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Cruzando reinos: Uso de plantas descelularizado como andamios de ingeniera de tejidos

perfusable

Joshua R. Gershlak un , Sarah Hernandez segundo , Gianluca Fontana do , Luke R. Perreault un ,

Katrina J. Hansen un , Sara A. Larson segundo , Bernard YK Binder re , David M. Dolivo segundo ,
Tianhong Yang mi , F , Tanja Dominko segundo , gramo , Marsha W. Rolle un , Pamela J. Weathers segundo ,
Fabricio Medina-Bolvar mi , F , Carole L. Cramer mi , F , William L. