INTRODUCAO A METODOS CROMATOGRAFICOS Carol H. Collins - Gilberto L. Braga - Pierina S. Bonato coordenadoresEste livro é uma introdugdo descritiva de varios métodos cromatograficos que est4o sendo usados tanto em pesquisas universitdrias quanto em andlises de rotina em laboratérios industriais. Ele retine os principios basicos da cromatografia com descrig6es de suas diferentes modalidades, seus equipamentos e aplicagGes. fos O livro preenche lacuna resultante da falta de uma obra em I{ngua portuguesa que aborde de forma didatica e completa as varias técnicas cromatograficas. Ele tanto serve como livro-texto para alunos de graduacio e de pdés-graduac4o quanto como um manual para usudrios de . cromatografia, apresentando, além dos conceitos basicos, varias teferéncias que podem compleméntar o interesse de pessoas que atuam n@ycampo cromatografico. O livro também traz uma série de experiéncias simples e relativamente faceis que podem auxiliar no ensino da técnica. Assim, esta obra, ao lado de ser uma | ~~ = pega importante para g*pesquisadores quimicos, é também'teé grande valia para pesquisadores de outras 4reas, como biologia, ciéncias farmacéuticas, engenharia de alimentos e geologia, que possuam problemas de separacao quimica e.rectorram a cromatografia coma: feffamenta auxiliar, de trabatho. ofa Se tol gy, sand te a “goat F SSeS yey tet aadFICHA CATALOGRAFiICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL DA UNICAMP Introduc4o a métodos cromatograficos / coord. Carol H. Ins Collins, Gilberto L. Braga e Pierina S. Bonato. -- 7.ed. -- 7.ed. Campinas, SP : Editora da UNICAMP, 1997. (Série Manuais) |. Cromatografia — Quimica analitica. I. Collins, Carol H. II. Braga, Gilberto L. III. Bonato, Pierina S. IV. Titulo. ISBN 85-268-0164-3 20.CDD - 543.089 Indice para Catdlogo Sistematico: 1. Cromatografia: Quimica analitica 543.089 Série Manuais Copyright © by Carol H. Collins Gilberto L. Braga Pierina S. Bonato Coordenagao Editorial Carmen Silvia P. Teixeira Produgao Editorial Sandra Vieira Alves Editoragao Nivia Maria Fernandes Revisao Adagoberto Ferreira Baptista : Diagramacao/Formatac4o/ Impressfo a laser Projeto A Comunicacées Ltda. a Arte-Final Nelson Norte Pinto Capa Vlad Camargo ’ = Editora da Unicamp Caixa Postal 6074 Cidade Universitaria - Barao Geraldo CEP 13083-970 - Campinas - SP - Brasil Tel.: (019) 239.8412 Fax: (019) 239.3157SUMARIO APRESENTACAO . 000 9 I- PRINC{PIOS BASICOS DE CROMATOGRAFIA?. , . eee eee 1 — l.Introdugdo 2... 13 2. Aspectos hist6ricos da cromalografia . 0. 13 3. As classificagdcs da cromalografia 2... 15 4. Alguns termos (6cnicOS 26 20) 5.Referéncias ...... ee 26 Il -~P CROMATOGRAFIA EM PAPEL . 2. 1 0. 29 MIntrodugdo 2. ns G1) 2. Definicdes e termos usados na cromatografiacmpapcl 2... (33) 3. Considcragées sobre a cromalografiacm papel . 6. 34 —__\4. Cromatografia em papel com fase normal ¢ com fase reversa ww 37 5. Técnica da cromalografiaem papel... 66. 38 6. Métodos de delectar as substancias separadas «2. 39 C Andlise qualitaliva .. 2... ees Les 4f) ~ 8. Andlisc quantilaliva . 000 Al) — 9.AplicagdesdaCP . 1. - ee 42 10. Referencias 0.0 ns 43 Be _, I] >CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA. |. . . ce Lecce eee eee eee 45 om L PG Q)Introdugdo ....-.-- ys: ee 47 . 2 OsadsorventCS 2.66 eee ee ee es ne 47 pO 3. Técnicas gerais 6 of) 4. Formas de desenvolvimento i... 0 54 5. Andlise quantilaliva . 6... 