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ISSN: 0123-3475
revcbib_bog@unal.edu.co
Universidad Nacional de Colombia
Colombia
Resumen
Las lipasas son enzimas con propiedades funcionales muy interesantes que permiten su utilizacin prctica
en diversos campos de las industrias agroqumica, farmacutica, de detergentes y alimentaria, as como en
qumica fina. Entre las aplicaciones ms importantes de estas molculas se encuentran: la resolucin de mez-
clas racmicas, la obtencin de compuestos pticamente puros y la bioconversin de principios activos. En
este trabajo se presenta una amplia revisin del tema, que abarca desde aspectos estructurales y funcionales
de las lipasas, hasta la inmovilizacin de estas enzimas mediante adsorcin interfacial y su empleo en biotec-
nologa.
Palabras clave: activacin interfacial, adsorcin interfacial, bioconversin, esterasas.
Abstract
Lipases are enzymes having very interesting functional properties thereby enabling their practical use in diffe-
rent fields related to agro-chemical, pharmaceutical and food industries, as well as in fine chemistry. The most
relevant applications for these molecules would be racemic mixture resolution, obtaining optically-pure com-
pounds and the bioconversion of active principles. This work presents a broad review of the topic, ranging
from lipases structural and functional features to these enzymes immobilisation by interfacial adsorption
and their use in biotechnology.
Key words: Bioconversion, esterases, interfacial activation, interfacial adsorption.
1 Bioqumico, profesor, Centro de Estudio de Protenas, Facultad de Biologa, Universidad de La Habana, Cuba. jogoba@fbio.
uh.cu
2 Microbilogo, Centro de Estudio de Protenas, Facultad de Biologa, Universidad de La Habana.
3 Autor de correspondencia, bioqumico, profesor e investigador, Centro de Estudio de Protenas, Facultad de Biologa, Univer-
sidad de La Habana. adelmonte@fbio.uh.cu
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Introduccin con baja actividad de agua (Segura et al., 2004;
Dandavate et al., 2009). Bajo determinadas con-
Las lipasas (glicerol-ster hidrolasas; EC
diciones, las lipasas pueden catalizar reacciones
3.1.1.3) son enzimas que catalizan la hidrlisis
qumicas distintas de la hidrlisis, como este-
de los enlaces ster presentes en los acilglicero-
rificacin, interesterificacin, alcoholisis, aci-
les in vivo. Adems, pueden catalizar la hidr-
dolisis y aminolisis (Balco et al., 1996; Pandey
lisis o sntesis de un grupo amplio de steres
et al., 1999). Estas hidrolasas se han empleado
carboxlicos (Bornscheuer et al. 1994). Estas
ampliamente como aditivos para detergentes,
enzimas estn ampliamente distribuidas en la
en las industrias alimentaria, papelera, qumica
naturaleza, y se encuentran en microorganis-
y energtica; as como para la produccin de
mos, plantas y animales (Berner y Hammond,
cosmticos, en tratamientos ambientales y en el
1970; Mukherjee, 1996; Ruiz et al., 2007). Una
diseo de biosensores (MacRae y Hammond,
caracterstica peculiar de las lipasas es que son
1995). Es notable el impacto que han tenido
enzimas solubles en agua que actan sobre sus-
las lipasas en la produccin de frmacos ms
tratos insolubles y agregados, por lo que ope-
selectivos y efectivos, con efectos secundarios
ran unidas a interfaces lpido-agua. Bajo estas
menores, y en la obtencin de pesticidas de me-
condiciones, se produce un incremento de la
actividad cataltica, respecto a las soluciones nor toxicidad, todo ello mediante la sntesis de
con concentraciones por debajo de la concen- compuestos pticamente puros y la resolucin
tracin micelar crtica, fenmeno conocido de mezclas racmicas (Kirchner et al., 1985;
como activacin interfacial (Sarda y Desnuelle, Yoshimura et al., 2002; Zarevcka y Wimmer,
1958). 2008). Es por ello que cobra vital importancia
profundizar en el conocimiento sobre las ca-
ractersticas funcionales de estas enzimas, a fin
Entre las aplicaciones ms exitosas de las
de determinar las condiciones ms ventajosas
enzimas estn aquellas que se consiguen con
de aprovechamiento de sus propiedades, para
sus formas inmovilizadas. Esto se debe a las
lograr la optimizacin de los procesos en que
ventajas que confiere la inmovilizacin, entre
son empleadas.
