REVISAO CALIBRAGAO: UMA REVISKO PARA QUIMICOS ANAL{TICOS Maria Fernanda Pimentel Fundacdo Instituto Teenolégico do Estado de Pernambuco - ITEP - Av. Prof. Lufs Freire, 700 - Cidade Universitétia ~ 50740-540 Recife - PE Benicio de Barros Neto Departamento de Quimica Fundamental - UFPE - Av. Prof. Luis Freire, s/o - Cidade Universitiria - $0670.901 Recife -PE Recebido em 28/6195; aceito em 28/9/95 CALIBRATION: A REVIEW FOR ANALYTICAL CHEMISTS. This paper presents a ration procedure that are of practical iscussion of least squares fitting, expressions are given for calculating calibration parameters and their confidence intervals, and for estimating the concentr: plete revision of several aspects of the lytical chemists. After ly com terest to ana jon of an unkown, The crucial question of model validation and interpretation is addressed, and then a numerical example, based on real spectrophotometrie data, is solved in detail. Finally, practical ‘on experimental design is given for three different analytical problems. Keywords: calibration; linear regression; experimental design. 1. INTRODUGKO ‘A concentragio de uma amostra no é uma grandeza fisica observivel. Num processo analftico qualquer a concentragso sempre € oblida de forma indireta, a partic de medidas de ou- tras grandezas como absorgo ou emissio de luz, condutivida- de, e até mesmo pesos ou volumes, como nos métodes da qui- rica analftica eldssica. Ito significa que para chegar ao valor dda concentragio, cuja determinagio € o objetivo final da ans- lise, © quimico analitico precisa antes encontrar uma Fungo ‘que relacione as medidas efetivamente realizadas com a con- ‘centragio procurada. Em outras palavras, em qualquer anélise Ennecessério fazer uma calibragao, (© processo de calibragdo normalmente consiste em duas ‘tapas. Na primeira, a etapa deseritiva, medidas feitas numa série de padeBes analticos de concentragées conhecidas si usadas para construir um modelo que relacione grandeza medida com a concentragio da espécie de interesse. Na segun- dda etapa, conhecida como preditiva, usa-se esse modelo para rever concentragbes de novas amostras, a partir dos sinais analiticos medidos para elas ‘A calibragio evidentemente é uma parte fundamental do processo analftico, Ela afeta a aplicabilidade, a exatiddo, a precisio, a duragio © 0 custo global de uma andlise. Existe lima vasta literatura tratando dos varios aspectos desse impor tante procedimento!, mas sua assimilagio pelos profissionais dda quimica em geral & bastante limitada © objetivo deste artigo de revisio & reunir num s6 texto, para divulgagdo na comunidade quimica, os procedimentos mi temiticos e estatisticos indispensiveis a uma abordagem corre ta do proceso de calibrag30. Essa informagio, embora possa ser encontrada na literatura, acha-se dispersa em vérias publi- cages, muitas das quais num jargio pouco familiar a0s quimi- 05. Aqui procurou-se reduzir esse jargio © empregar exem- plos retirados da guimica analitica. Os aspectos mais impor- {antes da calibragdo sto discutidos, tanto do ponto de vista te6rico quanto do ponte de vista prético, © procedimentos de rolina para obter curvas precisas © bem ajustadas slo sugeri dos. Por raz6es diditicas apenas modelos univasiados sfo con- siderados, mas a extensio para modelos multivariados no presenta dificuldade, 2. CONSTRUCAO DA CURVA DE CALIBRACAO, Quando se deseja construir uma curva de calibragio costu- rma-se fazer a suposigio, aids perfeitamente razodvel, de que & curva deve passar “o mais perto possivel” dos pontos experi- rmentais. © modo mais empregado de obter corretamente essa maxima proximidade € 0 método dos minimos quadrados, (que fornece resultados nio tendenciosos e com varidncia mini- ta, dentro de certas suposigdes de natureza estatistica'™" ‘Uma relagio linear entre uma varidvel aleatéria y © uma varidvel nlo aleatéria x 6 deserita pelo modelo ye ot Brve w onde fe Br S20 0s pardmetros do modelo ¢ & € 0 erro aleaté- rio associado & determinagio de y. Na qutmica anaiftica, y nor- ‘malmente € 0 sinal ow a fesposta dada por algum instrumento © x € 2 concentracio da espécie quimiea que se quer determi- nar. Para cada sinal y; observado num padrio analitico de con- centragio x, 0 modelo linear fornece uma estimativa (y), dada pela equagio (veh = bo + bax @ ‘onde by by so as estimativas dos pardmetros fy f, obtidas na etapa descritiva da calibraglo. As diferengas entre 0s valo- fes observados ¢ 0s valores estimados sio 08 residues ei box @ No método dos minimos quadrados 0s valores de by © by so estimados minimizando-se a soma quadrtica dos resfduos, dada por SO, = E(ed* © somatsrio deve ser feito sobre todos os valores exper mentais, ou seja, de i= / alé i=", onde n & o mimero total de medidas. Os fndices foram omitides do simbolo do somatério para simplificar a notagao. Para minimizar a soma quadetica residual deriva-se a Eq. (4) em relagio a by © by © iguala-se as derivadas a zet0. Isto Ely Oh = E+ bob) ‘Quimica Nova, 19(3) (1096)leva, depois de alguns rearranjos, As seguintes express0es para © edleulo de by e by by = (Ly bE) n 6 bh = (WE yx BE C MY GP-EH PT o 0 tratamento estatstico dos resultados obtidos com o método dos minimos quadrados exige que sejam validas (pelo menos aproximadamente) algumas suposigées sobre a natureza dos et- 10s associados as medidas. Na presenga de violagdes grossciras Gessas suposigbes, amostras diferentes extrafdas do mesmo sis- tema podem levar a equagves bastante diferentes, isto é, 2 mo- : Cr igure 4, Regressiv inversa As links curvas si as hipérbotes que definem os intervalos de confianca em torno da rea de regrestan. O Inervale de confanca para a concentracdo estimada a partir de um Sinal observade yp vai de (Xa) 4 Gly 270 para uma média de q determinagdes feitas na mesma amostra, ho intervalo aproximado 5 (o£ fs / byl Ug) + (Ute) + Meh = 29? 28; SIP? (15) Esta expressio € valida quando 0 coefciente angular by 6 cstatisticamente significative bem determinado, que & a sit ago em que normalmente se usa a regressio inversal™™" ‘Todos os parimetros que afetam a largura dos intervalos de confianga para a méaia de q novas observagoes de y [Ea (13) também influenciam estes intervalos de confiangs, E preciso salientar, porém, que a presenga de um s6 desvio padrlo s nesta expresso baseia-se'na suposigfo de que os errs slats fios na amosta de conceatragdo desconhecida sio os mesmos crros aasociados aos padres usados para tragar a curva, de ealibragdo. Por isso, caso se deseje cmpregar a Eq. (15), é importante gue os padroes e as amosiras sejam preparados e analisados da mesma maneira, de forma que todas as possveis fontes de erto envolvidas na determinagio das amostras este- jam presenes também na preparagao e na andlise dos padtSes durante calibragio deseriiva 6. VALIDAGAO DO MODELO 6 faz sentido calcular as estimativas e seus intervalos de confianga se 0 modelo empregado estiver correto, isto é, se ele se mostrar capaz de descrever satistatoriamente 9 comporta- ‘mento dos valores experimentais. A validade do modelo e a significdneia estatistica da curva ajustada podem ser testadas por meio da Andlise da Varidineia, cujos elementos estio reu- nidos no quadro I. As expressbes mostradas nesse quadro se aplicam ao ajuste, por minimos quadrados, de um modelo ge- ral com p pardmetros". A Gnica restrigdo é que o modelo deve ser linear nos parametros, isto 6 os pardmetros s6 podem figu- rar na equagio do modelo como coeficientes de wm polinémio. No quadro T est sendo admitida a possibilidade de que haja determinagdes repetidas do sinal analitico num mesmo nivel da concentragio. Cada resposta individual é portanto identificada com dois indices: 4, que indica o nivel da concentragio, e jy que distingue as repetigdes feitas em cada nivel. © ponto de partida da anélise da variincia & a decompo: slo da soma quadritica dos desvios de todas as observa em relagdo 2 média, SQ,, em duas parcelas, SQrex & SQ: $0, = Sng + 5Q- a6) 0 termo SO, nada mais & que a soma quadritica dos resfduos eixados pelo modelo, como se pode constatar comparando-se a Quadro J. Tubela de anise da varidncia para o ajuste de um modelo pelo método dos minimos quadrados. nj = nimero de repetigbes no nivel fm = nimero de niveis distintos da vari vel x; n = Em = nGmero total de medidas: p = auimero de parimetros do modelo, O fndice 7 indica o nivel da varisvel x; 6 indice j refere-se Bs medidas repetidas da varidvel y em um dado nivel de x. O segundo somatério das expressbes para SQ, 5Qey © $0, vai de j =/ até j = ny. Os outros somatérios vio de F=T ME T= m. Jy & a média de todos os valores de ¥; Yig € 8 média das determinagbes repetidas no nivel i Fone Soma Quadrdica __G. L, Média Quadrica Modelo Sq = Bal Qui Val” PT MOng = Sue Ap-T) Residual $Q,= EZ (yy - (hl? mp MO, = SO, Amp) Falta de SQjyj = Dr lye) Ajuste Brro Puro SQnp YimP? mp MO = SO Amp) EE 00 yal? EE Oy Ya SQrp Hmm) Toa SQ, uinica NoVA, 1918) (1996)Eg. (4) com a expressio dada no quadro 1. O termo SQrp & ealvlado a partir dos valores estimados pelo modelo, e repre- Senta parcela da variagao das abservagdes em torno da media lobal que o modelo consegue reproduzir.O ndice reg apenas feflete fato de que o ajuste por minimos quadrados também € conhecido como anslise de regressio. Tnusitivamente poder-se-ia aereditar que ume boa mancra de avaliae a qualidade do modelo seria comparar a soma ‘qadrétiea explicada pelo modelo com s soma quadrétca te dual. Quanto maior fosse 0 valor de Sys em relagd0 20 valor de SQ,, melhor seria o modelo. E um fato da matemstica, po- xém, que quanto maior 0 mero de termos de um modelo maior a variaglo que ele consegue explicar. Se apenas isso fosse importante, © melhor modelo seria auiomaticamente 0 gue tivesse a equagio mais longa. Acontece que hé um outro aspecto a ser considerado: cada termo acrescentado