55 6. Cromatografia em camada delgada de alta cficiéncia (CCDAE) 0.0.6 0 ee et 55 7. Aplicagdes daCCD ooo ee 8 Referencias 6. 56IV- CROMATOGRAFIA POR ADSORCAO A eee eae ene eee nee 59 MIntrodugdo 2. ne ee 61 2Acoua oo... ccc cece e bbe teens 61 3. Os processos de adsorcfo emcoluna 1... . 0-0 ee ts 62 / 4. Preparagéo dos adsorventes 0.2.00. 0000 eee tt tts 63 C f 5. Reacgdes nacoluna...... : ne ee 64 6.Escolhadeeluentes ..........0. 000 eee ee 64 7.Enchimento dacoluna .......... 008 eee es 65 8. Aeluigdo0 2... ns 65 : 9. Cromatografiaemcolunaseca ....... 000 et 68 : | 10. Uso da cromatografia por adsorgdo . 2.1 ee 70 11.Referéncias . 2... G0) V- “@ROMATOGRAFIA PORTROCAIONICA .. 2.200000 00 ee ee 71 C1 Introdugado Ce 73 ‘ 2. O mecanismo de cromatografia por trocaiOmica .. 1. 6 74 B.A matriz 2 75 4.Os grupos trocadores 2.1... 81 5. Propriedades de trocadores i6nicos «6... 84 6. Fatores que influenciam a cromatlografia por trocaiénica 2. 2 86 7. Eluicgdo em cromatografia por trocaidnica .. 6... 88 8. Aplicagdes 2.6 90) 9. Referéncias .. 1. ce 93 VI -DCROMATOGRAFIA POR EXCLUSAO ..........00--00-0005- wee 95 (1 )Introdugao Ce a - ... 97 2. Conceitos que caracterizam a cromatografia por exclusaO «22.7. ee ee ee ee 98 3. Recheios usados em cromatografia por exclusaO .. 2... ee 103 4, Equipamento para cromatografia por exclusaO 7... ee 109 5. Pardmetros expcrimentais cm cromatografia por cxclusaO 7... ee ee 110 6. Aplicagdes de cromatografia por exclusaO «1... ee, ~ 114, 7.Referéncias ....... ek ee ee | VIE CROMATOGRAFIA POR BIOAFINIDADE .................0 06. et Ky Introdugdo «1... ; . Lee ee ey . Lk 2. Principio do método 2... ee 3. Selecdo do suporte insolivel ou matriz «1... 2... ee ee el, 4. Preparagao de fases estaciondrias scletivas ..... ee 5. Metodologia operacional .......... 2.000000... 200000000 eee ee, 6. Aplicagoes da cromatografia de afinidade ...........0.20202020.2..., 7. Referéncias ..-- ee ee, ee eee,VILL DC@ROMATOGRAFIA GASOSA HL. IntrodugdO 2. 143 2. Técnicas usadas cm cromatografia gasosa y. ee 144 3. Eficiéncig 145 4.Fascestacionaéria 0. 148 5. Equipamento para cromatografia gasosa .. 2... ee es 152 6. Andlise qualitativa .........-. Es 166 7. Andlise quantilaliva oes 168 8. Derivaghio 2. es 172 Q.Aplicagdes 2... es 174 1 Referéncias 2... 180 . y LX <> CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA «2. 2-2-2 183 — GPrincipios de cromatografia liquida de alta eficiéncia cc 185 2. As técnicasda CLAE ..........-+48:5 . De 189 3. Caractcristicas das fases méveis usadasem CLAE «wwe ee 195 4. Caracteristicas das fases estaciondrias usadasem CLAE .... 2... ee eee et ts 195 5. Caractcristicas das colunas usadasem CLAE «1.1... ee ee 207° 6. Equipamento paraCLAE .. bebe b bb bb bbb bebe nee 210 7. Aplicagoes da CLAE «6. ee es 229 8 Referéncias 2. es 238 X . APRATICAS DELABORATORIO ..... 00000000 239 (WCromatografiacm papel... 241 4. Cromatografia cm camada delgada bebe bb beeen ete eee 243 3, Cromatografia por adsorgaO 6. ss 246 4. Cromatografia por troca IOMICA we . . 248 5. Cromatografia por exclusdiO ww ee ee es 251 6. Cromatografia por bioafinidade 2... 253 7. Cromatografia gasosa . 