Repartido Enzimas

Captulo 1 Naturaleza y clasificacin de enzimas
GENERALIDADES DE
ENZIMAS
Autores:
Martha Ubalde (Laboratorio de Enzimas hidrolticas, Facultad de Ciencias)

Carolina Villadniga (Laboratorio de Enzimas hidrolticas, Facultad de
Ciencias)
Cecilia Giacomini (Ctedra de Bioqumica, Facultad de Qumica)
Valeria Graz (Ctedra de Bioqumica, Facultad de Qumica)
Responsable: Prof. Ana Mara Cantera
2002
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1- Naturaleza y clasificacin de enzimas.

1.1- Generalidades
Excepto por un grupo de molculas de RNA cataltico, las enzimas son protenas. Al igual que otros
catalizadores son efectivas en muy baja concentracin (del orden de nM), se recuperan sin alterar luego de
la reaccin, no cambian la posicin del equilibrio de la reaccin que catalizan sino que mediante la
formacin de un complejo enzima-sustrato, disminuyen la energa de activacin aumentando la velocidad a
la cual sta transcurre. En la figura 1 se observa las variaciones de energa libre, Go, a medida que avanza
la reaccin, en presencia de la enzima la energa del estado de transicin, que permite llegar a los productos
es menor que sin enzima. TSc1, TSc2, TSc3, TSu son los diferentes estados de transicin para el complejo
enzima-sustrato, y para la reaccin sin enzima respectivamente; G* c y G *
u es la variacin de energa
libre entre el estado inicial y el estado de transicin correspondiente.
reaccin sin enzima

Energa libre estndar
reaccin con enzima
estado
inicial
estado final
coordenada de reaccion
1.2- Especificidad y sitio activo
A diferencia de los catalizadores inorgnicos las enzimas actan en condiciones moderadas de pH y

temperatura. En su mayora presentan especificidad por el sustrato aunque en grado variable, por ejemplo
glucosa oxidasa (GO) una enzima presente en hongos y bacterias, cataliza la oxidacin de D-glucosa a
cido glucnico, pero no oxida L-glucosa. La velocidad de oxidacin de -D-glucosa es 157 mayor que la
de oxidacin de -D-glucosa. La especificidad de esta enzima es de tal grado que diferencia los
esteroisomeros. Otras enzimas presentan menor grado de especificidad, como la enzima xilosa isomerasa,
presente en varias especies bacterianas, que cataliza la isomerizacin de xilosa en xilulosa, ambas pentosas,
pero tambin cataliza la transformacin de glucosa en fructosa, ambas hexosas.
2
El sitio activo de las enzimas consiste en un grupo de 3-12 aminocidos organizados en una estructura
tridimensional, en una zona de la protena. Este sitio tiene una fuerte afinidad por el sustrato debido a la
naturaleza qumica de los residuos aminoacdicos que la componen.
Ejemplos de estos grupos reactivos son el grupo tiol de cistenas, el anillo imidazol de histidina, el grupo
hidroxilo de serina.
1.3- Muchas enzimas necesitan de componentes no enzimticos
Algunas enzimas necesitan de la presencia de componentes adicionales conocidos como cofactores para la
actividad. El complejo enzima-cofactor, catalticamente activo se denomina holoenzima y la protena en
ausencia del cofactor se denomina apoenzima.
Los cofactores pueden ser : - iones inorgnicos
- coenzimas
- grupos prostticos
Iones metlicos inorgnicos
pueden ser parte integral de la estructura de la enzima o pueden asociarse con el sustrato, ayudando a la
unin con la enzima y aumentando la actividad cataltica.
+2
Por ejemplo el Fe se encuentra asociado con el grupo hemo en la peroxidasa y la catalasa encontrndose
+2 4-
fuertemente unido a la enzima, mientras que el Mg se complejea con el ATP y es un componente
esencial en las reacciones que involucran a esta molcula como aquellas catalizadas por fosfotransferasas.
Coenzimas
Son sustancias orgnicas de peso molecular relativamente bajo comparado con la protena. Muchas
coenzimas contienen molculas de vitaminas como parte de su estructura. Se encuentran unidas a la protena
por enlaces dbiles y funciona efectivamente como cosustrato de la enzima. Tienen funciones especiales
como la transferencia de hidrgeno ( NAD+ en reacciones de deshidrogenacin) o la transferencia de grupos
acilo (coenzimaA en el metabolismo de cidos grasos). Muchas enzimas que catalizan reacciones diferentes
presentan los mismos coenzimas. Por ejemplo se conocen ms de 100 deshidrogenasas que presentan el
NAD+ como coenzima.
Cuando la coenzima se encuentra fuertemente unida a la molcula de enzima y permanece unida a la enzima
luego de finalizado el ciclo cataltico, se denomina grupo prosttico. El FAD es otro transportador de tomos
de hidrgeno asociado con enzimas oxidantes como la glucosa oxidasa. El grupo hemo de la catalasa y la
peroxidasa con su anillo de porfirinas tambin se conoce como grupo prosttico.
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A continuacin se enumeran un grupo de enzimas que requieren cofactores.
Enzima Clase Cofactores Tipo de cofactor

Subtilisina hidrolasa Ninguna ---------
(proteasa)
cido lctico deshidrogenasa oxidoreductasa NAD+ Coenzima
Glucosa isomerasa Isomerasa Co +2 ; Mg +2 Ion activador
+2
Peroxidasa Oxidoreductasa Grupo hemo conteniendo Fe Grupo prosttico
Glucosa oxidasa Oxidoreductasa FAD Grupo prosttico

Fe Ion activador
1.4- Clasificacin y nomenclatura de enzimas.
A medida que se iban descubriendo, las enzimas se nombraban agregndole el sufijo asa al nombre del
sustrato o a una palabra o frase que describiera su actividad. As la enzima amilasa cataliza la hidrlisis de
amilosa, ADN polimerasa cataliza la sntesis de ADN; sin embargo otras enzimas tienen nombres que no
hacen referencia ni al sustrato ni al tipo de reaccin que catalizan como tripsina, renina, catalasa. Al ir
incrementndose el numero de enzimas conocidas se hizo evidente la necesidad de contar con una gua
reconocida para una nomenclatura sistemtica.
En agosto de 1955, la Asamblea General de la Unin de Bioqumica y Biologa Molecular, IUBMB, decide
formar una comisin internacional que se aboque a estudiar y establecer los criterios y reglas para la
clasificacin de enzimas. La Comisin Internacional de Enzimas (Enzymes Commission, EC) comenz a
trabajar en 1956 en conjunto con la Comisin de Nomenclatura de IUPAC. As se fueron publicando
sucesivos informes y documentos donde figuran las recomendaciones y reglas a seguir para nombrar una
enzima.
1.4.1- Principios generales de clasificacin
La nomenclatura de las enzimas y su clasificacin estn estrechamente relacionadas, por lo cual se tratan
conjuntamente.
Recomendaciones:
el nombre propuesto para la enzima se refiere exclusivamente a una entidad cataltica individual. En el
caso de que intervengan en la catlisis mas de una enzima, debe agregarse el termino complejo al
nombre, por ejemplo, la descarboxilacin oxidativa del piruvato para dar acetilCoA, es catalizada por un
grupo de enzimas cada una de ellas con diferentes propiedades catalticas, que se conoce como complejo
piruvato deshidrogenasa
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la propiedad especifica que diferencia una enzima de otra es la reaccin qumica que cataliza, por lo tanto
es lgico que esto sea la base para su nomenclatura y clasificacin. Sin embargo la aplicacin de este
criterio tiene algunas consecuencias, no puede asignrsele nombre a una enzima hasta no conocer la
reaccin que cataliza; tambin se da el caso de que enzimas que catalizan la misma reaccin pero son de
diferente origen (bacterianas, vegetales, animales) figuran como una sola en la clasificacin, lo mismo
ocurre con las isoenzimas, que no estn diferenciadas.
en base al tipo de reaccin que catalizan las enzimas se clasifican en clases, cada enzima se individualiza
segn el sustrato sobre el que acta. Esto exige elegir una direccin para la reaccin que se describe, se
toma como criterio escribir la reaccin en la direccin que se presume de importancia fisiolgica.
1.4.2.- Esquema de clasificacin.
A cada enzima se le asigna un nmero clasificatorio de cuatro dgitos separados por un punto y precedido por
la sigla EC (Enzyme Commission). Se clasifican en 6 clases indicada por el primer dgito, cada clase se
divide en subclases (segundo dgito) que a su vez se divide en sub-subclases (tercer dgito) y dentro de ellas
cada enzima se individualiza con el nmero ordinal que le corresponde dentro de la sub-subclase (cuarto
dgito).
clase tipo de reaccin que catalizan