tira do modelo um grav de liberdade, eo nimero de graus de lberda de sempre precisa ser levado em conta nos argumentos estas ticos. Em cada c3s0 6 preciso avaliar se 0 grau de liberdade fetirado por um termo adicional 6 compensado pelo aumento ni quantidade de variagao que passou a ser explicada pelo modelo, A maneica de fazer isto ¢ comparar nfo as somas QU. dtics,e sim as médias quadréicas que so obtidas dividindo se essas somas por seus Tespectivos graus de liberdade, cujas expressbes s40 dadss na ditima coluna do quadro 1. Quanto Iior 0 valor da raz MOr/M@Q,, melhor seré 0 modelo ‘Quando hi determinagdes repetidas no mesmo valor da concentragio, nenhum modelo, por mais termos que tenha, poderd explicar toda a variaglo Jos valores em tomo da medi ‘Rrazio é que a curva do modelo nio pode passar por mus de tum valor de y em cada valor de x. NesSes casos, eno, hé uma parte da variagao total que no pode ser expicada, e que che- mnamos de soma quadeica devida a0 etro puro (SQ, no Qua dro 1). A soma qUadritica devida a0 eto puro abviamente esta contida na soma quadrtica residual Na Verdade, pode-se de- ‘monstrar que a soma quadrdica residual &a soma de SQay com 2soma qudrica devida A fata de ajuste do modelo, $0 SQ, = SOpyj + SOc an Dividindo-se esses dois novos somatérios pelos seus graus de liberdade, obtém-se duas novas médias quadriticas, MQ € ‘MQrp. So essas médias que permitem fazer uma avaliagao estafstica da qualidade do ajuste do modelo. ‘Teste da Falta de Ajuste Se 0 modelo esti bem ajustado, a meio quarétcn devida 2 alta de juste refletespenas os eros aleatris!™"™"!. Como 4 média quadrticn devidn ao ert pro também € uma estima. tiva dos errs aleatrios,nesseeaso tanto MOyy quanto MO sstaram estimando a mesma grandes, a varanea popuacional E de se esperar, portanto, que os seus valores numéricos. no sam significativamente diferentes. Ito pode ser testado Comparando-e 8 azio entre as duas médias com 0 ponto da distsbuigdo F corespendente aos mesmos nlmeros de grat 4s liberdae, no nivel de confianga escothigo. Se MQu/MOy for maior do que Fras eonlusse que hi evidencin de fata de ajuste, e le 0 modsio pode ser melhorada. A reeiproca € verdadeira: se a razSo entre as dist médias quadriies for Inferior a0 valor de Fo ajuste do modelo pode ser considera do satsfatério. Esta €'2 melhor forma de so verificar se 0 modelo € ou nfo adequado. Para tornar possivel s aplicngio Aeae teste, no emtanto, 0 planejemento experimental deve pre: vera realizagdo de repetigbesauténticas em pelo menos im dos valores da concentagéo. Caso as repetigdes mio sejam auléntcas, a média quadritics devida a0 ero puro stbestimart @ eo tes F podertindicar uma falta de ajuste que na real dade no exist. ‘aulMica Nova, 148) (1986) ‘Teste da Significincia da Regressio Na hip6tese de que B/=0, ou seja, de que nio exista relagko linear entre as varidveis y ©, tanto a média quadritica devida A regresslo quanto 2 média quadratica residual serio estimati- vas de 0°, a variincia populacional". Em outras palavras, ambas refletirio apenas o erro aleatério, Essa hipdtese pode ser avaliada, mais uma yez, por meio de um teste F. Basta comparar a raz0 MQjn/MQ, com 0 valor apropriado de Fee Um valor estatisticamente signiticativo da razto entre as médi- as (isto €, maior do que o valor tabelado para F) indicard a existéncia de uma retagdo linear entre as duas varisveis, Quan- to maior for a razio entre MOn/MQ, € 0 valor de F, mais significativa serd a relagdo, Alguns autores recomendam que ‘MOrcg deve set pelo menos cinco vezes maior que MQ, , para que a regressio tenha utilidade pritica"®. Anilise dos resfduos ‘Tao importante quanto fazer os testes F & examinar cuida- osamente os resfduos deixados pelo modelo. Num modelo bem ajustada estes residuos devem dar a impress de ter sido pro- duzidos por uma distibuigdo normal, ou melhor, nfo devem apresentar nenhum indicio de anormalidade. A figura 2 ilustra tres possiblidades. O caso (a) mostra a situagio ideal, em que ‘© modelo esté bem ajustado: 0s residuos esto distribufdos ale- atoriamente, © nao hi nada que indique que sua varidncia no € constante. J4 na figura 2(b), embora a distcibuigso continue aleatsria, pode-se perceber claramente que 0s residuos erescem com 0 valor da concentragso, indicando a presenga de heteros- cedasticidade. Nesse caso, deve-se tomar uma das atitudes re- comendadas na Segio 2. Finalmente, em 2(c), ¢ evidente 0 aparecimento de uma estrutura nao aleatoria, de aspecto trvilineo, Os resfduos si0 menores nas extremidades da faixa de calibragio, e maiores na regilo intermedidria. Isto significa aque parte da estrutura sistemstica dos dados nao foi explicada, pelo modelo adotado. £ necessério portanto modificar o mode lo, possivelmente acrescentando-Ihe um termo quadrético, 17. COEFICIENTE DE DETERMINAGAO O cocficiemte de determina, ou coefciente de correlagso rniluipla, R, € a raado entre @ soma