las que se encuentran: la posibilidad de recu-
perar la enzima del medio de reaccin, la ob- En este trabajo se presentan los resulta-
tencin de un producto no contaminado con la dos de una amplia revisin en la literatura es-
enzima, y el incremento de la estabilidad ope- pecializada sobre las lipasas. En primer lugar,
racional del biocatalizador (Guisn et al., 1996a; se ofrecen las caractersticas estructurales ms
Malcata, 1996; Kneevi et al., 2004). Uno de importantes de estas enzimas en relacin con
los protocolos de inmovilizacin ms difun- las peculiares propiedades funcionales que es-
didos para las lipasas es la adsorcin selectiva tas determinan. A continuacin se presenta la
sobre soportes hidrofbicos que reproducen inmovilizacin de lipasas como tecnologa di-
las interfaces formadas por los sustratos na- rigida a la obtencin de biocatalizadores ms
turales de estas enzimas (Malcata et al., 1992; eficientes, con nfasis en la inmovilizacin por
Fernndez-Lafuente et al., 1998). En este caso, adsorcin interfacial: uno de los procedimien-
la inmovilizacin se produce a travs de un tos de inmovilizacin ms difundidos para estas
mecanismo de adsorcin interfacial (Reis et al., protenas. Por ltimo, se resumen las principa-
2009), basado en la activacin de estas enzimas les aplicaciones biotecnolgicas de las lipasas.
en interfaces.
Las lipasas han suscitado un inters cre- Masa molecular
ciente para la industria debido a su versatili-
dad, estereoselectividad, estabilidad frente a
y punto isoelctrico
solventes orgnicos y capacidad de sintetizar La mayora de las lipasas presenta masas
compuestos orgnicos en mezclas de reaccin moleculares entre 27 y 60 kDa. Sin embargo, se
Masa molecular
Fuente Punto isoelctrico Referencia
(kDa)
ND: No determinado.
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Figura 1. Diagrama esquemtico del plegamiento /-hidrolasa, presente en el dominio cataltico cannico de
las lipasas. Flechas: cadenas . Rectngulos: hlices . Conexiones: lazos. Puntos: residuos que componen la
trada cataltica (nuclefilo, cido, histidina). N y C: extremos amino y carboxilo-terminal.
estabiliza en las interfaces lpido-agua (Gro- como zona de contacto lipdico (Okkels et al.,
chulski et al., 1994a; Guisn et al., 1996a). Las 1996). Tambin estn presentes algunas mol-
estructuras tridimensionales de algunas lipasas culas de agua que participan en interacciones
en sus conformaciones activas se han determi- importantes para mantener una conformacin
nado por cristalografa y difraccin de rayos X del sitio activo catalticamente competente
(Derewenda et al., 1994b; Kim et al., 1997; Tyn- (Triantafyllou et al., 1993).
dall et al., 2002; Ericsson et al., 2008).
Adems del centro activo principal, las li- Activacin interfacial
pasas pancreticas humana y porcina, y otras De manera general, las lipasas son en-
de origen microbiano, presentan en su regin zimas que requieren de activacin interfacial
C-terminal lo que parece ser un sitio catalti-
para desplegar al mximo su actividad cataltica
co mnimo. Este pudiera ser responsable de la
(Malcata, 1996; Ransac et al., 1996). Este fen-
actividad enzimtica frente a sustratos hidro-
meno consiste en el incremento de la actividad
solubles como los steres del p-nitrofenol (De
enzimtica en presencia de interfaces lpido-
Caro et al. 1986). Por otra parte, esta actividad
tambin pudiera explicarse por las transiciones agua (Sarda y Desnuelle, 1958; Chahinian et
conformacionales que experimentan estas en- al., 2002). Se entiende por interface a la super-
zimas, aun en ambientes homogneos, dadas ficie imaginaria que separa dos porciones del
por la interconversin estructura cerrada-es- espacio homogneas y distintas fsicamente. A
tructura abierta (Kim et al., 1997). nivel molecular, una interface consiste en un
conjunto de dos capas adyacentes de molculas
En su conformacin activa, las lipasas ordenadas con diferente carcter hidrofbico-
presentan en su centro activo un grupo de re- hidroflico (Malcata, 1996).