1. Oxidoreductasas oxido-reducciones
2. Transferasas transferencia de grupos de un compuesto a otro
3. Hidrolasas hidrlisis
4. Liasas adicin de un grupo a doble enlace
5. Isomerasas rearreglos intramoleculares
6. Ligasas formacin de enlaces utilizando la energa de la hidrlisis de ATP
5
1.5- Ribozimas
Aunque la gran mayora de las enzimas son protenas, hoy se sabe que ciertas molculas de ARN tienen
actividad cataltica; estas se conocen como ribozimas.
En las clulas eucariotas, el ADN se transcribe en una molcula de ARN que contiene secuencias no
codificantes (intrones) y secuencias codificadoras (exones). Durante el proceso de maduracin un intrn
cataliza su propia eliminacin y la unin de los exones adyacentes, sin la participacin de protenas. La
estrategia es similar a la vista en las enzimas clsicas, el plegamiento del ARN con una molcula de GTP
genera una estructura tridimensional que facilita la ruptura del enlace fosfodiester entre el intrn y el exn y
la subsecuente unin de los exones.
Otra ribozima bien caracterizada, la Ribonucleasa P de E. coli, tiene un componente proteico de 17500 Da y
un componente ARN de 377 nucletidos (M1 RNA). Se ha comprobado que la porcin M1 RNA es
suficiente para la catlisis cortando precursores de t-RNA en la posicin correcta, aparentemente la protena
solo se necesita para estabilizar el ARN o facilitar su funcin en condiciones particulares de las clulas.
El descubrimiento de ARNs catalticos proporciono nuevos conocimientos y cuestionamientos sobre la
funcin cataltica en general, as como importantes implicancias sobre el origen de la vida y su evolucin.
1.6- Referencias
IUBMB nomenclature Homepage, http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/

da
Lehninger, A., Nelson, D., Cox, M. En: Principios de Bioqumica 2 Ed.; Ediciones Omega, Barcelona
(1993)
Stryer, L., En: Bioqumica 4ta Ed.; Editorial Revert, Barcelona, (1995).
Teal, A. R., y Wymer, P., En: Enzymes and their role in biotechnology;
http://www.biochemistry.org/education/basc03.htm
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Captulo 2 Caracterizacin de enzimas
2- Caracterizacin de enzimas
La medida de la cantidad de enzima presente en una solucin por lo general no es expresada en trminos
clsicos tales como mg/ml, ya que la enzima puede representar una pequea fraccin de la muestra. Es as
que las enzimas son cuantificadas en trminos de su actividad biolgica. La actividad enzimtica puede
determinarse midiendo la velocidad de desaparicin de sustrato o la velocidad de aparicin de producto. En
general es mejor medirla por aparicin de producto ya que es ms exacto determinar aparicin de pequeas
cantidades de producto que la desaparicin de pequeas cantidades de sustrato. A menudo se utilizan
sustratos artificiales que liberan cromforos que pueden ser determinados colorimtricamente.
Una forma comn y til de determinar la actividad enzimtica es en trmino de unidades. Las unidades de
enzima en general se definen como:
La cantidad de enzima necesaria para producir determinada cantidad de producto (milimoles, moles etc.)
por unidad de tiempo (minutos, segundos etc.) bajo determinadas condiciones de temperatura, pH y
concentracin de sustrato
Existen muchas definiciones de unidades enzimticas, esta depende de la enzima estudiada y de como la
defina el investigador.
La concentracin de una enzima en una solucin se expresa por lo general como unidades por mililitro.
La actividad especfica (AE) de una enzima se calcula como el cociente entre la actividad y la concentracin
de protenas, y se expresa en general como unidades de enzima por milgramo de protena (U/mg protena).
Al ser las enzimas molculas biolgicas, su actividad se ve afectada por las condiciones de su entorno tales
como, pH, temperatura, concentracin de sustrato, fuerza inica, presencia de cofactores etc. Por lo tanto
para trabajar con ellas hay que caracterizarlas.
2.1- Influencia de la concentracin del sustrato en la actividad enzimtica
Para muchas enzimas la velocidad de catlisis (v), vara con la concentracin de sustrato [S] de la siguiente
forma:
Figura 1. Grfico de velocidad de la reaccin enzimtica en funcin de la concentracin de sustrato
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Para una determinada concentracin de enzima la velocidad (v) es casi proporcional a la concentracin de
sustrato [S] , cuando [S] es pequea. Cuando [S] es elevada , la velocidad de catlisis es prcticamente
independiente de [S]. En este caso decimos que estamos en condiciones de saturacin. Michaelis y Menten
propusieron un modelo sencillo que explica estas caractersticas cinticas.
k1 k3
E + S ES E + P
k2
La transformacin de sustrato en producto implica la formacin de un complejo enzima-sustrato (ES) , que

ocurre a travs del sitio activo de la enzima. Este sitio presenta una estructura tal que permite una unin
especfica y de alta afinidad con el sustrato, adems de proveer de un ambiente que favorece los eventos
catalticos.
El complejo ES tiene dos destinos posibles: i) puede disociarse hasta E y S con una constante de disociacin
k2, o ii) puede continuar hasta formar un producto P con una constante de velocidad k3. Se supone que nada
del producto revierte al sustrato inicial, una condicin que se cumple en el estado inicial de la reaccin, antes
de que la concentracin de producto sea apreciable.
La formacin cataltica del producto con regeneracin de la enzima, es una reaccin simple de primer orden
y su velocidad est determinada por la concentracin del complejo enzima-sustrato y el valor de k3:
v = k3 [ES]
Suponiendo que el complejo ES se encuentra en condiciones de estado estacionario, es posible llegar a la
siguiente ecuacin de velocidad, ms conocida como ecuacin de Michaelis-Menten:
v = Vmax [S] / Km + [S]
donde Km = k2 +k3 / k1 y Vmax = K3 [ET]
El desarrollo matemtico de esta deduccin se puede encontrar en cualquier texto de Bioqumica.
En trminos experimentales Km es numricamente igual a la concentracin de sustrato a la cual la velocidad

de la reaccin es la mitad de la velocidad mxima (Vmax )
Cuando [S]= Km entonces v = Vmax / 2
Km es una caracterstica til y fundamental de cada enzima y un sustrato en particular. Tambin puede verse
como un ndice de la afinidad de la enzima por su sustrato bajo condiciones de temperatura, pH y fuerza
inica determinadas. Cuanto menor es el valor de Km mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato. Si el
sitio activo de la enzima es capaz de unirse y reaccionar con varias molculas de estructura similar, entonces
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hay un nmero de sustratos potenciales para la enzima, y para cada sustrato, la enzima puede presentar un
valor de Km diferente.
Por ejemplo la enzima -galactosidasa presenta diferentes sustratos naturales y artificiales y distintos valores
de Km para cada uno de ellos
Sustrato Km
Lactosa 1 x 10 3M
p-nitrofenil--galactsido 2 x 10 4M
p-aminofenil--galactsido 4 x 10 3 M
4 metil umbelliferil -galactsido 2 x 10 4 M
Tabla 1. Valores de Km de la enzima -galactosidasa para distintos sustratos
Los valores de Km de los enzimas varan ampliamente. Para la mayora de los enzimas varan entre 10-1y
10-7 M.
Para determinar la actividad enzimtica, el sustrato debe estar presente en exceso, de forma de asegurarnos
que la enzima se encuentra saturada y que por lo tanto la velocidad enzimtica es independiente de la
concentracin de sustrato (punto C de la Figura 1). Se considera que estamos en condiciones de saturacin
cuando la concentracin de sustrato es mayor o igual a 10 Km.
Concentracin de sustrato relativa a Km Velocidad observada relativa a velocidad

1000 Km 1.0 Vmax
100 Km 0.99 Vmax
10 Km 0.91 Vmax
3 Km 0.75 Vmax
1 Km 0.50 Vmax
0.3 Km 0.25 Vmax
0.1 Km 0.091 Vmax
0.01 Km 0.01 Vmax
0.001 Km 0.001 Vmax
Tabla 2. Relacin entre concentracin de sustrato y velocidad de la reaccin enzimtica
La Vmax , sin embargo no es una caracterstica fundamental para una enzima y su valor va a depender de la
cantidad de enzima presente. Si esto se estandariza a un mol de enzima, el valor terico de Vmax obtenido es
el nmero de recambio o actividad molar. Esta es una medida til del poder cataltico de una enzima. Su
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valor cuantifica el nmero de molculas de sustrato transformadas por molcula de enzima por minuto. La
anhidrasa carbnica tiene la mayor actividad molar de las enzimas conocidas. El valor del nmero de
recambio de varias enzimas conocidas de se muestra a continuacin.
Enzima N de Recambio
(min-1)
anhidrasa Carbnica 36 x 10 6
catalasa 5.6 x 10 6
-galactosidasa 12 x 10 3
quimiotripsina 6 x 10 3
lisozima 60
Tabla 3. Nmeros de recambio de algunas enzimas
2.1.1- Determinacin de parmetros cinticos.
La grfica de velocidad en funcin de la concentracin de sustrato (Figura 1) es una hiprbola rectangular.

No es til en la prctica trabajar con esta curva dado que es difcil dibujar una hiprbola rectangular en forma
exacta, colocar las asntotas correctamente y a su vez detectar desviaciones de la curva esperada.
Para determinar los parmetros cinticos de una enzima conviene entonces reordenar la ecuacin de
Michaelis-Menten de manera que proporcione una grfica lineal. Hay varios tipos de linealizaciones de esta
ecuacin pero la que ms se utiliza es una representacin doble inversa, tambin llamada representacin de
Lineweaver-Burk.
1 = 1 + Km x 1
v Vmax Vmax [S]
Figura 2. Representacin de Lineweaver-Burk de la ecuacin de Michaelis-Menten
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2.2- Medida de velocidad
Al reordenar la ecuacin de Michaelis-Menten de la siguiente forma: v= k3 x [ET]

1 + Km
[S]
queda claro que la velocidad de la reaccin es directamente proporcional a la concentracin de la enzima,
siempre y cuando se trabaje en condiciones iniciales; dado que slo en ese caso se puede hacer la suposicin
de que la [S] es constante.
2.2.1- Cmo medir velocidades iniciales?
Como se dijo anteriormente, la velocidad de la reaccin catalizada puede medirse por aparicin de producto.
Cuando se grafica la concentracin de producto de la reaccin enzimtica en funcin del tiempo se obtiene el
siguiente grfico:
Figura 3. Grfico de concentracin de producto en funcin del tiempo
Entre A y B, la velocidad enzimtica es constante (condiciones iniciales). Con el transcurso del tiempo la
grfica de concentracin de producto puede curvarse debido a que :
i) disminuye la concentracin de sustrato, ya no estamos en condiciones de saturacin y por lo tanto la
velocidad de formacin de producto va disminuyendo hasta llegar a cero.
ii) puede ocurrir que nuestra enzima se inhiba por producto causando esto una disminucin en su
actividad.
Por lo tanto para medir actividad en condiciones ideales, se tiene que estar en condiciones de saturacin y de
velocidades iniciales. En estas condiciones nos aseguramos que la medida de actividad enzimtica es
proporcional a la concentracin de enzima (Figura 4).
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Figura 4. Efecto de la concentracin de la enzima en la velocidad de reaccin.
2.3- Influencia del pH y la temperatura
Las enzimas son molculas muy sensibles a cambios en el medio circundante. Es as que un cambio en el pH
o la temperatura, pueden afectar profundamente la actividad y estabilidad de una enzima.
pH o temperatura ptima: es aquel pH o temperatura a la cual la enzima presenta su mxima actividad.
Estabilidad trmica y con el pH: es el rango de pH o temperatura en el cual la enzima es capaz de retener su
actividad cataltica.
2.3.1- Efecto de la temperatura
2.3.1.1- Actividad enzimtica en funcin de la temperatura
La influencia de la temperatura en la actividad de las enzimas se representa generalmente en las llamadas

curvas de temperatura optima (Figura 5), en las que se grafica la actividad en funcin de la temperatura.
Figura 5. Grfico de velocidad en funcin de la temperatura.
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Los efectos de la temperatura en la actividad de una enzima son complicados y pueden ser considerados
como dos fuerzas que actan en forma simultanea pero en sentidos opuestos. A medida que la temperatura
aumenta, la velocidad de reaccin aumenta pero a su vez ocurre una inactivacin progresiva
(desnaturalizacin) de la protena. Este efecto es ms pronunciado a medida que aumenta la temperatura.
La aceleracin de la reaccin por aumento de la temperatura es causada porque a mayor temperatura una
mayor fraccin de molculas tienen la energa suficiente para proveer la energa de activacin de la reaccin.
Por lo general cada 10 C de incremento en al temperatura, la velocidad de la reaccin se duplica. El
fenmeno de inactivacin es debido a que a altas temperaturas las molculas de enzima vibran y se tuercen
tan rpido que algunos de los enlaces no covalentes se rompe. Cuando la temperatura destruye la estructura
terciaria, las molculas de enzima se inactivan o desnaturalizan. Algunas enzimas se desnaturalizan a
temperaturas slo un poco mayor que la temperatura del cuerpo humano, pero algunas pocas son estables
incluso a la temperatura de ebullicin del agua.
Por lo tanto lo que se observa es una Temperatura ptima aparente.
La desnaturalizacin trmica de una enzima es dependiente del tiempo, por lo que el trmino Temperatura
ptima tiene muy poco significado a menos que se tome el cuenta el tiempo de exposicin. Cuanto ms
corto sea el tiempo de exposicin la temperatura ptima de la reaccin enzimtica puede aumentar.
2.3.1.2- Estabilidad de la enzima en funcin de la temperatura
El efecto de la temperatura en la estabilidad de una enzima puede ser determinado exponiendo a la enzima
en ausencia de sustrato a varias temperaturas por un tiempo determinado. Una vez transcurrido dicho tiempo
se mide la actividad remanente de la misma a una temperatura prefijada y se la compara con la actividad
inicial a dicha temperatura (Figura 6).
13
120
100
% actividad remanente
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Tem peratura (C)
Figura 6. Estabilidad enzimtica frente a la temperatura
2.3.1.3 Estabilidad trmica en funcin del tiempo
La inactivacin trmica es un efecto progresivo. El decaimiento de la actividad enzimtica en funcin del

tiempo a una temperatura presenta un comportamiento exponencial.
En el caso de ajustarse a una exponencial simple
At= Ao x e kt At= Actividad a un tiempo dado

Ao= Actividad inicial
Esta ecuacin puede linealizarse graficando logaritmo de la actividad en funcin del tiempo
ln de A/Ao
temperatura= cte
tiempo
Figura 7. Logaritmo de la actividad enzimtica en funcin del tiempo
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El coeficiente de inactivacin (k) es igual a la pendiente del grfico de la Figura 8. El coeficiente k no es

constante, vara de acuerdo a la temperatura.
Otra caracterstica importante en la estabilidad de una enzima (fcil de calcular) es la vida media, la cual
significa el tiempo requerido para que la actividad enzimtica caiga a la mitad del valor inicial bajo las
condiciones dadas. Si la actividad decrece segn la Ecuacin 1, existe una relacin inversamente
proporcional entre vida media y el coeficiente de inactivacin:
t1/2 = ln 0,5 = 0,693 Ecuacin 1

-k k
2.3.2- Efecto del pH
La enzima en solucin, el complejo enzima sustrato y/o el sustrato pueden sufrir ionizacin. Como las
enzimas contienen muchos grupos ionizables (por ejemplo: carboxilos de los glutamatos, aminas de las
lisinas, etc), las mismas pueden existir en diferentes estados de ionizacin, y la distribucin total de la
enzima entre los distintas formas inicas va a depender del pH y de las constantes de ionizacin de los grupos
ionizables. Existen evidencias de que la ionizacin de grupos de la protena lejanos al sitio activo tienen poco
o ningn efecto en la actividad enzimtica, mientras que el estado inico de grupos cercanos o pertenecientes
al sitio activo tienen un efecto profundo.
Si se grafica la actividad enzimtica en funcin del pH, se obtiene una curva del tipo gaussiana, donde el
mximo corresponde al pH ptimo (Figura 8).
Figura 8. Curva de actividad en funcin del pH
Si todas las forma inicas de la enzima fueran catalticamente activas, habra actividad enzimtica en todo el
rango de pH. Sin embargo las curvas de velocidad en funcin del pH muestran que existe actividad cataltica
en un pequeo rango de pH. Parecera ser que las formas inicas de la enzima o del sitio activo que se
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encuentran en forma mayoritaria a ese pH son catalticamente activas.