quadritica explicada pela regressao © @ soma quadratica total: RP = SQreg / SQ, =E nid (eh = Yn? 1 EE (Ny “Yn? as) 0 somatério SQ, representa a variagio total dos sinais a Itticos em torno de sua propria média. O termo Snr & a par~ cela dessa variagdo que © modelo consegue descrever. A razto enice eles, R?, € comumente chamada de variagao percentual explicada pelo modelo. Como a capacidade explicaiva de um modelo pode ir desde zero até no méximo SQ,,concluimos que O-< RPS 1. Quanto mais proximo de 1 estiver o valor de R’, mais o modelo consegue deserever a variagdo em y. Este coe ficiente & usado com muita frequéncia para avalia 0 ajuste de uum modelo, mas a sua interpretagdo requer uma eerta cautela. ‘Um erro comum € interpretar a raiz quadrada do coeficiente de determinagio (com 0 sinal apropriado) como sendo 0 coefi- ciente de correlagio entre x e y, isto & 1 (sy) = (sinal de by)(R?)! as) Na verdade isto $6 & vilido para o ajuste de uma rea, 0 ue R realmente representa, em qualquer circunstincia, € 0 Coeficiente de correlagio entre as valores observados e 05 va lores estimados pelo modelo: Rerey) 20) Outro erro comum é usar 0 valor numérico de R?, ou de suare a8 alto, mas significa apenas que 98% da variagio total em toro da média foi explicada pelo modelo. E possivel que os 2% restantes estejam concentrados numa tnica porcio da curva, ¢ isso indicara falta de ajuste. O modo correto de fazer a avai agi usaro teste F para a falta de ajuste, como jase enfatizou £ comum ainda, dado um valor de préximo de 1, con clui-se erroneamente que 0 intervalo de confianga para esti- mativas da concentragao seré esteito, Na verdade 0 valor de R no fornece informacao direta sobre a incerteza na concentra- 0" Como se pode observar na Eq. (15). a incerteza na est Inativa da coneentragio é influenciads nfo s6 pela qualidade do ajuste e pela extensio dos erros aleatérios (3), mas também pelo ndmero de determinagbes repetidas na amostea (q) pelo ‘nimero de padrdes usados na calibragio (n ¢ consequentemen- te #)e pelo planejamento experimental, isto é, pela escotha das coneentragoes dos padrées 8, UM EXEMPLO NUMERICO Para ilustrar os edlculos envolvidos nas diversas etapas da calibraglo sera apresentado nesta seglo um exemplo numérico, tirado de uma experiéncia realizada pelos autores'’. O exem plo baseia-se numa determinagio espectrofotométrica de ferro fem fguas naturais por absorcio molecular, usando-se ortfe- rantrolina como agente compiexante'™", A curva de ealibragio deve relacionar a resposta do instrumento, neste caso a absor- ‘vancia(variével dependente, ), com a concentragio de ferro na amosia (varivelindependente, x). O objetivo € trabalhar ape- nas na faixa linear, mas nio se sabe previamente até onde vai tessa faixa Ito significa que serd necessério testa se i falta de ajuste para © modelo linear na faixa de trabalho. Ao invés de aadmitir@ priori a Lei de Beer, que corresponde 8 equagio y Bix + €¢ € representada pela conhecida “Teta passando pela origem”, € preferivel adotar 0 modelo linear geral, y = tix + & Obtigar a curva de calibraglo a passar pela origem € uma restrigio desnecesséria, que equivale a supor que 0 ponto (x=0, y=0) € exato e tem variincia 2er0, 0 que difcilmente ocorteria ha pritiea. O emprego do modelo geral permite avaliar a sg ficdncia estatistica do termo Bs, & partir da qual pode-se entio decidir se ele deve ou nio ser mantido na equagdo. Para construir a curva de calibragio foram preparados oito padrbes, com concentragdes de fons ferro distribuidas em cin- Co niveis diferentes, como mostra a tabela I. A absorvincia desses padrBes foi lida em um expectrofotdmeiro Micronal B- 242, com cubetas de 4 em. No nivel de coneentragao 0,2mg/L foram feitas quatro determinagées (repetigdes auténticas) para se objer uma estimativa do erro puro Para ajustar uma rcta a estes dados usa-se as equagbes (5) « (6), obtendo-se as seguintes estimativas para os pardmettos, Bue By bn = 0.011 by = 0,693 Antes de se pensar em utilizar estes valores para fazer pre- visbes, é preciso verticar se © modelo linear esti bem ajustado Tabela I. Resultados de uma determinagio de ferro por absor- io molecular na regio do UV-VIS, usando ortofenantrolina como agente complexante"” | ast : a a Figura 2. Grifen dos residuos em jungdo da concentra. (a) Res ‘duos distribuidosaleatoriamente.(b) Residues distribuidos aleatora ‘mente mas de variincia crescent. (c) Residues nip aleatirlos. pre Fentando estratur sisteatea. ‘aiz quadrada R, para avaliar um modelo e coneluis, caso esse valor sejasuficientemente alto, que 0 ajuste & satisfatério!™!