siduos hidrofbicos dispuestos alrededor de
la serina cataltica que constituyen una regin Cuando la enzima entra en contacto con
electroflica conocida como cavidad oxianini- una interface, el ambiente dielctrico en la su-
ca (Grochulski et al., 1994b). Adems, aparece perficie proteica se modifica, en el sentido de
una superficie significativamente apolar alrede- potenciar las interacciones electrostticas. Ello
dor de la entrada al centro activo que se conoce posibilita que la cubierta del centro activo se
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hidroltica de los cidos grasos de cadena larga (Cygler et al., 1995), y alcanzan a distinguir
presentes en los acilgliceroles (Snellman et al., entre enantimeros, frente a sustratos rac-
2002), los cuales son sus sustratos naturales, micos, o entre grupos enantiotpicos, para
muy pocas lipasas son especficas en sus reac- triacilglicridos proquirales (Bornscheuer
ciones. Por este motivo, el trmino especifici- 2002). Por ltimo, pueden establecerse cier-
dad se ha ido reemplazando en la literatura por tas combinaciones entre los tipos de selecti-
el de selectividad, el cual describe mucho mejor vidades anteriores (Jensen et al., 1994).
el comportamiento reactivo de estas hidrolasas.
En ltima instancia, la determinacin de la es-
pecificidad de una lipasa depende de la sensibi- Efecto de la concentracin
lidad del mtodo empleado para ello (Jensen y de sustrato sobre la actividad
Hamosh, 1996). enzimtica
Las lipasas pueden ser selectivas por la El efecto de la concentracin de sustrato
clase de lpido (Bornscheuer et al., 1994; Li sobre la actividad lipasa ha sido ensayado con
et al., 2009) y por la posicin (Berner y Ha- diferentes sustratos para enzimas de diversas
mmond, 1970) y el tipo de cido graso (Sne- fuentes. En la tabla 2 se presentan algunos re-
llman et al., 2002; Zouari et al., 2005). Estas sultados que se han informado para lipasas en
enzimas pueden ser adems estereoselectivas sus formas solubles.
C. rugosa Aceite de oliva 703 mmol/L 6032 mmol / (min * mg) Prazeres et al., 1996
Bacillus sp. p-nitrofenil laurato 3,63 mmol/L 0,26 mol / (min * mL) Dosanjh y Kaur, 2002
Burkholderia
p-nitrofenil palmitato 1,56 mmol/L 5,62 mol / (mg * min) Dandavate et al., 2009
multivorans V2
ND: No determinado. KM: Constante de Michaelis-Menten para el par enzima-sustrato. Vmx: Velocidad mxima de la reaccin
catalizada por la lipasa.
Temperatura
Fuente pH ptimo Referencia
ptima (C)
Calamar Todarodes pacificus (lipasa heptica) 8,0 35-40 Park et al., 2008
ND: No determinado.
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Inhibidores, inhibicin y efecto autores han informado inhibicin competitiva
de aditivos sobre la actividad causada por concentraciones elevadas de deter-
gentes (Kimura et al., 1982).
enzimtica
Las lipasas son inhibidas por los orga- La actividad lipasa puede ser afectada de
nofosfatos (Kordel y Schmid, 1991; Cavalier diferentes maneras por la presencia de iones
et al., 2000), como el dietil-p-nitrofenilfosfato metlicos en la preparacin, los que pueden
y el diisopropil-fluorofosfato (Bhardwaj et estabilizar o desestabilizar la estructura de es-
al., 2001), por las carbodiimidas en presencia tas enzimas en solucin (Tyndall et al., 2002).
