4/4/2017

BIOLOKA OKSIDACIJA

Savremena koncepcija:

Bioloka oksidacija zapoinje dehidrogenacijom

molekula supstrata.

Reducirajui ekvivalenti koje dehidrogenaze veu, prenose se sistemom

citohroma do molekulskog kisika, koji se u prisustvu ovih ekvivalenata
i citohrom-oksidaze reducira do aktivnog kisika i gradi vodu. Veliki
broj enzima i prenosioca koji prenose reducirajue ekvivalente
od supstrata do molekulskog kisika smjeteno je u unutranjoj
membrani mitohondrija i ini RESPIRATORNI LANAC.

1
 4/4/2017

Na nivou respiratornog lanca oksidira se veina organskih

tvari, koje se u organizmu kataboliziraju do odreenih
meuprodukata (npr. acetil-CoA, acil-CoA, glicerol-3-
fosfat, sukcinat, malat, glutamat, izocitrat, beta-
hidroksibutanska kiselina itd.) koji predstavljaju supstrat za
proces bioloke oksidacije. Posebnu vanost ima acetil-
CoA, koji nastaje iz svih organskih tvari (masti, proteina i
ugljikohidrata), ija se postepena razgradnja do CO2 i H2O
odvija biolokom oksidacijom preko citratnog ciklusa (CC)
i respiratornog lanca.

Nakon to su E. Kennedy i A. Lehninger sredinom prolog

stoljea (1948.g.) otkrili da su mitohondriji mjesto

oksidativne fosforilacije u eukariota, poela je nova faza

izuavanja biolokih energetskih procesa.

2
 4/4/2017

Mitohondrij ovjeka, kao i gram-negativne bakterije, ima

dvije membrane (vanjsku i unutranju).

Vanjska mitohondrijska membrana

lahko propusna za male molekule (Mr<5000) i jone (kreu
se slobodno kroz transmembranske kanale nastale od
integralnih membranskih proteina nazvanih porini).

Unutranja mitohondrijska membrana

nepropusna za veinu malih molekula i jona (ukljuujui i
H+). Vrste koje prolaze membranu ine to pomou
specifinih prenosilaca.

Biohemijska anatomija mitohondrija.

Nakupine unutranje membrane
osiguravaju vrlo veliku aktivnu povrinu.
Unutranja membrana jednog mitohondrija
hepatocita jetre moe imati vie od 10000
skupova elektronskih prenosnih sistema
(respiratorni lanci) i molekula ATP sintaze
distribuiranih preko povrine membrane.
Mitohondrij sranog miia, koji ima
razasutije endopl. retikulume i tako mnogo
veu povrinu unutranje membrane,
sadri trostruko vie elektronskih
prenosnih sistema od mitohondrija
hepatocita jetre. Mitohondrijska smjesa
(pool) koenzima i meuprodukata je
funkcionalno odvojena od citosolnog pool-
a. Mitohondriji beskimenjaka, biljaka i
mikrobnih eukariota slini su mitohondriju
prikazanom ovdje, ali sa znatnim
varijacijama u veliini, obliku i stepenu
nakupina unutranje membrane.

3
 4/4/2017

Unutranja mitohondrijska membrana sadri komponente

respiratornog lanca (mitohondrijske komplekse I-IV i ATP-
sintazu).

Mitohondrijski matriks (koji nalijee na unutranju membranu)

sadri piruvat-dehidrogenaza kompleks i enzime citratnog
ciklusa, enzime procesa -oksidacije masnih kiselina,
enzime oksidacije aminokiselina, tj. sve procese oksidacije
hranjivih tvari osim glikolize koja se odvija u citosolu.

Oksidativna fosforilacija zapoinje ulaskom elektrona u

respiratorni lanac.

Elektroni uglavnom potiu od aktivnosti dehidrogenaza

koje ih skupljaju iz katabolikih procesa, te ih usmjeravaju
ka univerzalnim elektronskim akceptorima:
nikotinamidnim nukleotidima (NAD+ ili NADP+) ili
flavinskim nukleotidima (FMN ili FAD).

4
 4/4/2017

NAD i NADH.
a) Nikotinamidadenin-dinukleotid (NAD+) i njegov fosforilirani analog (NADP+) trpe redukciju do NADH i
NADPH, prihvatajui hidridni anion (dva elektrona i jedan proton) od oksidirajueg supstrata. Hidridni anion
se adira ispred (A strana) ili iza (B strana) ravni nikotinamidnog prstena. b) UV apsorpcioni spektar NAD+ i
NADH. Redukcija nikotinamidnog prstena daje novu, iroku apsorpcionu traku sa maksimumom pri 340 nm.
Nastajanje NADH tokom enzimski katalizirane reakcije moe se pratiti mjerenjem apsorbanse na 340 nm
(molarni koef. ekstinkcije 6200 mol-1dm3cm-1).

Mitohondrijski respiratorni lanac sastoji se od brojnih

elektronskih prenosilaca, od kojih su veina sastavni
proteini sa prostetikim grupama sposobnim da prime ili
doniraju jedan ili dva elektrona.

U oksidativnoj fosforilaciji mogu se desiti tri tipa elektronskih

prelaza:
1) Direktni prenos elektrona (npr. pri redukciji Fe3+ u Fe2+);
2) Elektronski prelaz pri prenosu atoma vodika (H+ + e-);
3) Prelaz elektrona pri prenosu hidridnog aniona (:H-), pri
emu se prenose dva elektrona.
Termin reducirajui ekvivalent koristi se da oznai
jednoelektronski ekvivalent preneen u oksido-redukcijskoj
reakciji.

5
 4/4/2017

Pored nikotinamidnih i flavoproteina, u respiratornom lancu

funkcioniraju jo tri elektron-prenosne molekule:

hidrofobni kinon (ubikinon) i

citohromi i eljezo-sumpor proteini (dva razliita tipa

proteina sa eljezom).

Ubikinon (koenzim Q ili samo Q) je liposolubilni benzokinon

sa dugim izoprenoidnim bonim lancem:

Ubikinon (Q ili
koenzim Q).
Potpuna redukcija
koenzima Q zahtijeva
dva elektrona i dva
protona, a odvija se u
dva koraka preko
semikinonskog
radikalskog
meuprodukta.