™" Um valor de 0,99 para R (isto &, R* = 0,98) é obviamente muito ae Concentragio dos PadrOes em m@/L (=) _Absorvancia Q) 02 01351 02 asia 02 on344 02 0.1457 10 07169 13 10846 20 14si6 25 16849 ‘Quiicn NOVA, 1918) (1996)08 dados coletados. Isto é feito através de uma anélise da varincia, substituindo-se os dados apropriados nas expresses do quadro 1. Os resultados assim obtidas encontram-se na tabela I Tabela IT. Andlise da variéneia para o ajuste do modelo j+Brcte aos dados da Tabela I Fonte Soma Quadritica G. L. Média Quadrit Modelo MQreg = 2,90629 Residual 6 MQ, = 0,00120 Falta de Ajuste SQ 3 MOyy = 0,00233 Erro Puro SQap 3 MOyp =0,00007 Total SQ= 291351 7 Como se dispde de uma estimativa do erro puro (gragas as determinagdes repetidas), hé condigbes de se verificar se no hf falta de ajuste, comparando-se a média quadritiea de falta de ajuste com a média quadrética devida ao erro puro. O valor dda razi0 MO/MOry 6 32,26; 0 valor da distribuigio F com 0 mesmo niimero de graus de liberdade ( e 3) € 9,28, no nivel de 95% de confianga. Como o valor de MQj/iQgy & bem maior que o valor de F tabelado, existe uma forte indicagao de que o modelo linear apresenta falta de ajuste. (© motive pode ser percebido na figura 3, que mostra 0 gre fico dos residuos contra 0s valores da concentraydo. Embora 0 rnimero de pontos seja pequeno, percebe-se claramente um padrio curvo, semethante ao caso (¢) da figura 2. Os residuos Incialmente Sio negativos, depois passam a set positivos na faixa central, e voltam a ficar negativos no final. Tal compor- tamento, como se viu, & tépico de um modelo inadequado, coin Figura 3. Grifiew dex residuae em fungto ds concentra, para a juste do modelo Bix +6 aoe dador da Tabela O coeficiente de determinagio para este ajuste 6 calculado @ partir da Eq. (18): RF = Sng / $0, = 2.90629 1 291351 = 0.9975 ou R = 0.9987 Como a soma quadritica devida a0 ero puro nfo pode ser explicada por modefo nenhum, o valor méximo que R? poderia, assumir & Rac = (5Q1- SQp)/ SQ, 0.9999 © modelo consegue explicar portanto (0,997510,9999)x100 = 99,16% da variancia maxima explicdvel, 0 que € obviamente (2:91351-0,00022) / 291351 ‘QuiMCA Nova, 198 (1986) um valor muito alto, aparentemente satisatsrio. Uma andtise Teita em termox da raz quadrada de Re, que 6 0 tio usado coefciente de correlagdo, levaria b mesma conclusto. Apestt desss altos valores, a pequena percentagem de variaglo que © ‘modelo alo consegue explicar € causada por uma falta de ajus- te, conorme foi comprovado através do teste F. Como o modelo y=pyejxe apresenta falta de ajuste, no faz sentido, do ponio de vista esttitico,estimar 08 ertos dos parimetros, constuirintervalos de confianga ou fazer previ S608 a partir da equagio de regressio. Como alterativa seria possivel tentar ajustar outro modelo. (talvez uma pardbola), Capaz de teproduzir a curvatura exibida pelos restduos. O pro: cedimento mais comum em quitica analfiea, no enianto, & procurartrabalhar apenas na faixa linea. Assim, vaise ajustar hovamente uma rela, mas numa faixa de concentragio reduzida para 0,2 - 20 mg/L, ito 6, retrando-se dos edleuios o uhimo nivel de coneentragio da tabela 1, 2.5 mp/L, Com isto a equa 40 ajstada passa'a ser y, = - 0003 + 0,723 x. A andlise da ‘aidncia para esse novo djuste & mostrada na tabela I ‘Tabela IIL. Anélise da varidncia para o ajuste do modelo jrtByxve aos dados da Tabela I, excluindo-se 0 nivel de mpl. Fonte ‘Soma Quadritica G.L. Média Quadratica Modelo Sep THOS MOmg = 17795 Residual SQ,= 0.00024 5 MQ, = 0,00005 Falta de Ajuste SQ = 0.00002 2 MQxy = 0,00001 Ero Puro SQay 3 MQuy =0,00007 Total 50, 6 Desta vez 0 valor de MQj/MO,p € apenas 0,14, mito infe- rior ao valor de F com 2 e 3 graus de liberdade, que & 9,85, no nivel de confianga de 95%, Nio hd, com o timo nivel deixado de fora, nenhuma indicacio de fata de ajuste para o modelo linear. Ito também fica claro examinado-se o getico dos novos res{duos, mostrado na figura 4, Os valores agora parecem flutu- ar aleatoriamente, sem qualquer tendéneia perceptivel, num pa- drio semelhante a0 da figura 2(a). Neste novo auste 0 coetci- ente de determinagio, R¥, passa a ter um valor de 0,9999. ‘Agora que a falia de ajuste foi eliminada pode-se realizar 0 teste F de significncia da regressdo. O valor da razi0 MOrn/MO, € altissimo: 37289. 0 ponto da distabuigio F com Ie 5 graus de liberdade, no nivel de 95% de confianga, € apenas 6,61. Como a Figura 4. Grafen dos residuas para #ajuste do modelo y=fy aus was dlados da Tabela I. exclindorseo nivel de concentra de 2,5 melrazio calculada € muitas vezes maior que o valor de F tabelado, pode-se concluir que a regressto & altamente significativa “Tendo-se verificado que o modelo linear descreve adequada- mente a relagio entre @ absorvincia e a concentragio na faixa (0,2 - 2,0 mg/L, pode-se utilizar as equagdes (7) ¢ (8) para cal- ilar 05 erros padrdo associados as estimativas dos parimetros & ‘com eles constrir intervalos de 95% de confianga para fy © By, Como nio hi falta de ajuste, pode-se usar o valor de (MQ,)"® ‘como estimativa do erro padro das respostas. Tem-se entio s{by) = 0,038 e stb 0.0037 Com estes valores © 0 ponto da distribuigdo de Student com 5 graus de liberdade, 2,57, chega-se aos