6 eee es Re eee 254 8. Cromatografia liquida de alta cficiéncia $e 259 APENDICES ...00 0000 ttt tnt ees 265 INDICE REMISSIVO 000000 eee eee 273APRESENTACAO De modo geral, as técnicas cromatograficas sao de larga aplicagéo em quimica e bioquimica, na pesquisa ¢ na indastria. , ( Estas técnicas cromatograficas variam desde as de extrema simplicidade, que podem ser facilmente manipuladas por nao-pcritos, alé as de alla sofisticagao, usadas s6 por especialistas. Entre estes dois extremos existem muilas variagoes de maior ou menor complexidade. ) Para cada modalidade de cromatografia estado disponiveis livros especializados, bascados em artigos originais, publicados em inglés ou outra lingua cstrangeira nas revistas de cromatografia. Porém, sao raros os livros em lingua portuguesa que contém as informagoes bisicas, tcGricas ¢ praticas sobre estas técnicas de tao largo uso. Na tentativa de evitar a dependéncia de livros em lingua estrangcira, publicamos, ¢m 1987, a primeira edicio deste livro bdsico sobre técnicas cromatograficas que apresentou informagocs sobre as varias modalidades de cromatografia. O sucesso obtido nos motivou a langar esta nova edicdo, cxaustivamentec revisada e ampliada, tanto no conteddo dos capitulos jd cxistentes quanto do novo, descrevendo outra modalidade de cromatografia. Este livro continua sendo destinado ao uso, Como texto, CM Cursos a nivel de graduagao ou como livro ‘ntrodut6rio as técnicas de separacgdo cromatografica para pos-praduandos. Pode também servir como base para o pesquisador que pretende usar a cromatografia apenas como uma ferramenta em suas experiéncias, scm necessitar de uma basc tc6rica profunda. \ Conseqiientemente, este livro nao se destina a especialistas ¢ nem € um compéndio que abrange as a todos os novos desenvolvimentos no campo. Técnicas cromatograficas estao em continuo . a} e . . . desenvolvimento'e rapidamente tornam obsolcto qualquer livro desta categoria. Sendo assim, esta finalidade —_ sera melhor atingida pela consulta a livro c outras referencias citadas nas listas bibliograficas que referénci acompanham cada capitulo, bem como novos livros ainda nao publicados. A obra consiste de um capitulo descrevendo os principios basicos de cromatografia, oito capitulos que descrevem as diferentes técnicas cromatograficas ¢ um capitulo que retine sugestocs para experimentos na programagao expcrimental das disciplinas; bem como os apéndices que apresentam os simbolos recomcendados para uso cm cromatografia na lingua portugucsa c outras informagocs importantes. 9Apesar dos capitulos terem autores diferentes, cada um descrevendo a sua especialidade, houve um esforco coletivo na confeccao do texto para que Os termos e simbolos fossem uniformes. Os termos e simbolos usados sao os sugeridos em publicagoes recentes na revista Quimica Nova (vol. 11, pp. 443-464 (1988) e vol. 12, pp. 92-94 (1989)), que se baseiam, em sua maioria, nos recomendados pela Unido Internacional de Quimica Pura e Aplicada. Entretanto, leitores que procurarem as refcréncias citadas deverdo estar alertas para o fato de que os simbolos e termos aqui usados podem estar substituidos por outros, sendo que, recentemente, nao existia uniformidade nos simbolos e termos usados nas diferentes modalidades de cromatografia. As unidades das quantidades fisicas e simbolos adotados seguiram as indicacoes do Sistema Internacional de Unidades (Le Systéme International d’Unités (SI), 5* edigao, 1985). Os editores e autores desta obra consideram que nela aplicaram o melhor de seus esforcgos. No entanto, agradeceriam nao s6 sugestOes como indicacgoes para erros e/ou conccitos mal formulados. Além disto, agradecem aos que direta ou indiretamente colaboraram com seu trabalho e entusiasmo para que esta publicagdo se tornasse viavel. 