6
 4/4/2017

Koenzim Q moe primiti jedan elektron i prei u semikinon-

radikal (QH) ili dva elektrona, pri emu prelazi u ubikinol
(QH2) i (kao i flavoproteinski prenosioci) moe djelovati u
prelazima izmeu dvoelektronskog donora i
jednoelektronskog akceptora.

Poto je Q niskomolekularna hidrofobna molekula, on

lahko difunduje unutar lipidnog dvosloja unutranje
mitohondrijske membrane i moe usmjeriti reducirajue
ekvivalente izmeu drugih, manje mobilnih elektronskih
prenosilaca u membrani.

Obzirom da su ti prenosioci ujedno i elektroni i protoni (proton

nema elektrone, ali ih moe primiti), on ima kljunu ulogu u
uvezivanju elektronskog protoka za kretanje protona.

7
 4/4/2017

Citohromi su proteini sa karakteristino jakom apsorpcijom

u vidljivom podruju, zahvaljujui hem-prostetikim
grupama. Mitohondrij sadri tri tipa citohroma (a, b i c).

Prostetike grupe citohroma.

Svaka grupa sastoji se iz etiri peterolana azotova heterociklusa u konanoj ciklinoj strukturi
nazvanoj porfirin. etiri atoma azota su koordinirana sa centralnim jonom eljeza (Fe2+ ili Fe3+). Fe-
protoporfirin IX naen je u b tipu citohroma, te u hemoglobinu i mioglobinu. Hem c je kovalentno vezan
za protein citohroma c preko tioesterskih veza sa dva cisteinska ostatka. Hem a, naen u a-tipu
citohroma, ima dugi izoprenoidni lanac vezan za jedan od peterolanih prstenova. Konjugirani sistem
dvostrukih veza (ruiasta boja) porfirinskog prstena doprinosi apsorpciji u vidljivom dijelu spektra.

8
 4/4/2017

Svaki tip citohroma u njegovom reduciranom (Fe2+) stanju

ima tri apsorpcione trake u vidljivom podruju (blizu 600
nm odgovara tipu a citohroma, 560 nm tipu b, a blizu 550
nm tipu c):

Apsorpcioni spektri
citohroma c (cyt c) u
njegovom oksidiranom
(crvena linija) i reduciranom
(plava linija) obliku.
Takoer su oznaene i karakteristine
, i trake (pikovi) reduciranog
oblika.

Hem kofaktori a i b citohroma su vrsto (nekovalentno)

vezani sa njihovim proteinima (kod c tipa citohroma hem je
kovalentno vezan sa proteinima preko cisteinskih ostataka).
Citohrom c je topivi protein meumembranskog
prostora. Nakon to njegov hem privue elektron iz
kompleksa III, citohrom c se pomjera ka kompleksu IV
donirajui elektron na binuklearni Cu(II)-centar.

9
 4/4/2017

U eljezo-sumpor (Fe-S) proteinima, eljezo nije prisutno u vidu hema

(nehemski proteini), ve povezano sa atomima anorganskog sumpora ili
atomima sumpora cisteinskih ostataka ili na oba ova naina. Ovi Fe-S
centri mogu biti u vidu jednostavnih struktura, sa jednim atomom Fe
koordiniranim sa etiri Cys-SH grupe (struktura a), do kompliciranijih Fe-
S centara sa dva ili etiri atoma Fe (strukture b i c):

eljezo-sumpor centri.
Fe-S centri Fe-S proteina mogu biti jednostavne strukture (a) sa jednim atomom Fe okruenim S
atomima etiri cisteinska ostatka. Drugi centri ukljuuju atome anorganskog i cisteinskog S kao npr.
2Fe-2S (b) ili 4Fe-4S centre.
(Fe je oznaeno crvenom, anorganski S utom, a cisteinski S narandastom bojom).

Svi Fe-S proteini sudjeluju u jednoelektronskim prelazima

u kojima se atom Fe iz Fe-S klastera oksidira ili reducira.
Minimalno osam Fe-S proteina funkcionira u
mitohondrijskom prenosu elektrona. Redukcioni
potencijal ovih proteina varira od -0,65 do +0,45, ovisno o
mikrookruenju atoma Fe unutar proteina.

10
 4/4/2017

Metoda za odreivanje redoslijeda elektronskih prenosilaca.

Ova metoda mjeri efekte inhibitora elektronskog prenosa na oksidacijsko stanje svakog
prenosioca. U prisustvu elektron-donora i O2, svaki inhibitor uzrokuje karakteristinu
shemu oksidoredukcije datih prenosilaca: oni prije inhibicije postaju reducirani (plava
boja), a oni nakon inhibicije postaju oksidirani (ruiasta boja).

Elektronski prenosioci raspiratornog lanca organizirani su u

membranski-ugraene, fiziki odvojene supramolekularne
komplekse.

Blagi tretman unutranje mitohondrijske membrane sa

deterdentima omoguava razdvajanje etiri jedinstvena
kompleksa elektronskih prenosioca:

11
 4/4/2017

Separacija funkcionalnih kompleksa

respiratornog lanca.
Prvo se ukloni vanjska mitohondrijska membrana
tretmanom sa deterdentom digitoninom. Zatim se
fragmenti unutranje membrane dobiju osmotskom
lizom, a potom se polagano otope u drugom
deterdentu. Nastala smjesa proteina unutranje
membrane razdvoji se jonoizmjenjivakom
hromatografijom na razliite komplekse (I IV)
respiratornog lanca i ATP-sintazu (kompleks V).

Proteinske komponente mitohondrijskog transportnog lanca elektrona

Enzimski kompleks Mr Broj Prostetike grupe

ili protein (kDa) subjedinica*

I NADH-dehidrogenaza 850 43 (14) FMN, Fe-S

(NADH : koenzim Q-oksidoreduktaza)

II Sukcinat-dehidrogenaza 140 4 FAD, Fe-S

III koenzim QH2 : citohrom c 250 11 Razliiti tipovi hema;

oksidoreduktaza Fe-S
(citohrom bc1 kompleks)
Citohrom c 13 1 Hem

IV Citohrom-oksidaza 160 13 (3-4) Razliiti tipovi hema;

(Citohromi a i a3) CuA, CuB
* Brojevi u zagradama oznaavaju ekvivalentni broj subjedinica u bakterijama.
Citohrom c nije dio enzimskog kompleksa; kree se izmeu kompleksa III i IV kao slobodni topivi protein.