intervalos de 95% de confianga para os dois parimetros do modelo: Br = -0,003 + 0,010 By = 0,723 + 0,010 Agora existem condig@es de se utilizar a curva de calibragio para fazer previsdes, Considere-se uma amostra de concentra {elo desconhecida para a qual tenham sido medidas, em dupli- Catas auténticas, as absorvancias 0,7304 e 0,7430. Para obter ‘uma estimativa da concentragio da amostra basta substituir na Eq, (14) 0 valor médio dessis duas medidas, 0,7367: (ely = (0.7367 + 0,003) / 0,723 = 1,023 mg/L © intervato com 95% de confianga em tomo de (r-)o dado pela equasio (15), fazendo-se 4=2, }6 que (r,Jy foi caleulad a partir da média de duas observagdes, O resultado é 1,02 + 0,02 mg ‘© que significa, com 95% de confianga, que a concentragio de erro na amosiza deve estar entre 1,00'e 1,04 mg/L, 9. NOTAGAO MATRICIAL Todas as equagées apresentadas aqui podem ser reescttas em termos de algebra matricial, isto 6, empregando-se vetores & matrizes. Além de fomecer uma notagdo mais compacta e clara, ‘0 uso de matrizes tem a enorme vantagem de fazer com que as fequagbes se tomem gerais, podendo ser aplicadas a quaisquer regressbes lineares, nao importa 0 mimero de tetmos do modelo! Como a igualdade entre duas matrizes na verdade ccorresponde a virias igualdades entre seus elementos, as vérias, ‘equagbes necessdrias para fazer o ajuste e a validagio do mode~ Jo podem ser representadas por umas poucas equagGes matriciis. Nesta seglo seré adotada a convencio tipogréfica usual, representando-se vetores e mitrizes em negrite, A transposigao sera indicada por um apéstrofo (). Para o ajuste do modelo escrito pela Eq, (1), por exemplo, slo necessirios os segui les vetores e matrizes,eseritos na forma transposta para econo- rmizar espago: bryan) BY = (BoBil xe! = UT sal Xe y b= (ovbs) e= leven bart | © ponto-e-virgula na matriz X° indica mudanga de linha. Para modelos mais complicados basta ampliar as ¢imensdes ‘estas matrizes de modo a acomodar os parimetros c/ou vati= fveis adicionais, Cuidando-se destes detalhes, sempre se pode- 1 representar um modelo linear qualquer por meio da expres- so mateicial yeXfee a Os parimetros desse modelo so estimados por be axytyy ey © com estas estimativas € possivel caleular 0s valores yw espe- rados para novas amostras xy Yo= WRX) KY, @) (© intervalo de confianga em toro de uma resposta analitica yo € definido pela expressio en tl (Ug) +90" XIX) Ig V2 ea) Os intervalos de contianga das Eqs. (10), (11) e (15) pas: sam a ser dados por Bab des (xy? es) (io [os 7 ball (10g) 4x") x9 1? eo) 10. PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL Um quimico interessado em construir uma curva de calibragio sabe que precisa medir a resposta do instrumento tem um certo niimero de padres analiticos de diferentes con ‘entrag6es. O planejamento experimental, isto é, a eseolha dos niveis de concentragio para os quais a resposia sera medida, deve ser feito de modo a fornecer uma curva com precisio ‘lima ¢ ainda, caso seja necessério, permilir ao interessado verficar se 0 modelo proposto é adequado e se a varincia em y pode ser considerada constant ‘A precisio da curva de calibragio pode ser avaliada em termos dos intervalos de confianga associados as respostas. As, cestimativas dos parimetros, ou Bs estimativas das eoncentra- goes. Todos estes intervalos, definidos pelas equagoes (24). {26), dependem do planejamento experimental, através da. ms: trig (XX), Isto sugere que um planejamento experimental dima, em termos de previsio, seré aquele que de alguma for- ma minimize a matriz (X°X)", que tem dimensdes pxp, onde 7 & 0 mimero de parimettos do modelo a ser ajustado. Como nao existe uma medida nica para determinar qui pequena € uma matriz, vérias fungdes dos elementos da matriz (X°X)" foram propostas como critérig de otimizagao. resultando em diversos, tipos de planejamento". O mais usado e estudado é o plane= Jamento D-otlmizado, que usa como critério de otimizagio a minimizagio do determinante de (X°X)"! 0s planejamentos D-otimizados dependem do modelo adotado « no permitem verficar se ocorre falta de ajuste, porque o nie ro de niveis recomendado com base na minimizagio do determi nante de (X'XY!E sempre igual ao nimero de parimeteos do ‘modelo proposio®. Caso modelo escolhido seja uma reta, por exemplo,o planejamento D-otimizado teré apenas dois niveis de concentragioe estes niveis serB0 os pontos extremos da faixa de calibrago. © quadro It apresenta planejamentos D-otimizados para varios modelos polinomiais. Nesse quadro admitit-se, para Quadro Il. Plancjamentos D-otimizados para modelos polinomiais. A faixa de ealibragdo vai de -I (o nivel mais bai- xo) a +1 (0 nivel mais alto). O niimero de niveis distintos da cconcentragio é igual 20 niimero de parimeteos do modelo. Um polindmio de grau n tem n+l parimetros Gru do PLANEJAMENTOS Fragio das polind- ‘medidas em mio cada nivel T 2 2 ° HB 31 0487 s04a7 4d eee) er) 