10 ee eee. aCAPITULO I PRINCIPIOS BASICOS DE CROMATOGRAFIA Carol H. Collins Instituto de Quimica da Universidade Estadual de Campinas@) t INTRODUCAO | a Lo Entre os m€todos modcrnos de andlisc, a cromatografia ocupa um lugar de destaque devido a sua facilidade em efetuar a scparacao, identificacdo e quantificagdo das espécies quimicas, por si mesma ou em conjunto com outras técnicas instrumentais de andlisc, como, por exemplo, a espectrofotometria ou a espectrometria de massas. ee — © 4a cromatografia € um método fisico-quimico de scparagéo dos componentes de uma mistura, - fealizada através da distribuigéo destcs componcntes entre duas fascs, quc estao em contato intimo. Uma ) das fases permanccc estaciondria cnquanto a outra move-sc através dela. Durante,a passagem da fase movel sobre a fase estaciondria, os componentes da mistura sao distribufdos entre as duas fases, de tal forma que cada um dos componcntes € selctivamente retido pela fase estaciondria, resultando em migracoes difcrenciais destes componentes.."(# Existem varias formas dese realizar o processo cromatografico, Detalhes sobre algumas destas formas scrao assuntos dos capitulos a scguir, enquanto que neste serdo aprescntados alguns dos conccitos mais gerais. Antes disto, sera relatada uma breve revisdo hist6érica do desenvolvimento das técnicas \ cromatograficas mais importantes., x" \ NL 2. ASPECTOS IIISTORICOS DA CROMATOGRAFIA Os termos "cromatografia", "cromatograma" e "método cromatografico" s4o atribuidos ao botanico russo MIKHAEL SEMENOVICH TSWETT, quc, em 1906, utilizou estes termos em dois trabalhos descrevendo suas experiéncias na scparagao dos componentes de extratos de folhas ¢ gema de ovo, onde usou colunas de vidro recheadas com varios sdélidos, finamente divididos, ¢ arrastou Os Componentes com éter de petréleo. O nome deriva-se das palavras gregas "chrom" (cor) ¢ "graphe" (escrever), embora o processo nao dependa da cor, exccto para facilitar a identificagao dos componentes separados. ~ [Todavia, nesta época os processos, aplicando a migracao diferencial, j4 cram bem conhccidos. Paralelo aos desenvolvimentos de TSWETT, REED, na Inglaterra, e DAY, nos Estados Unidos, aplicaram colunas contendo s6lidos para a scparacao de sais orgiinicos c amostras de petrélco, respectivamente. bem antes destcs, RUNGE descreveu os "descnhos" fcitos por misturas de sais ¢ por tintas que foram colocadas no centro de um papel de fillro e¢ depois cspalhadas pcla passagem de um solvente, enquanlo 13SCHOENBEIN fez experiéncias similares com tiras de papel mergulhadas em solventes. O uso de sdlidos em camada delgada sobre vidro, no lugar de papcl, para o desenvolvimento circular de misturas de sais inorgsinicos fol experimentado por BEYERINCK em 1889. “_Apesar destas experiéncias, considerou-se que a época moderna de cromatlografia comegou na década de 30, quando KUHN c LEDERER "redescobriam" ¢ aperfcigoaram a cromatografia em coluna, repetindo as experiéncias de TSWETT, scparando c identificando as xantofilas da gema de ovo, usande uma coluna recheada com carbonato de calcio pulverizado e éter de petrdlco como fase movel. / Em 1941, MARTIN e SYNGE publicaram um trabalho no qual descreveram a cromatografia por particaa (cromatografia liquido-lfquido), aplicaram o conceito de altura cquivalente a um prato tedrico a cromatografia e anteciparam o surgimento de duas cromatografias: a gasosa € a liquida de alta eficiéncia, Por este trabalho receberam o Prémio Nobel em 1952. MARTIN