La causa de que la actividad decaiga a ambos lados del pH ptimo puede ser debido a:
i) el hecho de la enzima, el sustrato y/o el complejo enzima-sustrato se encuentren mayoritariamente en
una forma inica no activa
ii) que el pH afecte la estabilidad de la enzima, ocurriendo desnaturalizacin irreversible.
iii) combinacin de ambos efectos.
Es necesario por lo tanto comparar estas curvas con las de estabilidad de la enzima en funcin del pH para
eliminar pHs ptimos falsos. El efecto del pH en la estabilidad de la enzima es posible determinarlo
experimentalmente. Para esto se incuba la enzima en ausencia de sustrato a distintos pH por un perodo
determinado de tiempo. Al cabo del mismo, se procede a medir la actividad de la enzima luego de retornar el
pH a un valor de referencia.
Si se observa que en los rangos de pH donde la enzima es estable, la misma muestra una disminucin de su
actividad cataltica, esta disminucin slo puede ser atribuida a formas inicas no activas. Puede llegar a
ocurrir que el pH ptimo para la actividad enzimtica no coincida con el rango de pH en que la enzima es
ms estable.
El valor de pH ptimo vara considerablemente de una enzima a otra, y a su vez depende del origen de la
enzima (Tabla 4).
Enzima pH ptimo
lipasa (pncreas) 8.0
lipasa (estmago) 4.0-5.0
pepsina 1.5-1.6
tripsina 7.8-8.7
ureasa 7.0
invertasa 4.5
maltasa 6.1-7.0
amilasa (pncreas) 6.7-7.0
amilasa (malta) 4.6-5.2
catalasa 7.0
Tabla 4. pH ptimos de actividad de distintas enzimas
La evolucin a relacionado a las enzimas con sus ambientes naturales. Por ejemplo, la enzima pepsina que
participa en la digestin de protenas y se encuentra slo en el estmago, es ms activa a los valores bajos de
pH que prevalecen en el estmago luego de una comida. Por el contrario, la amilasa que se encuentra en la
saliva trabaja mejor a pH neutros, que es el pH caracterstico de la boca.
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2.4- Efecto de los inhibidores sobre las enzimas.
Los inhibidores son sustancias que reducen la actividad de una enzima. Los inhibidores pueden ser
componentes propios de la clula o extraos a la misma. En el primer caso pueden ser un elemento
importante para la regulacin del metabolismo celular.
Los inhibidores pueden clasificarse en:
2.4.1- Reversibles
Cuando reaccionan en forma reversible con la enzima estableciendo un equilibrio entre la enzima libre y el
complejo enzima-inhibidor (EI y/o ESI). La constante de equilibrio para la disociacin del complejo enzima-
inhibidor se conoce como KI.
KI= [E][I]
[EI]
Este tipo de inhibicin siempre puede ser revertida mediante la eliminacin del inhibidor (por ej: por
dilisis). A su vez, al tratarse de un equilibrio, que usualmente se alcanza muy rpidamente, el grado de
inhibicin es aparentemente independiente del tiempo.
Existen varios tipos de inhibicin reversible; todos ellos implican la unin no covalente de un inhibidor a la
enzima pero difieren en los mecanismos por medio de los cuales reducen la actividad enzimtica y en la
forma en que afectan la cintica de la reaccin.
i) inhibidor competitivo
Es un inhibidor estructuralmente similar al sustrato por lo que puede unirse en forma reversible al sitio
activo. Durante la fraccin de tiempo en que la molcula de inhibidor est ocupando el sitio activo, la enzima
no est disponible para la catlisis. El efecto global es como si la enzima no pudiera unirse al sustrato tan
bien cuando est presente el inhibidor. As pues, cabe prever que la enzima acte como si su Km se
incrementara por la presencia del inhibidor. Por lo que la forma de revertir este tipo de inhibicin es
desplazando el inhibidor aumentando la concentracin de sustrato.
Por lo general, los productos de una reaccin enzimtica son los inhibidores competitivos ms comunes. Esto
es importarte tenerlo en cuenta en el caso de desarrollar un proceso industrial, debido a que si el producto es
un inhibidor competitivo, para poder alcanzar la mxima eficiencia es necesario remover los productos por
ejemplo por ultrafiltracin.
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ii) no competitivo
Este tipo de inhibidor reversible se une a la enzima en un sitio distinto del sitio activo. La unin del inhibidor
no interfiere con la unin del sustrato pero previene su procesamiento, por lo tanto se observa una
disminucin de la Vmax.
Estos inhibidores no tienen porque estar relacionados estructuralmente con el sustrato, por lo que la
inhibicin no puede ser revertida por incremento de la concentracin del mismo.
iii) acompetitivo
Este tipo de inhibidor se une reversiblemente al complejo ES en sitios diferentes al del sitio activo, dando un
complejo ESI inactivo. El inhibidor no se une a la enzima libre, debido a que no tiene un sitio
complementario de unin. Es la unin del sustrato con la enzima libre lo que provoca un cambio
conformacional que desenmascara o forma el sitio de unin del inhibidor.
Este tipo de inhibicin es poco comn en sistemas con un nico sustrato, pero si es un tipo comn de
inhibicin por producto en sistemas con ms de un producto y sustrato.
En la Figura 9 podemos encontrar las linealizaciones de Lineweaver-Burk correspondientes a los distintos

tipos de inhibicin reversible.
Figura 9. Linealizaciones de Lineveawer-Burk de los distintos tipos de inhibicin reversible.

Panel A: enzima sin inhibidor; Panel B: inhibicin competitiva; Panel C: inhibicin
no competitiva; Panel C: inhibicin acompetitiva.
18
La Tabla 5 es un resumen de las principales caractersticas de los distintos tipos de inhibicin reversible.
Tipo de inhibidor Esquema de reaccin Efecto cintico
inhibidor competitivo k1 k3 - Km se ve aumentada

E+S ES E + P - Vmax no es afectada
+ k2
I
k4 k5 KI = k5 / k4
EI v= Vmax x S / KMapp + S
KMapp= KM (1 +I / KI)
inhibidor no competitivo k1 k3 - Km no es alterada

E+S ES E + P - Vmax disminuye en forma
+ k2 +
I I
proporcional a la concentra-
k4 k5 k4 k5 cin de inhibidor.
k1
EI ESI
k2
KI = k5 / k4
v= Vmax app x S / KM + S
Vapp app= Vmax / (1 +I / KI)
inhibidor acompetitivo k1 k3 - Km disminuye

E+S ES E + P - Vmax disminuye
k2 +
I
k4 k5
ESI
KI = k4 / k5
v= Vmax app x S / KM app + S
Vmax app= Vmax / (1+ I/KI)
KM app= KM / (1 +I / KI)
Tabla 5. Principales caractersticas de los distintos tipos de inhibicin irreversible
2.4.2- Irreversibles
En el caso de la inhibicin irreversible el inhibidor no se encuentra en equilibrio con el complejo enzima-

inhibidor, por lo tanto no se reactiva la enzima removiendo el inhibidor mediante dilisis y otros mtodos, a
diferencia de lo que sucede con los inhibidores reversibles. El efecto cintico de un inhibidor irreversible es
disminuir la concentracin de enzima activa, lo cual lleva a una disminucin de la velocidad de la reaccin.
La inhibicin irreversible se caracteriza por un aumento progresivo en el tiempo, llegando en ltima instancia
19
a la inhibicin completa an con el inhibidor muy diludo, siempre que est en exceso respecto a la
concentracin de la enzima presente. La efectividad del inhibidor no se expresa como una constante de
equilibrio, sino como una constante de velocidad, que determina la fraccin de la enzima inhibida en un
perodo determinado de tiempo para una cierta concentracin de inhibidor.
Los inhibidores de este tipo generalmente causan inactivacin por modificacin covalente de la estructura de
la enzima. En la mayora de los casos estas sustancias reaccionan con algn grupo funcional del sitio activo
para bloquear el lugar de unin del sustrato o para dejarlo catalticamente inactivo. El cianuro es un clsico
ejemplo; el mismo se une covalentemente a la citocromo oxidasa mitocondrial, inhibiendo de esta forma
todas las reacciones asociadas con el transporte de electrones.
Referencias
Cornish-Bowden, A., En: Fundamentals of enzyme kinetics; Portland Press, Ltd., London, (1995).
Dixon, M., Webb, E. C., En: Enzymes 3era Ed.; Dixon, M., Webb, . C., (Eds), Academic Press, New York,
(1979).
Hartmeier, W., En: Immobilized biocatalysists; Springer-Verlag, Berlin, (1988).
Mathews, C., y Van Holde, K., En: Bioqumica 2da Ed., McGraw-Hill, Interamericana, Madrid, (1998).
Messing, R., En: Immobilized enzymes for industrial reactors; Academic Press, Inc, London, (1975).
Purves, W., Orians, G., Craig, H., y Sadava, D., En: Life: the science of biology, W. H. Freeman &
Company, (Eds), (1998).
Stryer, L., En: Bioqumica 4ta Ed.; Editorial Revert, Barcelona, (1995).
20
Captulo 3 Extraccin y purificacin de enzimas
3- Extraccin y purificacin de enzimas