5 0,765 0,285 +0,285 +0,765 +16 ‘Quimica NoVA, 1948) (1886)simpliicar, que a faixa de calibrago vai de -I a +1, Na prtica, 20 invés de se minimizar o determinante de (X'X)"', 0 que en volveria uma etapa de inversio, parte-se da chamada ma- teiz de informagao, (X'X), e maximiza-se o seu determinante. (Os exemplos seguintes visam fomecer uma orientagio para ‘a escolha de um planejamento experimental, bascada no que 0 ineressado sabe ow quer saber sobre o sistema analitico de interesse. Como na maioria dos problemas de calibracio em 4quimica analtica a relagdo entre a resposta e a concentragio 6 Tinear (reta) ou no maximo quadritica (pardbola) vamos mais uma vez nos deter nestes casos. Caso 1. O interessado sabe, por experiéncia prévia, ue a relacio entre a concentragio e a resposta Elinear na faixa de ealibragio Este 6 um caso tipico de determinagbes de rotina, onde toda 1 metodologia jé foi devidamente testada e onde jé se acumulou conhecimento suficiente sabre o método que se deseja empre- sar ¢ sobre suas limitagdes. Por exemplo, em téenicas como ICP-AES, onde a faixa linear € bastante extensa, ndo hé risco de desvios da linearidade dentro da faixa de trabalho, uma vez que © método tenha sido adequadamente desenvolvido. Em situagbes assim, deve-se adotar o planejamento D-otimizado para o ajuste de uma reta. O nimero de padroes de calibragio 1o deve ser inferior a quatro, sendo dois repetidos em cada ‘extremo da faixa, como se mostra na figura 5(a), que correspon- dde 20 primeiro pianejamento do quadro I As repetigBes permi- tem verificar se nio ocorreram erros sistemdlicos na preparagéo dos padres, como, por exemplo, uma diluigdo inadequada da @ bess © ress © kosas © Besse Figura 5. Alguns planejamentos experimentals para o ajuste de um ‘modelo linear A Fig, S(a) mostra planejamento Denimizado, TE. re~ Dresenta a eficiéncta de cada planejamento em relugdo uo plane} ‘mento D-otimieudo solugio estoque. O primeiro nfvel de concentragio pode ser sy = 0, isto é, 2 determinagia do branco. ‘Vale a pena lembrar que as repetigges devem ser auténticas. Se iss nao ocorter, no s6 no seré possivel detectar erros Brosseiros, como também nfo havers condigdes de se obter ‘uma estimativa realista dos erros aleatérios astociados & prepa- tagdo dos padrdes, Também se deve recordar que, para um ‘QuiMICA NoVA, 1918) (1986) ‘mesmo planejamento, quanto mais repetigSes forem feitas mais, cestreitos serio os intervalos de confianca, Caso 2. O interessado sabe que a relagio entre a concentracZo e a resposta tem uma grande possibilidade de ser linear mas nao esté absolutamente certo Este também seria um caso tipico de determinagdes de rot na, porém em téenicas onde a faixa linear do instrumento nao € tio extensa, como fotometria de emissio em chama ou abso go at6mica, Nesses métodos a faixa linear pode ser alterada com o tempo, e esse possivel desvio da linearidade ocorre no ‘extremo supetior da faixa de concentragdes. Em casos assim rio convém adolar o planejamento D-otimizado, porque sio necessirios no minimo Ués niveis de concentrag30 para verifi- car se 0 modelo linear adequado, © © planejamento D. otimizado para uma reta s6 tem dois. Além disto, deve-se lem- brar que para se estimar a média quadrética devido ao erro puro, necesséria para o teste F, € preciso repetir pelo menos uma determinagao. Assim, 0 numero minimo recomendivel de padrOes também seria quatro, o que levaria, por exemplo, 20 planejamento da figura 5(b). No entanto, se este planejamento for adotado, tanto a média quadritica MQ,, quanto a média quadrética MQjy serio estimadas com apenas um grau de i berdade, 0 que € desaconselhavel, Seria melhor entdo trabalhar com pelo menos 6 padrdes, distribuidos em 4 niveis de con- centragZo, como nos planejamentos S(c) - 5(f). Na verdade, do onto de vista estatistico, quanto maior © nimero de determi- rages melhor, mas em andlises de rotina nfo automatizadas tem geral no 6 vidvel, em termos de custo e tempo, construle curvas de ealibragio com mais de 6 padrdes, a ndo ser em casos onde a precisio exigida justifigue uma andlise mais de- morada e dispendiosa Na decisio sobre os niveis de concentragto a serem adotados (além dos pontos exitemos) sobre a localizacio das repet g8es € conveniente levar em conta a eficiéncia do planejamen- to, definida por®* E = 100 (Wet(X°X) / detXX giz] an conde © numerador é o determinante da matriz. (X'X) para 0 planejamento proposto e o denominador é 0 determinante cor- fespondente no planejamento D-olimizado. A figura 5 também mostra as eficiéncias dos vérios planejamentos apresentados. Pode-se observar que dos planejamentos 5(c) a 5(f) 0 que tem maior eficiéncia € 0 planejamento S(c), 0 que significa que ele € mais parecido com o planejamento D-otimizado que os ou: tros ts. Isto nio quer dizer, porém, que ele seja obrigatoria mente 0 mais adequado, Caso ocorra falta de ajuste, que & a possibilidade discutida