande (
aadir mucha) para poder sobrevivir, con lo cual se aade priruvato para que su
metabolismo sea ms eficaz. Adems en esta va no se est produciendo acetil coA
y no se usa el ciclo de cido
ctrico ( Krebs) pero todas las
enzimas estn en la clula cono
lo cual podemos estimular a que
use ese ciclo, con lo cual
sustituimos el CoA por otro
sustrato, un aminocido, la
glutamina que lo metemos en la
mitocondria y se transforma en
glutamato y este ya va al ciclo
de Krebs. Por los medios de
cultivo hay que suplementarlos
con glutamina, pero esta es muy
inestable y se degrada
fcilmente. Por tanto los medios
de cultivo no se fabrican con
glutamina, hay que suplementar
con nueva glutamina.
Luego como fruto del metabolismo de las clulas se va a producir cido lctico y
por tanto el medio con el paso de los das el medio se va acidificando con lo cual
hay que renovarlo. Y la degradacin de aminocido producen cetocidos que
tambin deterioran el medio.

Senescencia y muerte celular. Apoptosis

Si tenemos unas clulas disgregadas en un cultivo, van a crecer durante un tiempo

limitado. La senescencia es un proceso que hace que las clulas sean menos
eficientes ya que acumulan daos en el material gentico. Eso en el cultivo lo
podemos evitar, mediante la trasformacin, haciendo que sean inmortales
mediante una modificacin en la telomerasa para que est activa.

Autocrina: sobre ellas miasma.

Homocrina: una segunda clula que esta cerca de la que le enva la seal es del
mismo tipo celular.
Paracrina: la que sealiza es de otro linaje celular diferente a la que recibe la seal.
TEMA 3

Como podemos establecer una lnea celular?

Dependiendo de que mtodos usemos en el

laboratorio usaremos un tipo celular u
otro. Debemos controlar diferentes
aspectos.
Para iniciar un cultivo celular se coge un
explante ( trozo de tejido y colocarlo en
una botella de cultivo y esperar que las
clulas caigan y comienzan a crecer) o
disgregamos las clulas de un tejido a
travs de enzimas.
En el cultivo celular habrn una serie de
etapas: Lo primero que sucede cuando
extraemos el explante el nmero de clulas
comienzan a disminuir ya que el dao
fsico o enzimtico algunas clulas mueren.
En este primer paso tenemos una
poblacin heterognea, con diferentes tipos celulares donde habr muertas, vivas
pero daadas y sin daar. A esta esta desde que coges por primera vez el cultivo y
lo colocas en la botella hasta que se adhieran y se dividen, eso se llama cultivo
primario. Solo a partir del primer subcultivo ( cuando levantas esas clulas y las
recojes en una suspensin y las llevas a otra botella) se habla de lnea celular finita
puesto que las clulas se dividirn un nmero de veces hasta que sus telmeros se
acorten y mueran. Se puede dar una transformacin donde hablamos de lnea
celular estable inmortal. En el laboratorio se trabaja con estas ltimas.

Cuando hablamos de cultivo celular, nos referimos a una poblacin.

Continuacion del tema.

Como iniciamos un cultivo celular y que pasa durante ese proceso. Hay una serie
de fases que son muy importantes tnto para el establecimiento como para la
seleccin de la lnea celular. Para comprender esto tenemos diferentes conceptos.

Cultivo primario: Cuando extraemos del organismo las clulas y las ponemos en un
medio de cultivo de forma in vitro, bien sea por disgregacion o por explante, en un
medio adecuado en cuanto a su temperatura, ph.
Lo que caracteriza un cultivo primario es que se trata de una poblacin
heterognea puesto wue habran cerluas que habrean sufrido dao y hayan muerto
otras que han sufrido dao pero que pueden repararlo y otra poblacin qu esta
sana. Ademas cuadno extraemos las clulas, no solo hay un tipo celular.
Hay una serie de factores que van a determinar que tipo de poblacin tenemos y
cuales de esas clulas de esa poblacin vayan a proliferar y cuales no. Puesto que a
partir del momento en que nosotros establezcamos un cultivo primario se va a dar
una competencia entre los diferentes tipos celulares que hay.

Entonces lo que va a determinar que crezca una poblacin u otra en un cultivo o

explante primario ser:

Durante la fase de aislamiento: la cantidad de dao que tengan-

En el cultivo primario: la capacidad de proliferacin, puesto que no todas lo hacen
al mismo tiempo. Otro factor seria la migracin celular: por ejemplo hemos cogido
un explante de tejido y lo hemos sembrado en el flask de cultivo, alrededor del
tejido van a empezar a cr3ecer clulas, de forma que el sustrato no va a estar
disponible. Entonces si la clula tiene capacidad de migracin, podr encontrar
nuevo sustrato y proliferar antes. Pero si queremos seleccionar una lnea celular
que se divide cada 20h y tenemos otra que lo hace cada 6 y adems hay que estar
pendiente y controlar el cultivo, puesto que si tu lnea celular no es la mejor dotada
para dominar en ese cultivo habr que seleccionarla de alguna manera.