de nuclefilos, como el glicin-etil ster, y por Muchas lipasas requieren del ion Ca2+ para
el iodo. Tambin son inhibidores de lipasas mantener una conformacin estable y/o ca-
los cidos bornicos y el fenil-metil-sulfonil- talticamente competente (Amada et al., 2001;
fluoruro (Dandavate et al., 2009), as como Snellman et al., 2002). Adems del efecto inhi-
los metales pesados, el EDTA (Snellman et al., bitorio ya mencionado, los cationes metlicos
tambin pueden actuar como activadores de las
2002; Dandavate et al., 2009), algunos terpenos
lipasas (Kimura et al., 1982; Snellman et al., 2002;
(Morikawa et al., 2009), los iones halgenos,
Dandavate et al., 2009). El efecto activador del
los alcaloides, el cloroformo, el n-hexanol, el
Ca2+ puede manifestarse como un incremento
dietil-fenil carbonato, el bromoformo, varias
de la Vmx y/o un decremento de la KM (Kimu-
lactonas (Colowick y Kaplan, 1955; Kordel y
ra et al., 1982). Algunos iones provocan efectos
Schmid, 1991) y algunos 1,2-etilen-di-N-alquil-
opuestos en lipasas diferentes (Wu et al., 1996;
carbamatos en presencia de detergentes (Lin et
Snellman et al., 2002). Tambin pueden influir
al., 2007). Algunos cationes metlicos pueden
sobre la actividad de estas enzimas el tampn
producir inhibicin (Wu et al., 1996; Snellman (Alston y Freedman, 2001), el solvente (Sugiura
et al., 2002; Park et al., 2008; Dandavate et al., e Isobe, 1975; Triantafyllou et al., 1993; Sharma
2009). et al., 2002; Dandavate et al., 2009) y la fuerza
inica del medio (Mead et al., 2002). El efecto
Los inhibidores de naturaleza proteica inhibitorio del EDTA se basa en su capacidad
son ms especficos por su lipasa blanco, como de quelar el Ca2+.
es el caso del aislado a partir de la harina de
trigo, que inhibi a la lipasa pancretica, pero Los detergentes o surfactantes son adi-
no fue capaz de inhibir completamente la ac- tivos de primera importancia para la actividad
tividad lipasa de Candida cylindracea y no ejer- lipoltica (Dandavate et al., 2009), puesto que
ci ningn efecto sobre otras lipasas aisladas intervienen en la formacin de micelas a par-
de micobacterias (Tani et al., 1994). Algunas tir de la dispersin de los grandes agregados
protenas hidrofbicas, como la albmina de hidrofbicos en que se organizan espontnea-
suero bovino, inhiben a las lipasas mediante su mente los sustratos naturales de estas enzimas
unin competitiva a las interfaces (Larsson y en solucin acuosa. Esto trae como consecuen-
Erlanson-Albertsson, 1983). Para varias lipasas cia un incremento notable del rea superficial
se han informado los fenmenos de inhibicin disponible para la interaccin enzima-sustrato,
por exceso de sustrato, frente a triolena (Bie- con el consiguiente efecto sobre la velocidad de
siot y Capuzzo, 1990; Prazeres et al., 1996), e la reaccin (Egmond, 1996). Estas sustancias
inhibicin por producto, causado por los ci- pueden adems formar micelas invertidas en
dos grasos (Larsson y Erlanson-Albertsson, solventes orgnicos con un contenido de agua
1983). Los detergentes (Tsai et al., 1996; Broc- moderado, lo que puede traducirse en una ma-
kman, 2000) y las emulsiones de varios solven- yor actividad y estabilizacin de las molculas
tes orgnicos (Sugiura e Isobe, 1975) pueden enzimticas ubicadas en su interior (Shome et
actuar como inhibidores de las lipasas. Algunos al., 2007). Los detergentes tambin pueden in-
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cuyos espectros de absorcin cambian con la Inmovilizacin
variacin del pH. Estos mtodos son poco
especficos y pueden detectar cualquier enzi- Las ventajas derivadas de la inmoviliza-
ma que acidifique el medio (Lobo de Arajo y cin de enzimas tambin son aplicables a las
Radvanyi, 1987). Tambin es posible medir di- lipasas. Debido a la hidrofobicidad marcada
rectamente la disminucin en el pH, pero esta que presentan los sustratos naturales de estas
variante es muy poco sensible y los cambios de enzimas, las mezclas de reaccin en las que
pH pueden quedar enmascarados por la accin ellas operan deben contener un solvente org-
del tampn (Tan y Tan, 1988). nico o un agente emulsificante apropiados, que
traen consigo la ruptura de la homogeneidad
La cuantificacin de los cidos grasos del medio. Bajo estas condiciones, es deseable
liberados durante el transcurso de la reaccin que la lipasa constituya una fase independiente
se ha abordado utilizando mtodos colorim- dentro del sistema de reaccin, a fin de pre-
tricos que apelan a reactivos cromognicos venir la contaminacin de los productos con
cuyas absorbancias varan al interactuar con cierto nivel de actividad enzimtica residual.