12
 4/4/2017

Kompleksi I i II kataliziraju prelaz elektrona od dva razliita

elektron-donora [od NADH (kompleks I) i od sukcinata
(kompleks II)] do Q.
Kompleks III nosi elektrone od reduciranog Q (QH2) do
citohroma c, a kompleks IV zavrava sekvencu prenosom
elektrona od citohroma c na O2.
Kompleks I (NADH : koenzim Q-oksidoreduktaza ili NADH-

dehidrogenaza) je veliki enzim sastavljen od 42 razliita

polipeptidna lanca; ukljuuje flavoproteine sa FMN i
minimalno est Fe-S centara. Kompleks je L-oblika sa
jednom rukom u membrani, a drugom u izduenom u
matriks.

Kompleks I katalizira dva simultana i vjerovatno uvezana

procesa:
1) Prenos protona iz matriksa i elektrona u vidu hidridnog
aniona sa NADH na Q:
2) Prenos etiri protona iz matriksa u meumembranski
prostor.
Kompleks I je, prema tome, protonska pumpa upravljana
energijom elektronskog prenosa, a reakcija koju ovaj
kompleks katalizira je strogo usmjerena: pokree
protone sa jednog mjesta (matriksa) do drugog
(meumembranski prostor):

13
 4/4/2017

Kompleks I (NADH : koenzim Q

oksidoreduktaza ili NADH-
dehidrogenaza).
Katalizira prenos hidridnog aniona sa
NADH na FMN sa kojeg dva elektrona
prolaze kroz seriju Fe-S centara do Fe-S
centra N-2 u matriksnoj ruci kompleksa.
Prenos elektrona sa N-2 na ubikinon na
membranskoj ruci formira QH2, koji
difundira u lipidni dvosloj. Ovaj prenos
elektrona takoer upravlja otputanjem
etiri protona iz matriksa po svakom paru
elektrona. Protok protona stvara
elektrohemijski potencijal kroz unutranju
mitohondrijsku membranu (N strana je
negativna, a P strana pozitivna).

Strukturni model kompleksa II

(sukcinat-dehidrogenaza).
Kompleks (izoliran iz srca svinje)
ima dvije transmembranske
subjedinice (C i D) i dvije
subjedinice (A i B) u matriksu
(citoplazmi). Na subjedinici A
nalazi se vezujue mjesto za
sukcinat (FAD). Subjedinica B
(na koju se vee koenzim Q) ima
tri Fe-S centra, a hem b se
nalazi izmeu C i D. Elektroni se
kreu sa sukcinata na FAD
(plave linije), zatim kroz tri Fe-S
centra do koenzima Q. Hem b ne
uestvuje u glavnom putu
prenosa elektrona, ali doprinosi
sprijeavanju nastanka
reaktivnih vrsta kisika (ROS) od
zalutalih elektrona.

14
 4/4/2017

Medicinski aspekt

Osobe sa genetskim mutacijama u subjedinicama

kompleksa II blizu hema b ili vezujueg mjesta za
koenzim Q, pate od nasljednog paraganglioma (benigni
tumori glave i vrata, najee u tijelu karotide). Ove
mutacije rezultiraju veom produkcijom ROS i moda
veim oteenjem tkiva tokom oksidacije sukcinata.

Kompleks III (citohrom bc1 kompleks ili koenzim Q :

citohrom c oksidoreduktaza) uvezuje prenos elektrona
sa koenzima Q (tj. sa ubikinola QH2) na citohrom c sa
usmjerenim prenosom protona iz matriksa u
meumembranski prostor. Funkcionalna jedinica
kompleksa III je dimer, sa dvije monomerne jedinice
citohroma b koje okruuju udubljenje u sredini membrane,
u kojem se koenzim Q slobodno kree iz matriksa (QN
mjesto jednog monomera) u meumembranski prostor (QP
mjesto drugog monomera) i prebacuje elektrone i protone
kroz unutranju mitohondrijsku membranu.

15
 4/4/2017

Kompleks III (Citohrom bc1 kompleks).

Ovaj kompleks je dimer identinih
monomera, a svaki monomer ima 11
razliitih subjedinica. Funkcionalno jezgro
svakog monomera su tri subjedinice:
citohrom b (zelena boja) sa svoja dva hema
(bH i bL), Rieske* Fe-S protein (ljubiasta b.)
sa svojim 2Fe-2S centrima i citohrom c1
(plava b.) sa svojim hemom.
Ova skica kompleksa prikazuje kako
citohrom c1 i Rieske Fe-S protein projiciraju
sa povrine P i stupaju u interakciju sa
citohromom c (koji nije dio funkcionalnog
kompleksa) u meumembranskom prostoru.
Kompleks ima dva vezujua mjesta za
koenzim Q (QN i QP). Dimerna struktura je
vana za funkciju kompleksa III.
Meuprostor izmeu monomera formira dva
udubljenja, pri emu svako udubljenje sadri
QN s jedne strane monomera i QP sa druge
strane. Meuprodukti koenzima Q kreu se
unutar ovih udubljenja. Kompleks III
kristalizira u dvije razliite konformacije, pri
emu Rieske Fe-S centar oscilira izmeu
* Rieske Fe-S protein (po John S. Rieske, njegovom ove dvije konformacije, pri emu se ovaj
pronalazau) je tip proteina u kojem su dva liganda na protein prvo reducira, a potom oksidira.
centralnom jonu eljeza boni lanci histidina.

Utemeljeno na strukturi kompleksa III i detaljnih

biohemijskih istraivanja redoks reakcija, predloen je
odgovarajui model za tok elektrona i protona kroz
kompleks III (Q ciklus).