também participou em outros desenvolvimentos importantes na hist6ria da cromatografia: com CONSDEN € GORDON, reintroduziu a cromatografia em papel; com HOWARD, desenvolveu a cromatografia liquida aplicando as chamadas “fases reversas"; e com JAMES, atualizou a cromatografia g4s-liquido. A cromatografia g4s-sélido foi descrita pela primeira vez. cm 194], por HESSE c col., que scpararam dois Acidos graxos, no vapor a 100°C, arrastando-os sobre silica com 0 gas, didxido de carbono, enquanto CREMER e PRIOR foram os primciros a descrevercm um cromalografo a gas completo. 7 O desenvolvimento, quase simultaneo, do detector por ionizagéo cm chama por PRETORIUS ¢ col. e por McWILLIAMS e DEWAR, ampliou a sensibilidade do método cromatografico, enquanto que a introdugao de colunas capilarcs por GOLAY ampliou os scus poderes analiticos, ao ponto de tornar a cromatlografia gasosa o método analitico de separacao c determinagdo mais usado no mundo. ‘| A cromatografia em camada delgada foi reintroduzida em 1938, por IZMAILOV & SCHRAIBE R, paraa andlise de produtos farmacéulicos, mas nao foi muito usada alé 0 desenvolvimento, por KIRCHNER e col., do método de aderir o sélido ao suporte e, por STAHL, do método de preparar as placas com reprodutibilidade. A cromatografia por troca iénica também (eve scu inicio, na €poca moderna, nos anos 30, com a sintése, por ADAMS e HOLMES, das primeiras resinas de troca idnica, bascadas em fenol ¢ formaldeido, que permitem a troca de cAtions. Posteriormente, resinas de poliacrilico ou poliestircno entrecruzado com divinilbenzeno, com substituinfes sulf6nicos, carboxilicos ou alquilaminos, substituiram as originais. ~ As resinas de poliestireno-divinilbenzeno so as mais aplicadas em bioquimica, tendo inicio com as experiéncias de COHN na separagao de aminodcidos originados de Acidos nucléicos. “A separagao de aminodcidos foi aperfeigoada por MOORE c STEIN ¢, postcriormentc, mecanizada por cles, usando uma bomba peristaltica para cmpurrar a fase mévcl c um fol6metro para a delecgao, apos uma reacgio para produzir os derivados com ninhidrina. Em 1959, este sistema para a anilise de aminodcidos foi modificado por HAMILTON e ANDREWS, con a introdugao de uma bomba lipo pistao, similar as usadas ainda hoje em cromatografia liquida de alta eficiéncia. Outros desenvolvimentos na década de 60, por KARR ¢ col., JENTOFT ¢e GOUW, HUBER e HULSMAN, SNYDER, KIRKLAND e outros, aperfcigoaram os sistemas de bombeamento e deteccao de cromatografia liquida de alta sae Peeve que 0 uso destes equipamentos, operado com fase mével liquida sob presséo e com métodos de detecgao sensiveis, possibilita andlises de rapide comparavel as de cromatografia gasosa, com resultados allamente satisfatdrios. Paralclamente, os enchimentos para a cromatografia liquida de alta eficiéncia foram sendo desénvolvidos, inicialmente os peliculares (particulas superficialmente porosas) por HALASZ ¢ por HORVATH, , 9 postcriormente as parliculas completamente porosas de didmetro pequeno (10 sem, Sem e 34m) por KIRKLAND e outros. O desenvolvimento, por NICKLESS ¢ col., de fases estacionarias 14contendo grupos alquilas quimicamente ligados ao suporte permitiu a aplicagao da chamada “fase reversa" (fase estaciondria apolar), ampliando as aplicacées desta técnica, enquanto a introdugao de colunas de diametro interno menores (as "microbores" € as "capilares recheadas") por SCOTT e por NOVOTNY viabilizaram o uso de cromatografia lfquida de