aqui, 0 procedimento normal ¢ eliminar © nivel mais alto da concentracio, para restringir a faixa de trabalho a regio linear, No planejamento 5(c) isto levaria & exclusio de dois valores, enquanto nos outros trés planejamen- ‘os somente um ponto seria desprezado, apesar de as eficignei- as serem menores. Com a eliminagao do titimo nivel restariam ainda 5 pontos, distibuidos em 3 niveis e portanto, sob este aspecto, os planejamentos 5(@) - S(f) seriam prefertveis, Con siderando-se agora a eficiéncia, pode-se concluir Finalmente que seria aconselhvel usar © planejamento S(e). Um racioeinio semelhante pode facilmente ser aplicado pelo usuério a cada caso especffico, de forma a levar em conta, além da eficiéncia, teérica, suas expectativas em relagio a0 comportamento da curva de calibragio, como neste exemplo. Caso 3. O usuario nao tem qualquer informagio prévia sobre a relagio entre a resposta e a concentragio na faixa de trabalho Este ¢ 0 exemplo tipico do desenvolvimento de metodologi- as analiticas. Como cada caso é um caso, nio & possivel fazer a8recomendagSes muito especificas. O que se pode dizer & que 0 planejamento deve permitir, no minimo, a realizagio do teste de falta de ajuste para os modelos linear e quadrético, com razodvel significdncia estatistica, Para que as médias quadrati- 25 MQzy € MQfj possam ser estimadas com dois graus de liberdade, por exemplo, & necessério usar pelo menos 7 pa- droes, com concentragées distribuidas em 5 niveis, como no ‘timo planejamento da figura 5: No desenvolvimento de uma metodologia analitica muitas vvezes também € necessirio, além de testar 0s modelos linear & ‘quadrético, verificar se a variéncia em y & constante a0 longo da faixa de calibragio (suposigio bésica 3). Para fazer essa verificagio € preciso se dispor de estimativas confisveis do certo padrio das observagdes, que s6 podem ser obtidas a partic de repetigdes auténticas, feitas pelo menos nos dois pontos extremos da faixa. Assim sendo, convém sumentar o mimero de medidas repetidas nos niveis de concentragso selecionados (incluindo obviamente os extremos). Recomenda-se realizar no minimo 4 repetigdes em cada extremo, 11, RESUMO DO PROCEDIMENTO GERAL DE CALIBRACAO Nesta segio desereve-se resumidamente, na ordem em que las ocorrem, as etapas que devem ser seguidas numa calibragio, considerando-se tudo 0 que foi discutido neste ar- ligo. Para que a metodologia seja a mais geral possivel, vai-se admit que haja necessidade de testar todas as hipSteses. Num ‘caso real, no entanto, o interessado pode eliminat algumas das telapas propostas, dependendo do seu conhecimento prévio do problema. A figura 6 mostra um fluxograma do procedimento eral recomendado, + AO primeiro passo & planejar a coleta dos dados, de forma que se possam retirar(odas as informagbes necessé- rias, e ainda obter uma curva de ealfbragio ajustada com 0 maximo de precisio. + B= Em seguida € preciso verificar se os dados satisfazem Figura 6, Um flexograma para o procedimento geral de calibracdo 276 a hipétese de variincia constante. Se nfo, empregar um dos procedimentos recomendados na Segio 2. + C- Ajustar um modelo tinear (inicialmente) + D-=Construi a tabela de andlise da varidncia e fazer uma andlise ertica dos resfduos. +E Se ndo houver evidéncia de falta de ajuste, © se a re- gressio for estatisticamente significativa, calcular os inter- valos de confiangs ¢ fazer a regressio inversa, Caso con- teério, voltar 4 etapa C ¢ fazer um novo ajuste restringindo a faixa de trabalho, aplicando uma transformagio ou usa do um novo model. 12, CONCLUSAO Neste artigo pretendeu-se oferecer uma contribuigo para difundie 08 conhecimentos necessirios para a realizagio corze- ta de todas as etapas de uma ealibragdo, desde o planejamento dos experimentos at6 a previsio da concentrago de uma amos- tra de interesse, e da estimativa da incerteza dessa previsto. Embora se baseiem em conccitos de estatstica que nem sem- pre sfo inclufdos na formagao basica de um quimico, os méto- dos apresentados sto de aplicagio relativamente simples. Além disto, todos os edlculos necessérios podem ser facilmente pro- gramados num microcomputador, 0 que permite @ obtensso ripida da resposta procurads, em procedimentos analiticos de fotina, Atwalmente esté na fase final de desenvolvimento, no laborat6rio dos autores, um programa de calibragao escrito em Tinguagem QBASIC que devers permitir aos usuarios obter os resultados corretos sem necessidade de grands conhecimentos de estatistica, AGRADECIMENTOS Somos gratos aos Profs. M. C. U. de Araijo e T. C. B. Saldanha pelas sugestbes. Também queremos agradecer 0 apoio financeiro recebido do CNPg, na forma de bolsas de pesquisa (BBN) c de pés-graduagdo (MFP) REFERENCIAS 1. Por exemplo: (a) Box, G. E. P.; Hunter, W. G.; Hunter, J 8.5 Statisties for experimenters, John Wiley and Sons: New York 1987. 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