Ukupna reakcija za ovaj ciklus glasi:

QH2 + 2 cyt c1(oksidirani) + 2H+(N) Q + 2 cyt c1(reducirani) + 4H+(P)

16
 4/4/2017

Q ciklus (dvije faze).

Put elektrona kroz kompleks III prikazan je plavim strelicama, a kretanje razliitih oblika
koenzima Q crnim strelicama. U prvoj fazi (lijevo) Q na strani N (u matriksu) se reducira u
semikinon radikal, koji se vraa nazad da primi drugi elektron. U drugoj fazi (desno), semikinon
radikal se reducira u QH2. U meuvremenu, na P strani membrane (meumembranski prostor)
dvije molekule QH2 se oksidiraju u Q, oslobaajui 2H+ po molekuli Q (4H+ ukupno) u
meumembranski prostor. Svaki QH2 donira 1e- (preko Rieske Fe-S centra) na citohrom c1, kao
i 1e- (preko cyt b) na Q blizu matriksa, reducirajui ga u dva koraka do QH2. Ova redukcija
takoer troi 2H+ po Q, koji se preuzimaju iz matriksa. Reducirani cyt c1 propusta elektrone u
nekom vremenu na cyt c, koji disocira i nosi elektrone na kompleks IV.

Citohromi a i a3 ine posljednji IV kompleks

respiratornog lanca (citohrom-oksidazu). Ovaj enzimski

kompleks zove se i Warburgov enzim elijskog disanja,

zbog njegove uloge u aktivaciji molekulskog kisika. Citohrom

oksidaza sadri dvije molekule hema (ovaj hem se razlikuje od

hemoglobinskog, jer u poloaju 18 ima formilnu grupu umjesto metilne, a

u poloaju 3 je C2 boni lanac produen vezanjem sa farnezil ostatkom)

i dva atoma bakra. Bakar iz subjedinice I citohrom c-

oksidaze (iz citohroma a3) prenosi elektrone na O2.

17
 4/4/2017

Za potpunu redukciju O2 u H2O potrebna su 4 elektrona i 4

H+. Istovremenim primanjem dva elektrona (jednog sa Cu, a
drugog sa Fe2+ hema) O2 prelazi u peroksidni anion, ime se
sprijeava nastajanje reaktivnijeg superoksidnog radikala
(O2-). Postepenim ubacivanjem H+ i vezanjem treeg
elektrona koji pristie respiratornim lancem, dolazi do
cijepanja veze O-O u peroksid-anionu, pri emu se jedan O-
atom stabilizira kao okso-feri-hem (-O-Fe3+-hem). Iz ovog
spoja vezanjem jo jednog elektrona i jednog protona
nastaje OH jon. Dolaskom jo dva H+ zavrava se potpuna
redukcija O2:
O2 + 4e- + 4H+ 2H2O

Put elektrona kroz

mitohondrijski kompleks IV.
Tri proteina kritina za elektronski protok su
subjedinice I, II i III. Vea zelena struktura
ukljuuje 10 drugih proteina u kompleksu.
Prenos elektrona kroz kompleks IV poinje
sa citohromom c (na vrhu). Svaka od dvije
molekule reduciranog citohroma c donira
elektron u binuklearni centar CuA. Elektroni
dalje prolaze kroz hem a u Fe-Cu centar
(citohrom a3 i CuB). Kisik se sada vee na
hem a3 i reducira se u svoj peroksi derivat
(OO2-) sa dva elektrona iz Fe-Cu centra.
Prenos jo dva elektrona sa citohroma c
pretvara OO2- u dvije molekule vode, uz
potronju etiri supstratna protona iz
matriksa. U isto vrijeme, etiri protona se
upumpavaju u meumembranski prostor (iz
matriksa) jo nepoznatim mehanizmom.

Ukupna reakcija katalizirana kompleksom IV glasi:

4 cyt c(red.) + 8H+(N) + O2 4 cyt c(oks.) + 4H+(P) + 2H2O

18
 4/4/2017

Energija elektronskog prenosa efikasno se uva u

vidu protonskog gradijenta

Prenos dva elektrona iz NADH kroz respiratorni lanac

molekulskog kisika moe se predstaviti kao:

Ukupna reakcija je visoko egzergona. Za redoks par

NAD+/NADH standardni elektrodni potencijal redukcije je
E=-0,32 V, a za O2/H2O iznosi E=0,82 V.
Prema tome, E za ovu reakciju je 1,14 V, a promjena
biohemijske standardne slobodne energije za iste konc.
NADH i NAD+ (1 M) je:

19
 4/4/2017

U aktivnim respiratornim mitohondrijima, djelovanje

brojnih dehidrogenaza odrava stvarni [NADH]/[NAD+]
omjer znatno iznad 1, te je prema tome, stvarna
slobodno-energetska promjena znaajno via
(negativnija) od prethodno izraunate.

Znatan dio ove energije koristi se za pumpanje protona

izvan matriksa. Za svaki par elektrona preneen na O2,
po etiri protona se ispumpavaju kompleksima I i III, a
dva protona kompleksom IV:

Prikaz protoka elektrona i protona kroz etiri kompleksa respiratornog lanca.

Elektroni stiu na Q kroz komplekse I i II. Reducirani Q (QH2) slui kao mobilni nosa
elektrona i protona. On propusta elektrone do kompleksa III, koji ih propusta do
citohroma c. Kompleks IV zatim prenosi elektrone od reduciranog citohroma c na O2.
Protok elektrona kroz komplekse I, III i IV povezan je sa protokom protona iz matriksa u
meumembranski prostor. Elektroni osloboeni -oksidacijom masnih kiselina takoer
mogu ui u respiratorni lanac preko Q.

20
 4/4/2017

Jednosmjerna jednaina za ovaj proces glasi:

Elektrohemijska energija proizala iz ove koncentracijske

razlike u protonima i separacijom naboja predstavlja
privremeno uvanje glavnine energije elektronskog
prenosa.

Energija sauvana takvim gradijentom, nazvana

protonska pokretaka sila, ima dvije komponente:

1) hemijska potencijalna energija zbog razlike u

koncentraciji H+ u dva membranom razdvojena podruja

2) elektrina potencijalna energija koja potie iz separacije

naboja kada se H+ kree kroz membranu bez jona
suprotnog naboja:

Protonska pokretaka sila.

