Prctico N1

EXPERIENCIA 1: Determinacin de la actividad enzimtica de la Celobiasa.

El objetivo de esta experiencia es estudiar la actividad enzimtica de la Celobiasa en el tiempo,
utilizando el mtodo de la espectrofotometra.

Materiales

Cubetas
Tubo 15 [ml]
Tubo 2[ml]
Pipetas
Plumones
Guantes de latex
Equipos

Espectrofotmetro
Reactivos

Celobiasa (enzima)
P-nitrofenil glucopiranosido (Concentracin 1.5 mM), (sustrato)
Solucin Stop (Na2CO3H2O, 200 mM)
Metodologa
Se comienza extrayendo 1 [ml] del tubo de 15 [ml] de sustrato, el que ser depositado en un
tubo de 2[ml] que ser etiquetado y utilizado como control.
Posteriormente se etiquetan 7 cubetas con nmeros del 1 al 7 y se les agrega 0.5 [ml] de
Solucin Stop. Estas cubetas representarn los distintos tiempos en los que ocurrir la reaccin entre
enzima y sustrato, comenzando desde que se aade la enzima hasta el minuto 8.
Luego se procede a agregar 3 [ml] de enzima al tubo de 15 [ml] con sustrato. En este momento
comenzar la reaccin, por lo que se debe separar inmediatamente 0.5 [ml] de la mezcla y se agregan a
la cubeta etiquetada con el n1.
A continuacin, se deben realizar extracciones de 0.5 [ml] del tubo de 15[ml] transcurridos
1,2,4,6 y 8 minutos desde el momento en el que se aadi la enzima al tubo, estos se depositarn en las
cubetas n2, n3, n4, n5 y n6 respectivamente.
Finalmente, a la cubeta n7 se le agregan 0.5 [ml] del tubo etiquetado como control, esta
muestra constituir el blanco.
Se procede entonces a medir la absorbancia del p-Nitrofenol obtenido en la reaccin catalizada
por la celobiasa. Esto se realiza con las 7 cubetas a 410 nm.
EXPERIENCIA 2: Determinacin de la curva estndar de p-nitrofenol.
El objetivo de esta experiencia es generar una curva de calibracin que relacione absorbancia
con concentracin de p-nitrofenol, para poder determinar las concentraciones de producto de cada
muestra de la Experiencia 1 por medio de interpolacin.
Materiales:

Guantes de latex
Cubetas
Pipetas
Plumones
Tubos
Equipos

Espectrofotmetro
Reactivos

P-Nitrofenol (concentracin 0.2 mM)

Solucin Stop
Agua
Metodologa
Se comienza etiquetando 5 cubetas, las que representaran las concentraciones conocidas de p-
Nitrofenol, expuestas en la siguiente tabla:

Tabla ? : Concentraciones conocidas de p-Nitrofenol.

Cubeta
1 2 3 4 5
Concentracin de p-Nitrofenol [nM] 0 12.5 25 50 100

Posteriormente, en cada una de las cubetas se preparan las diluciones, con las cantidades de p-
Nitrofenol, agua y solucin stop que se indican en la siguiente tabla:

Tabla ? : Cantidades para disoluciones en curva de concentacin de p-Nitrofenol.

Cubeta P-Nitrofenol 0.2 mM [ml] Agua [ml] Solucin Stop [ml]

1 0.00 0.5 0.5
2 0.0625 0.4375 0.5
3 0.125 0.375 0.5
4 0.25 0.25 0.5
5 0.5 0 0.5

A continuacin, se lee la absorbancia de las 5 muestras con el espectrofotmetro, utilizando

una longitud de onda de 410 nm y a la con la cubeta n1 como blanco. Esto permitir obtener los datos
de la curva estndar.
 Finalmente, con un software conveniente, se obtiene la ecuacin lineal que mejor se ajuste a la
curva de concentracin de p-Nitrofenol v/s absorbancia. Se obtiene, de esta forma, la concentracin de
p-Nitrofenol de la Experiencia 1 por interpolacin de los datos de absorbancia.

Prctico N2

EXPERIENCIA 1: Efecto del pH en la actividad enzimtica.