Una vez que hemos dejado que proliferen las clulas y se adapten al nuevo medio,
vamos a hacer un subcultivo. Donde las clulas que estn pegadas por las
molculas de adhesin, vamos a romper esas uniones, resupender las clulas y
sembrarlas en una menor concentracin en una nueva botella de cultivo.

Y a partir de ah mi cultivo se ha convertido en una lnea celular que es finita (

donde seleccionamos la lnea celular que interesa) puesto que sus clulas se van a
acortar los telmeros. Despus del subcultivo lo que conseguimos es que, la
poblacin celular comience a homogenizarse. Puesto que cuando empezamos a
hacer el subcultivo aquellas clulas que haban nmero las vamos a lavar. Cuando
tripsinizamos, la tripsina rompe el resto de protenas con lo cual eso nos vale para
seleccionar, porque aquellas que son sensibles a la tripsina van a ir mas retrasadas
y si se recuperan bien son las primeras en proliferar.

Ahora a partir de ah ( de la lnea celular finita), sabiendo las caractersticas de

nuestra clula, podemos dejarla que compita ( porque sabemos que es el mejor
tipo celular que se adapta despus de la tripsinizacion y tiene una proliferacin
rpida). Y sino usamos algn mtodo de seleccin, como la limitacin en los
nutrientes para limitar alguna va metablica, inducir susceptibilidad a
antibiticos

Legara un momento en que esas clulas, gracias a sus ciclos de divisin las vamos
seleccionando, podremos obtener una poblacin homognea deseada. A partir de
ah necesitamos hacer que esa lnea celular en concreto sea inmortal, es decir
transformar la lnea celular, activando su telomerasa y modificar el metabolismo
para convertirla en una lnea celular estable. Por tanto el paso de lnea celular
finita a estable se consigue con la transformacin.

Para conseguir la transformacin, es necesario de la activacin de las telomerasas.

DEsta esta activa durante el desarrollo embrionario, en las clulas germinales y en
las clulas troncales, pero en el resto de clulas del organismo esta inactivo por
tanto sufren senescencia y muerte celular. A no ser que esas clulas troncales
adultas se conviertan en clulas tumorales o que se conviertan en una lnea celular
estable in vitro. La transformacin a veces puede ser instantnea como en el caso
de las clulas Hela, que fueron infectadas por el virus del papiloma que activo la
telomerasa. La transformacin parte de ser inmortalizacin, es generar un control
aberrante del crecimiento. Hay clulas que una vez que contactan con ellas para
generar un tejido y tienen inhibicin por contacto, pero unas clulas tumorales
pierden la inhibicin por contacto y siguen creciendo. En un cultivo in vitro
sabemos que las clulas han perdido las inhibicin por contacto y se han
transformado, porque cuando estas contacte intentaran hacer varias capas de
clulas despus de haber ocupado todo el espacio. Adems las clulas
transformadas, adquieren malignidad, que es la capacidad de invadir los tejidos y
proliferar en otros tejidos. Para comprobar la malignidad se utilizan ratones Nute
que estn inmunosuprimios. Un defecto de la inmortalizacin, es que como se
relajan los mecanismos de control del ciclo celular y del dao sobre el DNA, se
produce inestabilidad gentica. Por tanto hay que ir chequeando para que no se
den nuevas mutaciones que cambie el funcionamiento de las clulas.

Como podemos transformar las clulas? Cuando empez el establecimiento de

lneas celulares se vio que se producan esas transformaciones celulares por la
infeccin vrica. Por ejemplo el virus del papiloma humano, Epsteinbar, SV40 son
los mas utilizados en la transformacin celular. Todos ellos contienen protenas
que activan la telomerasa y otras vas de sealizacin celular y otros genes que
llevan a ala inmortalizacin. Estos virus que se utilizan, estn atenuados.
Incluso se utilizaba, la transfeccion de aquellos genes que producan la
transformacin. Desde los 50 hasta los 80 se usaban virus, pero a partir de ah era
mas usual la transfeccion. Hoy en da se hace usando la activacin de un gen
recombinante de la telomerasa. Se coge un gen activo de la telomerasa que este
regulado de forma diferente de tal forma que no se silencie la telomerasa.

Aparitr de aqu, vamos a atener una poblacin de clulas homogneas

inmortalizadas. Pero eso todava no es una lnea celular que se pueda depositar en
un banco de clulas y se pueda usar por otros investigadores. Hace falta hacer un
clon, de forma que cualquier lnea celular proviene de una nica clula que ya
haba sido transformada o inmortalizada. Porque sino siempre va a haber algo de
variacin. Entonces una vez inmortalizadas las clulas, cogemos una de ellas y la
clonamos, hacemos que prolifere y luego congelamos y la depositamos en un
banco.

La lnea celular Hela no tiene virus, pero tiene genes del virus del papiloma
humano. Hay que tener un control de las clulas para que no se contaminen con
otros virus y ya nos infecte en la manipulacin.