Unutranja mitohondrijska
membrana razdvaja dva prostora
razliitih [H+], to rezultira
razlikama u hemijskoj koncentraciji
(pH) i distribuciji naboja () kroz
membranu. Ukupni efekat je
protonska pokretaka sila (G),
koja se moe izraunati kako je
prikazano.

21
 4/4/2017

Promjena slobodne energije za nastanak elektrohemijskog

gradijenta jonskom pumpom glasi:

G = RT ln (c2/c1) + z

gdje su:
c2 i c1 koncentracije jona u dva odvojena podruja, pri emu je c2 > c1;
z je apsolutna vrijednost elektrinog naboja jona (1 za H+);
- razlika u elektrinom potencijalu kroz membranu (u voltima).

Za protone (pri 25 C):

ln (c2/c1) = 2,3(log[H+]P log[H+]N)
= 2,3(pHN pHP)
= 2,3 pH.

a jednaina 19-8 sada glasi:

= (5,7 kJ/mol)pH + (96,5 kJ/Vmol).

U aktivnim respiratornim mitohondrijima, izmjerena je

0,15-0,20 V, a pH matriksa je za 0,75 jedinica alkalniji
od onog u meumembranskom prostoru.

22
4/4/2017

23
 4/4/2017

Kada protoni teku spontano niz njihov elektrohemijski

gradijent, energija je raspoloiva za obavljanje rada. U
mitohondrijima, hloroplastima i aerobnim bakterijama,
elektrohemijska energija protonskog gradijenta upravlja
sintezom ATP iz ADP i Pi.

Zbog postojanja respiratornog lanca i odvijanja procesa

bioloke oksidacije mitohondrije se mogu nazvati nekom

vrstom elijskih toplotnih centrala, jer se dio nastale

energije koristi za termoregulaciju, a vei dio energije

prevodi se u biohemijski korisnu energiju ATP-a.

24
 4/4/2017

Pri nastanku jednog mola vode na raun atoma vodika

dobijenih od supstrata na koje su djelovale nikotinamid-
dehidrogenaze, dobivaju se 2,5 mol ATP, a od supstrata
na koje su djelovale flavin-dehidrogenaze nastaje 1,5
mol ATP. U ovim reakcijama dolazi do udruivanja
prenosa elektrona i fosforilacije ADP. Obzirom da se
uporedo sa oksidacijom organskog supstrata vri i
fosforilacija ADP, proces je nazvan OKSIDATIVNA
FOSFORILACIJA.

Novija saznanja ukazuju da je za prenos reducirajuih

ekvivalenata sa FAD-dehidrogenaznog kompleksa nakon

oksidacije acil-CoA (meuprodukti -oksidacije) na

respiratorni lanac, potreban jo jedan posrednik tzv.

flavoprotein za prenos elektrona (ETF-elektron transportni

flavoprotein). Ovaj flavoprotein reducira koenzim Q u QH2,

koji usmjerava daljnji protok reducirajuih ekvivalenata.

25
 4/4/2017

Pri transportu elektrona atom eljeza u citohromima se

naizmjenino reducira i oksidira Fe2+/Fe3+. Transport
elektrona od NADH preko koenzima Q i sistema citohroma do
molekulskog kisika moe se prikazati:

NADH Q Cyt b Cyt c1 Cyt c Cyt a Cyt a3 O2

Citohromi se nalaze u priblino ekvimolarnom odnosu, a od

svih citohroma u vodi je topiv samo citohrom c.

Mehanizam oksidativne fosforilacije

Oksidacija i fosforilacija su meusobno povezane reakcije

koje se vre uporedo. U toku ovih procesa postepeno se, uz
visoku efikasnost i kontrolu, akumulira slobodna energija (koja
nastaje oksidacijom hranjivih tvari). Za nesmetano odvijanje
oksidativne fosforilacije (OP) osim supstrata koji se oksidira
potrebno je prisustvo kisika, anorganskog fosfata (Pi) i ADP.
Najvaniji faktor koji odreuje brzinu OP je koncentracija
ADP. Regulacija brzine OP koncentracijom ADP-a
predstavlja respiratornu kontrolu.

26
 4/4/2017

Iako proces OP ima veliki znaaj, jer rezultira sintezom

ATP potrebnim za odvijanje brojnih biohemijskih procesa
u elijama ivih sistema, taan mehanizam njegovog
odvijanja jo nije potpuno odreen.

Tri hipoteze o mehanizmu OP:

hemijska,

mehaniko-hemijska i

hemiosmotska teorija (koja je danas prihvaena).

Hemijska hipoteza zasniva se na mehanizmu fosforilacije na

nivou supstrata, tj. na postojanju jednog visokoenergetskog
meuprodukta, kao prekursora ATP-a, koji povezuje
oksidaciju sa fosforilacijom. Ova hipoteza nema uporite,
jer takav produkt/meuprodukt nije izoliran.

Mehaniko-hemijska (konformaciona) hipoteza pretpostavlja

da slobodna energija oksidacije moe dovesti do
konformacijskih promjena proteina, koji vraanjem u
prvobitno stanje oslobaaju mehaniku energiju za sintezu
makroenerg. spoja ATP-a. Ni ova hipoteza nije potvrena.

27
 4/4/2017

Peter Mitchell je (1961. god.) postavio i objasnio sasvim

razliit mehanizam OP od prethodnih (hemiosmotska
hipoteza). Prema ovoj hipotezi prenos elektrona i
sintezu ATP ne povezuje ni visokoenergetski
meuprodukt, niti aktivirani protein, ve pH gradijent.

Prema ovom modelu, prenos elektrona kroz respiratorni

lanac, odnosno energija osloboena oksidacijom
organskih supstrata, pokree prenosni mehanizam za
izbacivanje (pumpanje) protona (H+) iz matriksa u
meumembranski prostor mitohondrija. Obzirom da je
unutranja membrana mitohondrija nepropusna za jone
(posebno za H+), nakupljanjem H+ na citoplazmatskoj strani
unutranje membrane mitohondrija, stvara se
elektrohemijska potencijalna razlika kroz membranu.
Ova razlika sastoji se od hemijskog potencijala (posljedica
pH gradijenta) i elektrinog potencijala (kao rezultat
promjene polarnosti membrane).