3.1- Produccin de enzimas
Las enzimas son producidas a partir de clulas, donde cumplen su funcin metablica. Ms de 2500 enzimas
diferentes han sido aisladas y caracterizadas hasta el momento, pero esto slo refleja un 10 % del potencial
enzimtico existente en la naturaleza.
Las clulas constituyen hasta hoy el nico recurso para la obtencin de biocatalizadores, aunque no puede
descartarse en un futuro su fabricacin por sntesis qumica. Las enzimas pueden proceder de tejidos de
organismos diferenciados (clulas animales y vegetales) y microorganismos (procariotes y eucariotes).
Un esquema general de produccin de enzimas consiste en cuatro etapas:
1) Generacin o produccin Fermentacin en el caso de enzimas microbianas;

produccin agropecuaria o cultivo en el caso de enzimas
de tejidos
2) Recuperacin Separacin, concentracin, extraccin
3) Purificacin vara segn el tipo de catalizador enzimtico que se use;
puede incluir varias etapas o no existir
4) Formulacin acabado y normalizacin del producto enzimtico
Los procesos productivos, de acuerdo al origen de la enzima, difieren principalmente en la etapa de

generacin. Las etapas restantes, son en cambio esencialmente independientes al mismo, siendo en general
ms simple la extraccin de enzimas de tejidos que la de enzimas intracelulares microbianas, debido a la
mayor dificultad de disrupcin de la clula.
3.1.1- Generacin
Es la primer etapa del proceso de produccin y es donde hay mayores diferencias dependiendo del origen de
la enzima. Las enzimas de origen vegetal se obtienen a partir de subproductos de la actividad agrcola,
mientras que las de origen animal de subproductos de matadero. A su vez las enzimas microbianas se
obtienen como productos metablicos en un proceso de fermentacin. Por lo general las enzimas microbianas
de inters comercial son productos del metabolismo aerbico y cumplen con una funcin catablica, estando
su produccin asociada al crecimiento.
Si bien existe hoy en da un gran auge de las enzimas microbianas, an se produce para la industria un
nmero importante de enzimas de tejidos animales y vegetales, ya que los esfuerzos por reemplazar estas
enzimas por contrapartes de origen microbiano han sido infructuosos (por ejemplo las amilasas para la
preparacin de mostos de cerveza, etc).
21
3.1.2- Recuperacin
Mientras muchas enzimas son retenidas en el interior de la clula e integran compartimientos subcelulares
especficos, otras son liberadas al medio circundante. En la Figura 1 pueden observarse las diferencias entre
un proceso de recuperacin de enzimas extracelulares e intracelulares.
Tejidos animales Fermentacin

Organos animales microbiana
enzimas intracelulares enzimas extracelulares
separacin slido/lquido
Desintegracin celular
Separacin slido/lquido
slidos lquidos
Remocin del
DESCARTE ADN
Purificacin
Purificacin
Formulacin
PRODUCTO
Figura 1: Esquema del proceso de recuperacin de enzimas extracelulares e intracelulares
Como puede observarse, en ambos esquemas de recuperacin son necesarias etapas de separacin slido-
lquido. De las disponibles, solo la filtracin y la centrifugacin son adecuadas para el procesamiento de
grandes volmenes. La filtracin es preferible en el caso de microorganismos filamentosos (hongos y
22
actinomicetes), mientras que la centrifugacin es utilizada preferentemente con microorganismos

unicelulares (levaduras y bacterias).
Tambin puede observarse en la Figura 1, la mayor complejidad del proceso de recuperacin de las enzimas
intracelulares. Esto es debido a que es necesario la disrupcin de las clulas para poder extraer la enzima de
inters. Es importante hacer notar que si bien el esquema de recuperacin de enzimas extracelulares es ms
sencillo, tiene el inconveniente de la necesidad obligatoria de una etapa de concentracin, la cual puede
lograrse por evaporacin al vaco o por ultrafiltracin.
Extraccin de enzimas intracelulares
Cuando la protena de inters se encuentra en el medio intracelular, ya sea de una clula animal, bacteriana o
vegetal, el primer paso es extraerla en forma soluble en un buffer de pH y fuerza inica similar al medio
donde se encontraba originalmente. Para lograr esto hay descriptos un variado nmero de protocolos bsicos
que permiten una extraccin sin daar la protena buscada, aunque en muchos casos es necesario introducir
algunas modificaciones para aumentar el rendimiento de la extraccin y mantener la actividad funcional de la
protena.
Como primer paso, se debe eliminar todo aquello que contamina la muestra: i) si se va a trabajar con tejidos
animales o vegetales estos se lavan con buffer, ii) en el caso de clulas bacteriana estas deben separarse del
medio de cultivo centrifugando, luego se resuspende en buffer y se centrifuga nuevamente.
Luego es necesaria la lsis celular para as poder recuperar la enzima. Esta operacin es relativamente simple
para el caso de tejidos, pues las clulas animales son extremadamente frgiles por ausencia de pared celular,
y aunque las clulas vegetales tienen gruesas paredes celulsicas, estn son rgidas y por lo tanto muy
sensibles a fuerzas cortantes. En cambio, la disrupcin de clulas de microorganismos es ms compleja
debido a la estructura de su pared celular. La disrupcin de clulas de microorganismos es una etapa crtica
dentro del proceso, no porque no haya sistemas eficientes de disrupcin, sino porque stos deben
compatibilizar una alta eficiencia de ruptura celular con la preservacin de la actividad enzimtica de inters.
Los distintos mtodos de disrupcin de las paredes celulares microbianas se encuentran divididos entre: a)
aquellos que provocan la fragmentacin del envoltorio celular por aplicacin de fuerzas cortantes y b)
aquellos que producen degradacin del mismo.
A continuacin se da una lista de algunos de los posibles mtodos de lsis celular.
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Sistema Principio de ruptura Materia prima adecuada Aplicacin a gran escala

sonicacin Cavitacin suspensiones celulares nula
molienda Compresin y esfuerzo bacterias, tejidos vegetales reducida
cortante
homogeinizador Esfuerzo de corte, mayora de tejidos ms amplia
cavitacin animales y vegetales
mecnico
homogeinizador manual Esfuerzo de corte, tejidos vegetales --------
cavitacin
french press Compresin, esfuerzo de bacterias, levaduras, poco probable
corte clulas vegetales
digestin alcalina Hidrlisis pared celular bacterias, levaduras muy reducida
digestin enzimtica hidrlisis pared celular y bacterias, levaduras ms amplia
ruptura osmtica
Tabla 1. Distintos mtodos de lsis celular
El sonicador crea vibraciones que rompen las clulas, estas deben estar en solucin en un medio con baja
viscosidad, el tiempo de lsis va de 5 a 10 minutos.
En la molienda se utiliza junto con un tampn que ya es el medio para la extraccin, un abrasivo como
almina o arena, es muy apropiado para romper paredes de clulas vegetales, 15 minutos suele ser suficiente
para la extraccin del contenido celular.
En el caso de la French press o French Pressure Cell la muestra se somete a alta presin e inmediatamente a
presin atmosfrica, este cambio rpido en las condiciones causa que la clulas estallen y se obtiene as el
extracto con el que se continua trabajando.
El extracto obtenido luego de la lsis, homogenato, se centrifuga para eliminar los restos de pared celular o
los coadyuvantes para la lsis que se utilizan en algunos casos. Dependiendo del material de partida las
condiciones de centrifugacin van desde 10 minutos a 15000xg hasta 1 hora a 100000xg, en lo posible se
utilizan centrifugas refrigeradas que permiten mantener el extracto a 4 C. El sobrenadante es el extracto
crudo que se separa del resto del material que no interesa, pellet. Muchas veces el extracto crudo se filtra por
algodn o lana de vidrio para eliminar partculas en suspensin.
3.1.3- Purificacin.
Las enzimas se encuentran generalmente en asociacin con otras protenas, cidos nucleicos, polisacridos y
lpidos. Existe una gran variedad de mtodos usados para remover material contaminante, de esta manera la
enzima es purificada y su actividad especfica aumenta (Tabla 2). Los distintos mtodos de purificacin
pueden agruparse en tres categoras: i) separacin en base a solubilidad, ii) separacin en base a tamao, y
iii) separacin por retencin selectiva (cromatografa).
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Mtodo Grupo Principio Selecti- Aplicacin a Comentario

