Protenas II

Purificacin de protenas
Victor Castro
04/08/17
Consideraciones para purificar protenas:
- Qu peso tiene la protena?
- Punto isoelctrico/isoinico: ayuda a saber que carga neta tiene la protena. Al ponerlo en ph 8
y tiene un PI 7, la protena estar negativa.
- Solubilidad: con que concentraciones de sal la protena es ms soluble o precipita.
- Estabilidad: a que ph la protena es ms estable.
- Temperatura
- Mtodo de deteccin
EM: no es necesario tener tan pura la protena
estudios estructurales: sobre 98% de pureza
terapia: sobre 99,9% de pureza
Purificaciones:
- Extraccin: centrifugado, tratar de separar lo grande de lo chico. Principalmente para
protenas solubles.
- Captura: precipitar por sales, algunas precipitan y otras quedan en el sobrenadante.
Procedimiento grueso
- Columnas
- Pulido
Una manera de seguir las purificaciones a grandes rasgos, a travs de mquinas, tienen un filtro
que les permite medir a 280nm para saber donde aparecen o no protenas, propiedad que es
otorgada por los aa aromticos. Se pude determinar cuanta protena tiene a travs de la ley de

Se puede determinar el pi poniendo la protena a distintos ph, donde sea la menos solubilidad,
ser el punto isoionico porque sobre el punto isoionico en general la protena esta negativa. Pero
cuando el ph es similar al pi, las cargas neta se hacen cero, no les permite interaccionar bien con
el agua, interaccionan con ellas mismas y precipitan, disminuye solubilidad.
Salting out: precipitacin con sal. Sulfato de amonio, la mayora de las protenas a concentracin
alta de la sal son poco solubles, til para proceso de captura. Esta sal est dentro de Hofmeister,
que describi una serie de sales de cationes y aniones que tienen distintos grados de que tan
estable, soluble y la probabilidad que tienen de estabilizar o desnaturar a la protena. Los aniones
(verde) son los que ms estabilizan la protena y menos soluble hacen a la protena. Los cationes,
sulfato y amonio estn dentro de los que ms estabilizan las protenas porque no interaccionan
con ellas, si no que con el agua.
El hielo al estar ms ordenado es ms apolar. La polaridad del agua decrece cuando se congela.
Hay otras sales que permiten que la protena se desnature, o sea, interaccionan. O la sal
interacciona muy bien y la mantiene soluble o al exponerse los grupos hidrofbicos, agregue con
respecto al solvente y precipiten. Ej: al calentar se desnatura, se despliega, pero el agua hace que
las protenas agreguen y terminan precipitando por gravedad (huevo)
TIPOS DE CROMATOGRAFA

Cromatografa de intercambio inico:

- matriz de intercambio aninica: intercambia catinicas
en los cromatogramas uno puede seguir la protena a 280 nm, uno carga la protena en la
columna y despus se lava con buffer (volmenes de columna) si es una columna de 5ml se lava
con 10 ml. () es importante el ph. Para una matriz positiva si tenemos una protena con un pi
de 5 a ph 7 estar con carga negativa, esperara que se pegue.
- matriz de intercambio catinica: intercambia aniones
X, aplica la columna, lava y despus eluye. Uno equilibra la columna a muy baja concentracin de
sal, aplica la muestra con distintas protenas, dependiendo del ph, las protenas tendrn distintas
cargas. Se aplica el lisado total a la columna y se aumenta la concentracin de sal y se irn pegando
las protenas segn su carga. Mtodo usado para purificar la protena. Se mide lo que va saliendo
de la columna
Cromatografa de afinidad
Si tenemos una protena que sabemos une glucosa. Tenemos una matriz que tenga glucosa,
pasamos la muestra y se pegaran las protenas que pueden unir glucosa. Despus la protena se
recupera aumentando la concentracin de glucosa en el medio e interaccionara con la glucosa
del buffer. Aqu el ph no es tan relevante. Se utiliza como pulido.
Purificacin de protenas recombinantes: el tag de histidina es muy utilizado, se puede poner en
el amino o carboxilo terminal, uno pone 6histidinas. Las 6histidinas tienen la propiedad de
interactuar con iones metlicos (Ni o Co). Uno tiene una matriz con un grupo que una fuertemente
nquel y las protenas con 6histidinas se unirn (tipo de columna de afinidad para protenas
recombinantes) para sacar la protena hago un buffer con imidazol (20milimolar) el imidazol
desplaza al nquel, hace que se liberen las histidinas. son aquellas que se obtienen al expresar
un gen clonado en una especie o una lnea celular distinta a la clula original. Un ejemplo de
protena recombinante es la insulina humana generada in vitro, obtenida a partir de cultivos de
la bacteria E. coli. Anteriormente se recoga directamente a partir del pncreas del cerdo. Para
obtener una protena recombinante, se parte de ADN recombinante, que no es ms que una
molcula de ADN artificial formada de manera deliberada in vitro insertando secuencias de ADN
provenientes de un organismo en el genoma de un organismos diferente, por ejemplo ADN
humano insertado en el de la bacteria E. Coli. El ADN recombinante da lugar a la protena
recombinante que interesa obtener. Un tipo de protenas recombinantes son las protenas de
fusin, originadas al unir artificialmente dos o ms genes que darn lugar a una nica protena
suma de las 2 anteriores.
GST: otro mtodo utilizado como el de 6histidinas.
Cromatografa hidrofbica
Se ponen concentraciones altas de sal. El agua al tener concentraciones altas de sal, volver al
agua ms apolar, esto ayuda a que los iones que estn solvatando a las protenas, las protenas
interaccionaran con otras cosas (cuando se le quita la capa de solvatacin). Proteinas en una muy
alta concentracin de sal (como estarn poco solvatadas interaccionaran con la matriz
hidrofbica), se disminuye la concentracin despus y las protenas comienzan a adquirir la capa
de solvatacin y comienzan a salir de la matriz. Se lava con alta concentracin de sal.
capa de solvatacin: aguas que estn interaccionando con los residuos en la sup de la protena.
Se mantiene soluble porque es capaz de interaccionar con las molculas de agua. Los iones tienen
capa de solvatacin y las protenas igual debido a sus residuos.
Exclusin molecular o filtracin en gel
Separan por tamao, son matrices con poros de tamao definido. Las molculas en una solucin
que sean pequeas podrn ingresar y las ms grandes no. Si uno pasa una muestra las molculas
pequeas quedarn retenidas ms tiempo y las ms grandes saldrn primero. Las protenas que
salen primero son las de gran peso molecular, intermedio y bajo. til para cambiar o quitar buffer,
usando una matriz donde solo quepa la sal. Se utiliza ms como pulido. El tiempo de retencin en
la columna depende del tamao de la protena, se puede determinar el peso molecular nativo de
la protena. Utilizado para saber la estructura cuaternaria.
Electroforesis
pones la protena en una matriz con poros y se le aplica corriente, la protena va a migrar al polo
positivo o negativo de acuerdo con su carga neta y su coef de friccin. Carga/coef , que tan grande
es el polipptido y cmo est plegado (en esto se basa el coef de friccin).
Tenemos un gel, con una carga positivo y negativa a cada lado, se pone la protena, se aplica
electricidad. Las ms pequeas y ms cargadas migran primero y las ms grandes y menos
cargadas al final.
concentraciones altas de policliramida: poros pequeos
SDS PAGE
se utiliza un detergente altamente inico (sulfato de sodio) con una cadena HC, quita la carga de
la protena, les atribuye una carga homognea a todas las protenas. Pero al ser un detergente la
protena se desnatura y queda como cadenas lineales, y lo nico que me determinara el coef de
friccin ser el peso molecular.
isoelectrofoge
se prepara a distintos ph, la protena migrar de acuerdo a donde este su punto isoelctrico,
cuando no migre ms, ese ser su PI.
Cambio de buffer
- dilisis
- exclusin molecular
Espectrometra de masa
Para determinar el peso especfico de una protena.
- MALDI: matriz que absorbe luz. Se dispara con un lser, la matriz se vaya a fase gaseosa, la
protena que uno pone se ioniza. Se pone en un EM
- ESI: se pasa por una aguja altamente cargada, ionizndola y vera el tiempo de migracin. Misma
protena con dos estados de ionizacin distintos, se integran los pics y se sabe la masa especifica.
Dicroismo circular
para saber si es todo alfa o todo beta.
que tipo de estructura secundaria tiene.
Fluorescencia
para determinar estructura terciaria. Excita molcula que es capaz de entregar una longitud de
onda mayor y la protena tiene grupos fluroforos como el triptfano, uno puede usar su
fluorescencia para seguir la unin de un ligando.