28
 4/4/2017

Ta elektrohemijska potencijalna razlika (uslovljena pH

gradijentom i membranskim potencijalom), osigurava
energiju za sintezu ATP-a, tj. dovodi do aktiviranja ATP-
sintaze (ovaj enzim mnogi autori navode kao V kompleks
respiratornog lanca). Prema ovoj teoriji, oksidacija i
fosforilacija su meusobno povezane pH gradijentom
kroz unutranju membranu mitohondrija.

Pretpostavlja se da je respiratorni lanac savijen u 3

oksidaciono-redukcione (o/r) petlje koje odgovaraju

mjestima sinteze ATP-a. Ova mjesta ujedno vre i funkciju
protonske pumpe (slika). Do sinteze ATP dolazi u
procesu vraanja protona natrag u matriks kroz
protonski kanal unutar kompleksa za sintezu ATP-a.

29
 4/4/2017

Hemiosmotski mehanizam za ATP sintezu.

a) U mitohondriju elektroni se kreu spontano kroz lanac membranski vezanih prenosilaca
(respiratorni lanac), to je uslovljeno visokim redukcionim potencijalom kisika i relativno niskim
redukcionim potencijalima razliitih reduciranih supstrata koji trpe oksidaciju u mitohondriju.
b) U hloroplastima, kretanje elektrona kroz lanac membranski vezanih prenosilaca upravljano je
energijom fotona apsorbiranih hlorofilom.
U obje organele (mitohondrij i hloroplast) protok elektrona kreira elektrohemijski potencijal (i
pozitivni naboj) kretanjem protona kroz membranu. U oba sluaja ovaj elektrohemijski potencijal
upravlja sintezom ATP (uz membranski vezani enzim ATP-sintazu) fundamentalno slinu u
mitohondrijima i hloroplastima, kao i u bakterijama i arheama.

30
 4/4/2017

Hemiosmotski model.
Elektroni sa NADH i drugih oksidabilnih supstrata teku kroz lanac prenosioca
rasporeenih asimetrino u unutranjoj membrani. Protok elektrona povezan je sa
prenosom protona kroz membranu, pri emu se stvara hemijski (pH) i elektrini ()
gradijent (protonska-pokretaka sila). Protoni se vraaju u matriks samo kroz protonske
kanale (Fo). Protonska-pokretaka sila, koja upravlja povratkom protona u matriks,
osigurava energiju za ATP sintezu (kataliziranu F1 kompleksom povezanim sa Fo).

31
 4/4/2017

Sinteza ATP iz ADP i Pi vri se na kompleksu V (ATP-

sintaza), koji je prostorno odvojen, ali vrlo blizu redoks-
lanca. Ovaj kompleks sadri vie proteina (faktori
kopulacije Fo, F1 itd.) koji imaju razliite funkcije.

Vraanje protona u matriks vri se kroz hidrofobni

transmembranski kompleks ATP-sintaze tj. Fo
subjedinicu, koja ini protonski kanal preko kojeg H+
joni ulaze u aktivni centar ATP-sintaze (u F1 subjedinici,
koja se nalazi na povrini unutranje mitohondrijske
membrane).

Daljnje konformacijske promjene

F1 subjedinice dovode do oslobaanja
ATP-a, koji se specifinim enzimom
prebacuje u citosol.

32
 4/4/2017

Dokaz za ulogu protonskog gradijenta u sintezi ATP.

Vjetaki uspostavljeni elektrohemijski gradijent moe
upravljati sintezom ATP u odsutnosti oksidabilnog
supstrata kao elektron-donora.
a) izolirani mitohondriji prvo su inkubirani u puferu pH 9,
koji sadri 0,1 M KCl. Sporo curenje pufera i KCl unutar
mitohondrija dovodi do uspostave ravnotee matriksa sa
okolnim medijem. Oksidabilni supstrati nisu prisutni.
b) Mitohondriji se sada izdvoje iz pufera pH 9 i ubace u
pufer pH 7 sa valinomicinom (antibiotik - jonofor koji
olakava anorganskim jonima prolaz kroz membranu)
bez KCl. Razlika u konc. H+ pufera (dvije pH jedinice)
uspostavlja pH gradijent i u unutranjoj mitohondrijskoj
membrani. Iznoenje K+ (izazvano valinomicinom) niz
njegov koncentracijski gradijent bez jona suprotnog
naboja, remeti ravnoteu kroz membranu (matriks postaje
negativan). Zbir hemijskog potencijala (usljed pH
gradijenta) i elektrinog potencijala (usljed polarizacije
naboja) je protonska pokretaka sila dovoljna za
sintezu ATP u odsutnosti oksidabilnog supstrata.

Zadatak (pitanje)

33
 4/4/2017

Rjeenje (odgovor):

SLOBODNA OKSIDACIJA

Osim oksidativne fosforilacije na nivou respiratornog lanca, u

eliji se odvijaju i drugi procesi oksidacije pri kojima se
hem. energija oslobaa u vidu toplote - slobodna
oksidacija.

Pored znaaja u termoregulaciji ima i metaboliki znaaj pri

biosintezi steroida, kao i u razliitim procesima
detoksikacije tvari.

34
 4/4/2017

Metaboliki znaaj procesa slobodne oksidacije

Poseban tip slobodne oksidacije u eliji kataliziraju enzimi

oksigenaze koje aktiviraju molekularni kisik i
omoguavaju ukljuivanje jednog (monooksigenaze) ili
dva (dioksigenaze) atoma kisika u molekul supstrata.

Za oksigenaze je potrebno i prisustvo dodatnog kosupstrata,

tj. donora elektrona, a najei su NADPH,
tetrahidrofolat i vitamin C.