vidad gran esacala
Denaturacin i) Coagulacin diferencial Media Reducida Aplicacin restringida a enzimas
selectiva por condiciones ambien- con resistencias anmalas a pH y
tales extremas temperaturas extremas.
Precipitacin i) Salting-out Baja Factible De aplicacin muy difundida,
por fuerza matemticamente modelable y
inica escalable. Alto rendimiento.
Precipitacin i) Magnificacin de fuerz- Media Factible Bajo rendimiento si no se trabaja
por solventes as coulmbicas de atrac- a temperaturas extremadamente
orgnicos mis- cin// bajas.
cibles
Dilisis ii) Difusin a travs de Nula Reducida Operacin de apoyo cuyo objeto
membrana semipermea- es eliminar microsolutos conta-
ble minantes.
Ultrafiltracin ii) Filtracin molecular a Baja Factible Amplia aplicacin como mtodo
presin a travs de de concentracin. Como fraccio-
membrana semipermea- namiento ofrece dificultades (po-
ble larizacin por concentracin).
Cromatografa iii) Retencin selectiva por Media Factible Resultados poco predecibles,
de absorcin interacciones de Van der principios fsicos involucrados
Waals y otras fuerzas de poco claros. Mtodo tradicional.
corto alcance
Cromatografa ii), iii) Retencin selectiva por Alta Reducida El fraccionamiento se produce
de exclusin difusin de molculas de por elucin diferencial, por
molecular menor PM al interior de desplazamiento con tampn sin
una matriz porosa y aplicacin de gradientes. Sopor-
exclusin de molculas tes de alto costo.
de mayor PM
Cromatografa iii) Retencin selectiva por Muy Reducida El fraccionamiento se produce
de intercambio interaccin inica entre alta por elucin diferencial, mediante
inico aminocidos cargados y la aplicacin de gradientes de pH
residuos de carga opues- o fuerza inica. Soportes de alto
ta en el soporte costo.
Cromatografa iii) Retencin selectiva por Muy Muy El fraccionamiento se produce
de afinidad interaccin especfica alta reducida por elucin diferencial inespec-
entre un soporte fica (pH o Fuerza inica), o por
activado y grupos gradientes especficos (adicin de
biolgicamente reactivos sustrato, cofactor, inhibidor). So-
en la enzima portes de alto costo
Cromatografa iii) Retencin selectiva por Alta Nula Sistema reciente desarrollado
hidrofbica interaccin de tipo solo a escala de laboratorio.
apolar entre aminoci- Promisorio. Soportes de alto
dos no polares y el costo.
soporte.
Tabla 2. Sistemas de purificacin enzimtica
25
Un nico paso de purificacin rara vez es adecuado para purificar una enzima completamente. Por lo
general, si se quiere alcanzar un alto grado de pureza, es necesario recurrir a varios mtodos diferentes que se
basen en diferentes propiedades de la enzima en cuestin. Desafortunadamente, el establecimiento de un
protocolo de purificacin es un problema de prueba y error: hay que probar procedimientos y luego
seleccionar. Una aproximacin es partir de protocolos ya probados aunque las condiciones experimentales
deben ajustarse para cada muestra en particular.
Aparentemente los distintos mtodos pueden usarse en cualquier orden y el mejor orden se determina
experimentalmente. Sin embargo, existen ciertas restricciones que hacen que haya un orden lgico. En
general se empieza por mtodos que tienen una alta capacidad, que son rpidos y fciles de desarrollar, y se
sigue con mtodos de baja capacidad y alta resolucin. La capacidad se refiere a la cantidad de muestra que
puede procesarse y la resolucin se refiere a la habilidad de un mtodo para separa la protena de inters de
otras presentes en el extracto. Normalmente a medida que aumenta la resolucin de la tcnica el tiempo que
insume tambin aumenta y la capacidad disminuye (Tabla 3).
Mtodo Generalmente
Decrece capacidad aumenta resolucin aumenta tiempo y
esfuerzo
diferencia de
solubilidad
intercambio inico
adsorcin
hidrofobicidad
electroforesis
HPLC
Excepciones gel filtracin (baja capacidad, baja resolucin)
cromatografa de afinidad (depende del ligando)
Tabla 3. Cuadro comparativo de la capacidad y resolucin de distintas tcnicas de fraccionamiento proteico
Generalmente los mtodos de precipitacin (salina, por solventes orgnicos e isoelctrica), son utilizados en
las etapas iniciales del proceso de purificacin; debido a que permiten concentrar la muestra y por lo tanto
disminuir su volumen. En cambio, los procedimientos cromatogrficos (intercambio inico, cromatografa de
exclusin molecular, cromatografa de adsorcin, etc), son utilizados luego que la enzima a sido parcialmente
purificada por una tcnica de precipitacin.
26
Control de la purificacin
Para evaluar que tan efectivo fue un proceso de purificacin en su conjunto o en cada una de sus etapas, se
definen dos parmetros que cuantifican la eficacia del proceso, porcentaje de recuperacin o
rendimiento (%R) y factor de purificacin (FP).
El porcentaje de recuperacin indica cuanta protena de inters haba en el extracto original y cuanto hay al
final del proceso o en cada una de las etapas, esto es bastante fcil en la purificacin de enzimas ya que estos
clculos se realizan respecto a la enzima activa.
% R = actividad total de la fraccin x 100

actividad total del extracto
El factor de purificacin es la relacin entre la cantidad de protena de inters frente a la cantidad de

protenas totales en el extracto original y lo obtenido al final del proceso o en cada una de las etapas, el caso
de enzimas es la relacin entre la actividad especfica en el crudo y lo obtenido al final; indica cuanta
protena contaminante se pudo eliminar.
FP = actividad especfica (AE) de la fraccin

actividad especfica (AE) del extracto
Estos resultados suelen mostrarse en forma de tabla o cuadro de purificacin (Tabla 4). Los aspectos
cualitativos de un proceso de purificacin se analizan en una elecroforesis, donde se ve efectivamente si
hay o no otras protenas.
Protenas Actividad %R FP
Etapa de la
purificacin vol. mg/mL mg totales U/mL U totales AE
Tabla 4. Cuadro de purificacin
Por lo general un proceso de purificacin consiste en una secuencia de operaciones o etapas en las cuales los
contaminantes (especialmente proteicos) van siendo subsecuentemente removidos aumentando la actividad
27
especfica de la enzima. Cada etapa de purificacin significa, sin embargo, una prdida de actividad
enzimtica. Por lo tanto se ha de llegar a un compromiso entre el factor de purificacin y el rendimiento
deseado. A nivel industrial, la tendencia es sacrificar pureza en beneficio de rendimiento; en usos analticos
o mdicos , a la inversa, el rendimiento tendr una importancia relativa menor.
Criterios de homogeneidad
Cuando una purificacin enzimtica ha alcanzado la etapa donde posteriores purificaciones o pasos no
producen un incremento en la actividad especfica, pueden investigarse con mtodos analticos la
homogeneidad y pureza de la preparacin obtenida. Pueden utilizarse mtodos cromatogrficos,
electroforesis, ultracentrifugacin, focalizacin isoelctrica, espectrometra de masas, identificacin del
residuo amino terminal. La obtencin de un nico pico proteico es indicativo de homogeneidad, si esto ha
sido comprobado por varios de los mtodos mencionados.
Proteccin de la actividad enzimtica durante el proceso de purificacin
Es importante que se retenga la mxima actividad durante el proceso de purificacin de la enzima de inters.
Dado que las enzimas son sustancias relativamente frgiles es esencial evitar condiciones en las cuales son
inestables. Es as que las purificaciones deben llevarse a cabo sin prdidas intiles de tiempo, y lo ms
conveniente, en general, es guardar las preparaciones en heladera. Si el fin de la purificacin es estudiar las
propiedades funcionales y estructurales de la enzima, es necesario obtenerla y mantenerla en su forma nativa.
Si en cambio la enzima purificada va a ser utilizada para estudiar su secuencia aminoacdica, la
desnaturalizacin tiene una mnima influencia.
Con el fin de mantener a la enzima en su forma activa, deben evitarse:
- altas temperaturas y acidez o alcalinidad extrema: durante el aislamiento y la purificacin conviene, en
general, trabajar entre 0 y 4C, y evitar pH mayor que 9 o menor que 5.
- formacin de espuma: esto es un indicador de desnaturalizacin proteica. Es as que cuando se transfiere
una solucin de enzima de un recipiente a otro debe ser vertida por las paredes del recipiente.
- protelisis: esto es ms probable que ocurra en las primeras etapas de extraccin y purificacin cuando las
proteasas endgenas responsables del recambio proteico en las clulas vivientes an se encuentran
presentes. La mejor forma de evitar la protelisis es remover las proteasas contaminantes rpidamente o
inhibir su actividad proteoltica. Mientras esto no se hace, es importante mantener las preparaciones
enzimticas a baja temperatura.
- contaminacin: manteniendo la limpieza del material utilizado, dado que las protenas en soluciones
acuosas son excelentes sistemas nutritivos para los microorganismos
28
3.1.4- Formulacin
Esta etapa es necesaria en el caso de un proceso de produccin enzimtica a nivel industrial. Consiste en el
acabado y normalizacin del producto enzimtico.
El acabado tiene por objeto dar forma definitiva al producto enzimtico y preservar su actividad durante su
perodo de almacenamiento y comercializacin. El mismo incluye las operaciones de desalinizacin,
esterilizacin, concentracin y/o secado, estabilizacin por adicin de preservantes, y recubrimiento. Dentro
de los preservantes habituales se encuentran: sales inorgnicas, protenas inertes, polialcoholes, azcares y
glicoles. Existen adems preservantes especficos como sustratos, cofactores e inhibidores disociables,
agentes quelantes, inhibidores de proteasas, reactivos sulfhidrilo para el caso de enzimas que tengan en su
sitio activo grupos oxidables (como es el caso de la -galactosidasa); y agentes antimicrobianos.
La normalizacin consiste en especificar la estabilidad de almacenamiento y la actividad especfica del