estas molculas. Para garantizar una seal Esta aspiracin tecnolgica puede alcanzarse
de fondo lo ms baja posible, los triacilgli- con la inmovilizacin, la que adems extiende
cridos empleados como sustratos no de- el tiempo de vida til del reactor (Balco et al.,
ben contener cantidades elevadas de cidos 1996; Kneevi et al., 2004). Se ha desarrollado
grasos libres acompaantes. Tambin se han una variedad amplia de protocolos de inmovili-
desarrollado ensayos fluorimtricos (Knotz zacin para las lipasas (tabla 4).
et al., 2006), basados en la interaccin entre
los cidos grasos liberados y determinados
fluorforos. Estos mtodos son muy sensi- Inmovilizacin por adsorcin
bles y costosos. La cromatografa en placa interfacial
fina permite cuantificar los cidos grasos li- Uno de los protocolos de inmoviliza-
berados mediante tcnicas densitomtricas o cin ms difundidos para las lipasas es la ad-
autorradiogrficas. Este mtodo es disconti-
sorcin selectiva sobre soportes con cierto
nuo y consume mucho tiempo. La separacin
grado de hidrofobicidad (Fernndez-Lafuen-
entre el sustrato y los productos radiactivos
te et al., 1998). Segn la propuesta de Bastida
tambin puede realizarse mediante HPLC,
et al. (1998), los soportes hidrofbicos mime-
centrifugacin o extraccin con solventes.
tizan las interfaces formadas por los sustra-
El ensayo radioisotpico es muy especfico y
tos naturales de las lipasas, por lo que estas
sensible, y su lmite de deteccin es del orden
enzimas se adsorben fuertemente sobre ellos
de los picomoles. Su inconveniente principal
en una forma abierta e hiperactivada, involu-
radica en el empleo de triacilglicridos sin-
crando la zona de contacto lipdico (Okkels et
tticos marcados radiactivamente (Beisson et
al., 1996). Esta interaccin no es un efecto de
al., 2000).
asociaciones hidrofbicas, ya que se produce
Esta variedad de ensayos enzimticos pro- a fuerzas inicas bajas (Bastida et al., 1998;
porciona amplias posibilidades al investigador Fernndez-Lafuente et al., 1998; Sabuquillo
en este campo, pero al mismo tiempo dificulta et al., 1998; Snellman et al., 2002) y las lipasas
la comparacin entre los resultados obtenidos son protenas muy hidroflicas (Fernndez-
en distintos laboratorios mediante el empleo Lafuente et al., 1998). Por tanto, este es un
de mtodos diferentes. Esto se debe a que las mecanismo de adsorcin interfacial, basado
condiciones del ensayo influyen sobre la veloci- en la activacin interfacial y propio solo de
dad de la reaccin catalizada enzimticamente protenas con actividad superficial como las
(Chvez et al., 1990). lipasas.
Entre las bondades que presenta el mtodo poder cataltico. La aplicacin industrial de la
de inmovilizacin por adsorcin interfacial pue- tecnologa enzimtica es particularmente inte-
den citarse la sencillez de la tcnica, la ausencia de resante en procesos que requieren condiciones
reactivos caros y txicos, la capacidad para retener de reaccin suaves, en trminos de pH, tempe-
o incrementar la actividad especfica (Malcata et ratura y presin, debido a la labilidad de la mez-
al., 1992; Palomo et al., 2004; Cunha et al., 2009), cla. Estas molculas se requieren en cantidades
la potenciacin de la estereoselectividad de la li- pequeas, pueden distinguir entre grupos fun-
pasa (Bastida et al., 1998; Fernndez-Lafuente et cionales de reactividad similar y son capaces de
al., 1998), y la posibilidad de recuperar el soporte, modificar un sustrato dado dentro de una mez-
debido a la reversibilidad parcial de las interaccio- cla compleja, llegando a discriminar incluso
nes (Balco et al., 1996). entre dos ismeros pticos en el caso de com-
puestos quirales. En la literatura especializada
Entre los soportes ms utilizados para puede encontrarse abundante documentacin
estos fines se encuentran aquellos basados en sobre el empleo de enzimas en la obtencin de
la activacin de la agarosa con grupos hidro- principios activos (Klibanov, 1990).