Primjer za reakciju monooksigenaze:

Primjer za reakciju dioksigenaze:

35
 4/4/2017

Najbrojnije i najkompleksnije monooksigenazne reakcije

su one sa hem-proteinom nazvanim citohrom P-450.
Ovi enzimi sadre citohrom P-450 domenu koja kao i
hem domena citohrom-oksidaze takoer reagira sa O2, a
vee i CO, ali za razliku od citohrom-oksidaze, kompleks
reduciranog oblika ovih enzima sa CO jako apsorbira pri
450 nm (otuda potie naziv P-450).

Enzimi sa citohromom P-450 kataliziraju i reakcije hidroksilacije pri

kojima se organski supstrat hidroksilira u R-OH (ugrauje se jedan
atom kisika, a drugi atom kisika se reducira u vodu uz pomo NADH
ili NADPH reducirajuih ekvivalenata, iji elektroni u vidu hidridnih
aniona prelaze na Fe-S protein citohrom P-450 reduktaze).
Monooksigenaze se zbog toga ponekad zovu i oksidaze mjeovite
funkcije (jer vre i oksigenaznu - ugraivanje samo jednog atoma iz
O2 u supstrat i oksidaznu funkciju - drugi atom kisika se reducira u
vodu.
Pojednostavljena shema djelovanja citohroma P-450 prikazana je nie:

36
 4/4/2017

Obzirom da se u oksidaciji ovog tipa vri i hidroksilacija

supstrata, monooksigenazni sistem se zove i hidroksilazni
sistem, a reakcija oksidativna hidroksilacija.

Ovaj hidroksilazni sistem smjeten je u membrani

endoplazmatskog retikuluma elija razliitih organa i tkiva,
a naroitu aktivnost pokazuje u mikrozomalnoj frakciji
jetre.

Hidroksilazni sistem jetre aktivno sudjeluje u metabolizmu

mnogih tvari endogenog i egzogenog porijekla kao npr.:

aerobna faza biosinteze holesterola od lanosterola,

oksidacija holesterola (prevoenje u primarne une kiseline),

transformacija steroidnih hormona (hidroksilacijom se prevode

u hidrofilnije spojeve i tako lake eliminiraju),

aktivacija vitamina D3 i

razne biotransformacije lijekova i ksenobiotika, te

kancerogenih tvari.

37
 4/4/2017

Aktivnou monooksigenaznog sistema mogu nastati i

vrlo reaktivni elektrofilni meuprodukti. Uglavnom su to
dva tipa reaktivnih meuprodukata:

1. Produkti nepotpune redukcije O2 (reaktivne vrste kisika,

ROS);
2. Reaktivni metaboliti oksidiranih supstrata tipa epoksida, N-
oksida, S-oksida, aldehida, radikali supstrata itd.

Formiranje slobodnih radikala u

mitohondriju i mitohondrijske
zatite.
Kada elektroni uu u respiratorni lanac i
ako se njihov protok du lanca poremeti,
pojaava se nastanak superoksidnog
radikal-aniona (O2-) u kompleksima I i III
poto djelimino reducirani ubikinon-
radikal (Q-) donira elektron na O2.
Superoksid djeluje na akonitazu (kao
4Fe-4S protein) oslobaajui Fe2+. U
prisustvu Fe2+, Fentonova reakcija vodi
nastanku visokoreaktivnog hidroksilnog
radikala (OH). Reakcije prikazane
plavom bojom tite eliju od tetnih
efekata O2-. Reducirani glutation (GSH)
donira elektrone za redukciju H2O2 i
oksidiranih cisteinskih ostataka (-S-S-)
enzima i drugih proteina, a GSH se
regenerira iz oksidiranog oblika (GSSG)
redukcijom sa glutation-reduktazom uz
NADPH.

38
 4/4/2017

Oksigenaze se razlikuju od oksidaza!

Oksidaza je enzim koji katalizira reakciju

oksidoredukcije, sa naglaenim prisustvom molekulskog
kisika (O2) kao elektron-akceptora.
U reakcijama koje ukljuuju doniranje atoma H, kisik se reducira u vodu
(npr. kod citohrom-oksidaze) ili vodik-peroksid (npr. kod acil-CoA-
oksidaze).

Neke reakcije oksidacije npr. koje ukljuuju monoamino-oksidaze

(MAO) ili ksantin-oksidaze (XO) ne ukljuuju O2.

Hemiosmotsko uvezivanje omoguava necjelobrojnu

stehiometriju izmeu potronje O2 i sinteze ATP

Prije opeg prihvatanja hemiosmotskog modela

oksidativne fosforilacije, polo se od pretpostavke da bi
ukupna reakcija mogla biti:

xADP + xPi + O2 + H+ + xATP + H2O + NAD+

sa uvijek cjelobrojnom vrijednou x ponekad nazvanom

P/O omjer ili P/2e- omjer.

39
 4/4/2017

Kada se intaktni (nativni) mitohondriji suspendiraju u otopini

sa oksidabilnim supstratom kao to je sukcinat ili NADH i
ako je osiguran dotok O2, sinteza ATP je lahko mjerljiva,
kako se smanjuje konc. (parcijalni tlak) O2.

U principu, ova dva mjerenja trebala bi dati broj

sintetiziranih molekula ATP po utroenom O2 tj. P/O
omjer .

Meutim, mjerenje P/O je komplicirano zbog injenice da

intaktni mitohondriji troe ATP u mnogim nepovezanim
reakcijama u matriksu, a troe i O2 u druge svrhe.
Doprinos ovih interferirajuih reakcija treba se paljivo
izmjeriti, a izraunati P/O mora se korigovati (za te
doprinose).

Veina eksperimenata daje P/O (ATP prema O2) omjere

u intervalu 2-3 kada je NADH elektron-donor, te u
intervalu 1-2 kada je sukcinat elektron-donor.

40
 4/4/2017

Uzimajui u obzir pretpostavku da P/O treba biti cijeli broj,

veina eksperimentatora se slae da P/O omjeri trebaju
biti 3 za NADH i 2 za sukcinat, te su se ove vrijednosti
pojavljivale godinama u istraivakim radovima i
knjigama.

Sa uvoenjem hemiosmotske hipoteze o povezanoj sintezi

ATP sa prenosom elektrona, nestao je teoretski uslov da
P/O treba biti cijeli broj.