producto enzimtico, utilizando la unidad internacional (UI) como medida de la actividad enzimtica. A su
vez la estabilidad deber especificarse en funcin del tiempo de vida media a determinada temperatura.
Referencias.
Bollag, D., Rozycki, M., Edelstein, S., En: Protein Methods, 2 da edicin, Wiley- Liss Inc, (1996).
Graz, V., En: -galactosidasas: distribucin, propiedades y aplicaciones, Trabajo Especial I de la

Licenciatura en Bioqumica, Facultad de Ciencias, Universidad de la Repblica Oriental de Uruguay, (1997).
Illanes, A., En: Biotecnologa de Enzimas, Monografa N 35 de la OEA, Ediciones Universitarias de

Valparaso de la Universidad Catlica de Valparaso, (1994).
Jakoby, W., En: Enzyme purification and related techniques. Methods in Enzimology Vol XX Secc VIII:
Large Scale Methods, Academic Press, New York, (1981).
29
Captulo 4 Aplicaciones industriales de las enzimas
4- Aplicaciones de las enzimas.
La produccin y aplicacin de enzimas es una de los principales intereses de la biotecnologa moderna. El

uso de enzimas en procesos industriales es cada vez ms importante.
Las aplicaciones comerciales e industriales de las enzimas se realizan desde hace siglos. Actualmente,
debido a la expansin de su uso y a los avances biotecnolgicos, se cuenta con un mayor numero de enzimas
disponibles a un costo relativamente ms bajo y un mayor conocimiento de sus cualidades y aplicaciones
potenciales.
Un ejemplo de esto, es el caso de las proteasas (enzimas que hidrolizan protenas) de origen pancretico que
fueron patentadas para ese uso en el lavado de ropa en 1913 pero presentaban baja estabilidad en la
preparacin. En 1953-64, las Industrias Novo de Dinamarca han optimizado la produccin industrial de la
proteasa alcalina, subtilisina, secretada en grandes cantidades por Bacillus subtilis, para su uso en
detergentes bioactivos. Sus propiedades de alta estabilidad a pH alcalinos en la presencia de fosfato y otros
ingredientes de los detergentes y mantener su actividad proteoltica hasta la temperatura de 60C la hacen
particularmente adecuada para este fin.
Las aplicaciones ms importantes de las enzimas son en las siguientes reas:

Industria alimentaria y agrcola
Industria farmacutica
Industria qumica
Mtodos analticos
Investigacin mdica.
Los principales usos de las enzimas en stas reas se resumen en la tabla I.
30
Enzima Reaccin Fuente Aplicacin

Industriales
-amilasa Hidrlisis de almidn Bacillus sp. Conversin del almidn en
glucosa y dextranos en
industria alimentaria.
Amiloglucosidasa Hidrlisis de dextrinas. Aspergillus sp. Produccin de glucosa
monomrica.
Glucosa isomerasa Conversin de glucosa en Streptomyces sp. Produccin de jarabes de
fructosa. fructosa.
Subtilisina Hidrlisis de protenas. Bacillus sp. Detergentes
Tripsina y Hidrlisis de protenas. Pncreas Maceracin de cueros.
quimiotripsina
Quimosina Hidrlisis de protenas. Estmagos de Coagulacin de la leche en la
animales jvenes produccin de quesos.
Papana Hidrlisis de protenas. Ltex de Carica En la elaboracin de cerveza
papaya
-galactosidasa Hidrlisis de lactosa de la Aspergillus sp, E. coli, Hirlisis de lactosa en leche y
leche a glucosa y galactosa Kluyveromyces lactis lactosuero.
Aminocilasa Hidrlisis de l-aminocidos Aspergillus sp. Resolucin de mezclas
acilados racmicas.
Medicos
l-asparaginasa Eliminacin de l-asparagina Escherichia coli Quimioterapia para cncer,
esencial para crecimiento de especialmente en leucemia.
tumores.
Uroquinasa Activacin del Orina humana Remocin de cogulos de
plasmingeno fibrina.
Analticas
Glucosa oxidasa Oxidacin de la glucosa Aspergillus niger Deteccin de glucosa en
sangre.
Luciferaza bioluminiscencia Bacterias marinas / Ensayos bioluminiscencia
liblula para ATP, etc.
Peroxidasa Oxidacin de un colorante Rbano Cuantificacin de hormonas o
usando H2O2 anticuerpos
Ureasa Hidrlisis de urea a CO2 y Habas Medicin de urea en fluidos
NH3 corporales
Manipulativas
Lisozima Hidrlisis de enlaces Clara de huevo de Rompe los mucopeptidos de
glucosdicos 1-4 gallina. la pared celular bacteriana
Nucleasas Hidrlisis de enlaces Bacterias Manipulacin gentica.
fosfodiester de cidos
nucleicos
Tabla 1. Aplicaciones de las enzimas.
31
De los cientos de enzimas utilizadas industrialmente, ms del 50% provienen de hongos y levaduras, por
encima del 33% son bacterianas y el resto se divide entre las de origen animal (8%) y vegetal (4%).
4.1- Enzimas microbianas.

Las enzimas provenientes de hongos, levaduras y bacterias pertenecen a un numero limitado de stos
microorganismos, predominando Aspergillus sp., Bacillus sp. y Kluyveromyces sp. Las causas de esta
preferencia son varias:
Las enzimas animales y vegetales son ms difciles de recolectar y almacenar. El crecimiento de
microorganismos y la produccin de enzimas es fcilmente controlado. Es posible manejar la
capacidad de los fermentadores de acuerdo a las fluctuaciones en la demanda del producto.
En general resulta ms econmico producir enzimas microbianas que animales o vegetales.
Los microorganismos pueden utilizar para crecer un amplio rango de sustratos. Se pueden incorporar
molculas inductoras a los fermentadores para inducir la sntesis de enzima. La inhibicin de la
sntesis de enzima por retroalimentacin puede evitarse al tener la posibilidad de limitar la
acumulacin del producto y de reemplazar los nutrientes que se consumen ms rpidamente.
Se pude realizar mutaciones para producir cambios menores en la estructura de la enzima que resulten
en una caracterstica alterada de la enzima como por ejemplo insensibilidad a un inhibidor natural.
Esto permite la produccin potenciada de enzima en grandes cantidades.
Un ejemplo de enzimas microbianas aplicadas en procesos industriales es la -galactosidasa, la enzima que