fbicos como butilo, fenilo y octilo (Bastida
et al., 1998; Sabuquillo et al., 1998; Fernndez- Las lipasas son enzimas con una aplica-
Lafuente et al., 1998; Cunha et al., 2009). La cin amplia en diferentes procesos industriales,
fortaleza de la adsorcin de las lipasas sobre particularmente en sus formas inmovilizadas.
octyl-agarosa es de tal magnitud, que se requie- Ellas se emplean en la produccin de detergen-
ren altas concentraciones de detergente, urea o tes y de saborizantes naturales (Pandey et al.,
guanidina para romper las interacciones (Fer- 1999), en la hidrlisis de aceites y grasas (Ta-
nndez-Lafuente et al., 1998). ylor, 1996), en la produccin de papel (Jaeger y
Reetz, 1998) y en la elaboracin de cosmticos
(Benjamin y Pandey, 1998). Debido a su capa-
Aplicaciones biotecnolgicas cidad de catalizar la sntesis de determinados
Las enzimas son catalizadores biolgi- compuestos en medios orgnicos con activi-
cos extraordinariamente especficos y de gran dad de agua controlada (Dandavate et al., 2009;
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Gupta y Khare, 2009), las lipasas se han em- Profundizar en las bondades y limitaciones de
pleado en la produccin de intermediarios para estas enzimas como biocatalizadores, contribu-
la sntesis orgnica (Vaidya, 1996), as como de ye a la optimizacin de los procesos biotecno-
penicilinas (Savidge, 1984). lgicos en los que ellas participan y, por tanto,
a una mejor aplicacin de las lipasas para la ob-
Las lipasas han sido utilizadas extensiva- tencin de bioproductos de utilidad humana.
mente en la obtencin de compuestos ptica-
mente puros (Yoshimura et al., 2002) y en la
resolucin de mezclas racmicas (Kirchner et Referencias bibliogrficas
al., 1985; Felluga et al., 2009), aprovechando sus Alam, M., Vance, D. E., Lehner, R. 2002. Structure-function
propiedades estereoespecficas (Bornscheuer, analysis of human triacylglycerol hydrolase by site-di-
2002; Segura et al., 2004). Esta aplicacin tie- rected mutagenesis: identification of the catalytic triad
ne un impacto considerable en la produccin and a glycosylation site. Biochem 41 (21): 6679-87.
de frmacos ms selectivos y efectivos, con Aloulou, A., Puccinelli, D., De Caro, A. M., Leblond, Y.,
efectos secundarios menores, y en la obten- Carrire, F. 2007. A comparative study on two fungal
cin de pesticidas con menor incidencia en el lipases from Thermomyces lanuginosus and Yarrowia
medio ambiente (Zarevcka y Wimmer, 2008). lipolytica shows the combined effects of detergents
and pH on lipase adsorption and activity. Biochim
Esto se debe a que la actividad funcional de los Biophys Acta 1771 (12): 1446-56.
compuestos quirales es debida generalmente a
uno de los enantimeros, mientras que el otro Aloulou, A., Rodrguez, J. A., Fernndez, S., van Ooster-
es inocuo o perjudicial, y puede reducir la ac- hout, D., Puccinelli, D., Carrire, F. 2006. Exploring
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terales indeseadas, o simplemente aportar una 995-1013.
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Conclusiones
Amada, K., Kwon, H. J., Haruki, M., Morikawa, M., Kana-
Las lipasas son enzimas extraordinaria-
ya, S. 2001. Ca2+-induced folding of a family I.3 lipase
mente verstiles que han recibido considerable with repetitive Ca2+ binding motifs at the C-terminus.
atencin en biotecnologa desde hace ms de FEBS Lett 509 (1): 17-21.
tres dcadas. Esto se debe a las peculiares pro-
Ariens, E. J. 1984. Stereochemistry, a basis for sophisticated
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nonsense in pharmacokinetics and clinical pharmaco-
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La activacin en interfaces, una especificidad
de sustrato amplia y una selectividad basada Balco, V. M., Paiva, A. L., Malcata, F. X. 1996. Bioreactors
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con baja actividad de agua, son algunos de los
step purification, immobilization and hyperactiva-
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