Od tada su se postavljala pitanja:

Koliko H+ se ispumpava izvan matriksa pri prenosu

elektrona sa jedne molekule NADH na O2?

Koliko H+ mora protei unutar matriksa kroz FoF1

kompleks da bi nastala jedna molekula ATP?

Mjerenje toka protona tehniki je komplicirano; istraiva

mora uzeti u obzir puferski kapacitet mitohondrija,
neproduktivno curenje H+ kroz unutranju membranu i
upotrebu H+ gradijenta za druge funkcije osim sinteze
ATP (kao to je upravljanje prenosom supstrata kroz
unutranju mitohondrijsku membranu).

41
 4/4/2017

Usaglaene eksperimentalne vrijednosti za broj protona

ispumpanih po paru elektrona je 10 za NADH i 6 za sukcinat
(koji alje elektrone u respiratorni lanac na nivou koenzima Q).
Najire prihvaena eksperimentalna vrijednost za broj H+
potrebnih za upravljanje sintezom jedne molekule ATP je 4 (od
kojih se jedan H+ koristi za prenos Pi, ATP i ADP kroz
mitohondrijsku membranu).

Ako se 10 H+ ispumpava izvan matriksa po jednoj molekuli

NADH, a 4 H+ moraju dotei da bi nastala jedna molekula
ATP, o protonima ovisni P/O omjer je 2,5 (10/4) za NADH kao
elektron-donor i 1,5 (6/4) za sukcinat.

Protonska pokretaka sila snabdijeva energijom

aktivni transport

Iako je primarna uloga protonskog gradijenta u

mitohondrijima da osigura energiju za sintezu ATP,
protonska pokretaka sila takoer upravlja sa nekoliko
transportnih procesa vanih za oksidativnu fosforilaciju.
Unutranja mitohondrijska membrana openito je
nepropusna za nabijene vrste, ali dva specifina
(transportna) sistema prenose ADP i Pi u matriks, a ATP
izvan citosola:

42
 4/4/2017

Translokaze za adenin-nukleotide i fosfate

Sintasom: trokomponentni sistem
sastavljen od dvije translokaze (adenin
nukleotid-translokaza i fosfat-
translokaza) i ATP-sintaze.
(adenin-nukleotidne i fosfatne translokaze).
Transportni sistemi unutranje mitohondrijske
membrane prenose ADP i Pi u matriks, a
novosintetizirani ATP u citosol. Adenin
nukleotid-translokaza je suprotni prenosilac
engl. antiporter (obavlja transport dvije
razliite tvari kroz membranu u suprotnim
smjerovima), tj. protein koji unosi ADP u
matriks, a ATP iznosi izvan matriksa. Efekat
zamjene ATP4- sa ATP3- u matriksu je odliv
ukupno jednog negativnog naboja koji se
favorizira razlikom naboja kroz unutranju
membranu (koja je sa vanjske strane
pozitivna). Pri pH 7, Pi je prisutan u obje vrste
HPO42- i H2PO4- ; fosfatna translokaza je
specifina za H2PO4-. Ne postoji ukupni protok
naboja tokom istosmjernog prenosa H2PO4- i
H+(simport), ali relativno niska koncentracija
protona u matriksu favorizira dotok H+. Dakle,
protonska pokretaka sila je odgovorna za
osiguravanje energije za sintezu ATP: za
prenos supstrata (ADP i Pi) u matriks i
iznoenje produkta (ATP) izvan matriksa. Svaki
od ova tri transportna sistema moe se izolirati
kao jednostavni membranski vezani kompleks
(ATP-sintasom).

Energetski bilans oksidativne fosforilacije

U oksidativnoj fosforilaciji prelaz dva elektrona sa NADH na

O2 upravlja nastankom 2,5 ATP, a prelaz dva elektrona sa
FADH2 na O2 upravlja nastankom 1,5 ATP. To omoguava
izraunavanje ukupnog prinosa ATP tokom potpune
oksidacije glukoze.

Kada se dvije molekule piruvata oksidiraju do 6CO2 (preko

piruvat-dehidrogenaznog kompleksa i citratnog ciklusa), a
elektroni se prenesu na O2 (preko oksidativne fosforilacije),
nastanu 30-32 molekule ATP po jednoj molekuli glukoze:

43
 4/4/2017

Stehiometrija redukcije koenzima i nastanka ATP u aerobnoj oksidaciji

glukoze preko glikolize, reakcije piruvat-dehidrogenaznog kompleksa,
citratnog ciklusa i oksidativne fosforilacije.

* Izraunato kao 2,5 ATP / NADH i 1,5 ATP / FADH2. Negativna vrijednost oznaava potronju ATP.
Broj je 3 ili 5, ovisno o mehanizmu prenosa NADH ekvivalenata iz citosola u mitoh. matriks.

44
4/4/2017

45
 4/4/2017

Protonski gradijent upravlja oslobaanjem ATP sa

enzimske povrine

Iako ATP-sintaza uravnoteuje ATP sa ADP + Pi, u

odsutnosti H+ gradijenta novosintetizirani ATP ne napusta
povrinu enzima. Za kontinuiranu sintezu ATP, enzim
zauzima konformacije izmeu one koja vee ATP vrlo
jako i one koja ga otpusta, to je dokazano hemijskim i
kristalografskim istraivanjima (npr. atomskom
forsirajuom mikroskopijom, difrakcijom x-zraka itd.).

Defektivna oksidativna fosforilacija u -

elijama pankreasa blokira sekreciju
inzulina.
Pri normalnim uslovima (prikazano na slici),
kada nivo glukoze u krvi raste, produkcija ATP
u -elijama takoer raste. ATP blokirajui K+
kanale, depolarizira plazma membranu i tako
otvara naponski-ovisne Ca2+ kanale. Nastali
dotok Ca2+ inicira egzocitozu sekretornih
vezikula sa inzulinom, oslobaajui inzulin.
Kada je oksidativna fosforilacija u -elijama
pankreasa defektivna, [ATP] nije dovoljna za
iniciranje ovog procesa, a inzulin se ne
izluuje.

46