El objetivo de esta experiencia es encontrar que Buffer es ptimo para la actividad de la
enzima, es decir, a que pH el sitio activo est en condiciones ptimas para la actividad cataltica sobre el
sustrato.
Materiales:

Guantes de latex
Cubetas
Pipetas
Plumones
Tubos eppendorf
Equipos:

Espectrofotmetro
Reactivos:

Citrato de sodio (Na3C6H5O7)

MES (C6H13NO4S)
MOPs (C7H15NO4S)
Celobiasa (enzima)
P-nitrofenil glucopiranosido (sustrato)
Metodologa:
Se comienza etiquetando 3 tubos con nmeros del 1 al 3 y con su pH respectivo (1: pH=3, 2:
pH=5.5 , 3: pH=7), luego, a cada tubo se le agregan las cantidades de buffer y sustrato indicadas en la
siguiente tabla:
Tabla ? : Cantidades de buffer y sustrato.

pH Buffer [ml] Sustrato [ml]

1 3 Citrato de sodio 0.5 0.3
2 5.5 MES 0.5 0.3
3 7 MOPs 0.5 0.3

A continuacin, se etiquetan 6 cubetas, 3 para cada uno de los controles (C1, C2 Y C3) y 3 para
cada una de las reacciones a su pH respectivo (R1, R2 Y R3). Agregar 0.5 [ml] de solucin stop a cada
cubeta.
 Posteriormente se sacan 0.5 [ml] de los tubos 1,2 y 3 y se depositan en sus respectivas cubetas
de control marcadas con C1, C2 Y C3. Luego se agregan 0.2 [ml] de enzima a la solucin restante en los
tubos y se deja reaccionar durante 8 minutos.
Pasado el tiempo, se sacan 0.5 ml de cada tubo y se depositan en las cubetas respectivas
marcadas con R1,R2 y R3. Estas cubetas nos mostraran el pH ptimo por medio de la absorbancia.
Finalmente, con el espectrofotmetro se mide y registra la absorbancia de cada reaccin
recordando utilizar el respectivo control como blanco.

EXPERIENCIA 2: Efecto de la temperatura en la actividad enzimtica.

En la experiencia anterior se encontr el pH ptimo al que acta la enzima. En esta experiencia
se medir el efecto de la temperatura en la actividad cataltica a ese pH.

Materiales:

Guantes de latex
Plumones
Pipetas
Cubetas
Tubos
Equipos:

Espectrofotmetro
Hielo
Incubadora
Reactivos:

Buffer ptimo (encontrado en la experiencia 1)

Celobiasa (enzima)
P-Nitrofenil glucopiranosido (sustrato)
Solucin Stop
Metodologa:
Se preparan 3 tubos etiquetados con nmeros del 1 al 3, luego se le agrega a cada uno 0.5 [ml]
de sustrato y 0.3 [ml] de buffer. Se separan 0.? [ml] de cada tubo y se guarda en otros 3 tubos
etiquetados como C1, C2 Y C3 para utilizarlos como control.
Posteriormente se agregan 0.2 [ml] de enzima a cada tubo etiquetado como 1, 2 y 3 y se dejan
reaccionar 8 minutos; el tubo n1 y el C1 se dejan reaccionando en el hielo (0C), el tubo n2 y el C2 a
temperatura ambiente (24C) y el tubo n3 y el C3 en la incubadora (37C).
Mientras ocurre la reaccin, se preparan 6 cubetas etiquetadas como C1,C2,C3,R1,R2 Y R3. Se
les agrega 0.5 [ml] de solucin stop a cada una.
Transcurrido el tiempo de reaccin, se aaden 0.5 [ml] de cada tubo en su respectiva cubeta.
Finalmente se mide y registra la absorbancia de cada muestra, utilizando el espectrofotmetro.
EXPERIENCIA 3: Efecto de la concentracin de sustrato en la actividad enzimtica.
En esta experiencia se ver el efecto de la concentracin de sustrato en la velocidad de
reaccin, a temperatura y pH ptimos para la enzima.
Materiales:

Guantes de latex
Plumones
Pipetas
Cubetas
Tubos
Equipos:

Espectrofotmetro
Reactivos:

Buffer ptimo (encontrado en la experiencia 1)

Celobiasa (enzima)
P-Nitrofenil glucopiranosido (sustrato)
Solucin Stop
Agua
Metodologa:
Se preparan 8 tubos, etiquetndolos del n1 al n7. Luego se les agrega las cantidades que se
indica en la siguiente tabla y se deja reaccionar por 8 minutos.
Tabla ? : Concentraciones de sustrato, buffer y agua.

Tubo Sustrato [ml] Buffer [ml] Agua [ml]

1 0 1 ?
2 0,017 0,983 ?
3 0,033 0,967 ?
4 0,1 0,9 ?
5 0,333 0,667 ?
6 0,5 0,5 ?
7 0,667 0,333 ?

Mientras ocurre la reaccin se preparan 7 cubetas etiquetadas del n1 al n7 y se les agrega 0.5
[ml] de solucin stop a cada una. Una vez transcurrido el tiempo, se agregan ? [ml] de cada tubo a su
correspondiente cubeta, para detener la reaccin.
Finalmente se mide y registra la absorbancia de cada muestra utilizando el espectrofotmetro.