hidroliza la lactosa. Esta enzima se produce comercialmente para su uso en la industria lctea. La lactosa,
o azcar de la leche, es relativamente insoluble resultando un problema en muchos productos lcteos. En la
produccin de helado, la hidrlisis de lactosa, mejora las propiedades de textura, dulzor y tendencia a
cristalizar. Algunas personas carecen de -galactosidasa, la enzima que hidroliza la lactosa en el intestino
delgado, por lo tanto no pueden digerir la lactosa de la leche o de los productos lcteos que contengan
lactosa. El pre-tratamiento de la leche genera un producto libre de lactosa adecuada para el consumo por
parte de la poblacin intolerante a ste carbohidrato.
4.2- Enzimas animales.
Las enzimas animales son poco aplicadas en procesos industriales. Ellas son utilizadas frecuentemente en la
produccin de agentes teraputicos o reactivos analticos.
Como ejemplo se puede citar los activadores del plasmingeno. Es un grupo de enzimas proteolticas que
actan sobre una molcula precursora inactiva presente en la sangre llamada plasmingeno que al ser
32
removida parte de su secuencia se libera la enzima activa plasmina. La plasmina destruye la red de fibrina de
un cogulo sanguneo. La uroquinasa es el activador del plasmingeno humano ms conocido pero su
produccin es muy cara. Para realizar un tratamiento sera necesario extraer uroquinasa de 500 L de orina.
Los activadores de plasmingeno producidos por tejidos son ms especficos en su accin y pueden ser
producidos en cultivo de clulas humanas. Aunque esto representa una alternativa, para la produccin de una
droga ms econmica y eficiente, los cultivos de clulas animales presentan mayores problemas que los de
microorganismos. La estreptoquinasa, una enzima bacteriana, tambin puede ser utilizada como activador del
plasmingeno, pero es relativamente inespecfica en su accin y puede producir reacciones inmunolgicas
severas en el paciente.
4.3- Enzimas recombinantes.
Los recientes desarrollos de la gentica microbiana han creado un nuevo potencial para la produccin de
enzimas. Pueden usarse tcnicas de ingeniera gentica para manipular el DNA de forma que pueden generarse
copias mltiples de un gen particular que codifique para una enzima de inters comercial. Esto se logra
insertando el gen que interesa a una pequea molcula de DNA bacteriana (plsmido) que puede replicarse
independientemente de los cromosomas. El gen es integrado dentro del plsmido formando una molcula de
DNA recombinante que puede ser insertada en un husped adecuado. Los plsmidos pueden replicarse a una
velocidad superior que el DNA cromosomal produciendo varios cientos de copias por clula. Pueden
producirse grandes cantidades de la protena codificada por el gen clonado. Los genes procariticos pueden ser
expresados en clulas bacterianas si se encuentran presentes las secuencias reguladoras adecuadas antes de la
secuencia codificante.
Los genes eucariotas tambin pueden ser clonados en clulas bacterianas pero no siempre ocurre la produccin
de protenas activas debido a que muchas de stas enzimas para estar activas deben ser modificadas luego de la
traduccin. Los procesamientos post-traduccionales pueden involucrar glucosidaciones o hidrlisis de
secuencias peptdicas que las clulas procariotas no pueden realizar. Existe la alternativa del uso de clulas de
levaduras y hongos como huspedes para el clonado que s pueden realizar este tipo de procesamiento debido a
que son clulas eucariotas. Actualmente, son producidas en clulas de levadura enzimas recombinantes de
mamferos biolgicamente activas entre las que se destacan: lisozima, quimiosina y el activador del
plasmingeno.
El clonado de genes tambin permite re-disear enzimas en un forma racional (ingeniera gentica). Se altera
un aminocido preciso de la enzima nativa para mejorar sus caractersticas. Existen mtodos que permiten
cambiar una base especfica en una hebra de DNA (mutagnesis dirigida) y luego clonar el gen y expresarlo
en un husped adecuado para producir la enzima re-diseada.
33
Estos desarrollos han sido aplicados a enzimas de inters industrial.

La quimosina es una de las proteasas ms importantes en la industria alimentaria. Esta enzima produce la
coagulacin de la leche en la manufactura del queso mediante protelisis limitada. Tradicionalmente, la
quimosina era obtenida del estmago de terneros jvenes, pero se encuentra en baja concentracin. Esto ha
llevado al uso de sustitutos, generalmente de origen microbiano. Actualmente se produce de forma
recombinante.
La -amilasa de B.subtilis se desnaturaliza por calentamiento. Esta enzima cataliza la conversin de
almidn en glucosa que se ve acelerada a altas temperaturas. Se ha obtenido una -amilasa recombinante
termoestable mediante clonado en B. subtilis del gen de la -amilasa de un organismo termoestable.
La subtilisina, utilizada actualmente en detergentes bioactivos, se ha mejorado genticamente obtenindose
una enzima con mayor resistencia a la oxidacin.
Bibliografa.
Enzimas-campos de aplicacin. En: Folleto Tcnico de Novo-Nordisk a/s (1989). Dinamarca.
34

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Captulo 1 Naturaleza y clasificacin de enzimas

Martha Ubalde (Laboratorio de Enzimas hidrolticas, Facultad de Ciencias)

Responsable: Prof. Ana Mara Cantera

1- Naturaleza y clasificacin de enzimas.

reaccin sin enzima

reaccin con enzima

A diferencia de los catalizadores inorgnicos las enzimas actan en condiciones moderadas de pH y

1.3- Muchas enzimas necesitan de componentes no enzimticos

A continuacin se enumeran un grupo de enzimas que requieren cofactores.

Enzima Clase Cofactores Tipo de cofactor

Glucosa oxidasa Oxidoreductasa FAD Grupo prosttico

1.4- Clasificacin y nomenclatura de enzimas.

clase tipo de reaccin que catalizan

IUBMB nomenclature Homepage, http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/

2.1- Influencia de la concentracin del sustrato en la actividad enzimtica

Figura 1. Grfico de velocidad de la reaccin enzimtica en funcin de la concentracin de sustrato

La transformacin de sustrato en producto implica la formacin de un complejo enzima-sustrato (ES) , que

v = Vmax [S] / Km + [S]

donde Km = k2 +k3 / k1 y Vmax = K3 [ET]

El desarrollo matemtico de esta deduccin se puede encontrar en cualquier texto de Bioqumica.

En trminos experimentales Km es numricamente igual a la concentracin de sustrato a la cual la velocidad

Cuando [S]= Km entonces v = Vmax / 2

Tabla 1. Valores de Km de la enzima -galactosidasa para distintos sustratos

Concentracin de sustrato relativa a Km Velocidad observada relativa a velocidad

Tabla 2. Relacin entre concentracin de sustrato y velocidad de la reaccin enzimtica

Tabla 3. Nmeros de recambio de algunas enzimas

2.1.1- Determinacin de parmetros cinticos.

La grfica de velocidad en funcin de la concentracin de sustrato (Figura 1) es una hiprbola rectangular.

Figura 2. Representacin de Lineweaver-Burk de la ecuacin de Michaelis-Menten

2.2- Medida de velocidad

Al reordenar la ecuacin de Michaelis-Menten de la siguiente forma: v= k3 x [ET]

2.2.1- Cmo medir velocidades iniciales?

Figura 3. Grfico de concentracin de producto en funcin del tiempo

Figura 4. Efecto de la concentracin de la enzima en la velocidad de reaccin.

2.3- Influencia del pH y la temperatura

pH o temperatura ptima: es aquel pH o temperatura a la cual la enzima presenta su mxima actividad.

2.3.1- Efecto de la temperatura

2.3.1.1- Actividad enzimtica en funcin de la temperatura

La influencia de la temperatura en la actividad de las enzimas se representa generalmente en las llamadas

Figura 5. Grfico de velocidad en funcin de la temperatura.

2.3.1.2- Estabilidad de la enzima en funcin de la temperatura

Tem peratura (C)

Figura 6. Estabilidad enzimtica frente a la temperatura

2.3.1.3 Estabilidad trmica en funcin del tiempo

La inactivacin trmica es un efecto progresivo. El decaimiento de la actividad enzimtica en funcin del

At= Ao x e kt At= Actividad a un tiempo dado

Figura 7. Logaritmo de la actividad enzimtica en funcin del tiempo

El coeficiente de inactivacin (k) es igual a la pendiente del grfico de la Figura 8. El coeficiente k no es

t1/2 = ln 0,5 = 0,693 Ecuacin 1

2.3.2- Efecto del pH

Figura 8. Curva de actividad en funcin del pH

encuentran en forma mayoritaria a ese pH son catalticamente activas.

2.4- Efecto de los inhibidores sobre las enzimas.

En la Figura 9 podemos encontrar las linealizaciones de Lineweaver-Burk correspondientes a los distintos

Figura 9. Linealizaciones de Lineveawer-Burk de los distintos tipos de inhibicin reversible.

Tipo de inhibidor Esquema de reaccin Efecto cintico

inhibidor competitivo k1 k3 - Km se ve aumentada

inhibidor no competitivo k1 k3 - Km no es alterada

inhibidor acompetitivo k1 k3 - Km disminuye

Tabla 5. Principales caractersticas de los distintos tipos de inhibicin irreversible

En el caso de la inhibicin irreversible el inhibidor no se encuentra en equilibrio con el complejo enzima-

Hartmeier, W., En: Immobilized biocatalysists; Springer-Verlag, Berlin, (1988).

3- Extraccin y purificacin de enzimas