alta cficiéncia para qualquer tipo dc an4lise, quer organica quer inorganica. / Outra (écnica cromatografica que deve seu crescimento ao desenvolvimento das fases estacionarias cont grupos alquilas quimicamente ligadas 6 a cromatografia usando um fluido supercritico como fase movel.JEsta técnica, que foi aplicada com sucesso por KLESPER e col., em 1962, quando se usou um cromatdgrafo a g4s modificado, recebeu varias outras alleragoes por GOUW c JENTOFT no decorrer dos anos Seguintes, Somente cm 1983 € que foi lancado o primeiro aparclho comercial dedicado a esta técnica. . “Além do fato de que varios zcolitas e amidos naturais ¢ modificados j4 tenham sido testados para a separacado de compostos neutros de tamanho grande, |foi o desenvolvimento de um gel de dextrano entrecruzado que possui propriecdades de uma pencira quase perfcita, por PORATH e FLODIN, que . iniciou a cromatografia por exclusdo para separacées de moléculas de interesse biolégico em solugoes aquosas. —— f Scparagécs por tamanho de polfmeros, requisitando o uso de solventes organicos, foram realizadas por MOORE, usando poliestirenos com grau varidvel de entrecruzamento. . CAs primciras expcriéncias cm cromatografia por bioafinidade foram [citas por LERMAN e col. em os % 1954 Bles isolaram anticorpos usando uma coluna recheada com celulose contendo os antigenos aprepriados. Aperfeigoada por ANFINSEN c col., com o uso de gels de dextrano contendo grupos espccificos quimicamente ligados, esta técnica tem grande aplicagao na scparagao ¢ purificagao de protcinas ¢ dcidos nucléicos, pois permite a imobilizagao de somente as espécics complementares aos grupos ligados, c a sua posterior cluigaéo com nova fase mével. Varias outras revisoes histéricas, mais extensas e/ou mais especificas, se encontram na leitura de cromatografia. O Icitor interessado pode consultar, dentre estas, a publicada por MORHY. —= wah. Lakes ® 3. AS CLASSIFICACOES DA CROMATOGRAFIA “oO | Sao v4rios os critérios usados para a classificagao das diferentes modalidades de cromatografia, sendo os mais comuns relacionados a técnica empregada, ao mccanismo de separagao envolvido ¢ aos diferentes lipos de fases ulilizadas. A forma fisica do sistema de cromatografia define a técnica geral: a fase estacionaria pode ser 4€ colocada em um tubo cilfndrico ou disposta sobre uma superficie planar, Baseando-se nesta, a cromatografia pode scr subdividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar..Na primeira, de acordo com o tamanho do didmetro interno do tubo, temos as colunas preparativas (6-50 mm), analiticas (2-6 mm) e com microdiamctro (<2 mm). As colunas preparativas c analiticas sempre apresentam a fase estaciondria na forma de particulas ¢ a fase aliva na forma de um sdlido ou de um liquido que tanto pode recobrir a superficie do sélido como estar quimicamente ligado a ele. As colunas com microdiametro também podem ser recheadas coma fase estacion4ria ou podem possuir a fase estacion4ria sob a forma de um filme ou de particulas aderidas nas paredes do tubo. - pers “Considerando o cstado fisico da fase movel, distingue-sc alcromatografia gasosa, onde a fase moével _ éum gis, a cromatografia liquida, onde a fase mével é um liquido, ¢ a cromatografia supercritica, onde se usa como fase mével um vapor pressurizado, cm temperatura acima de sua tempcratura critica, com as vantagens de ter viscosidade menor do liquido, mas mantcndo as propriedades de interagao com Os solutos. 15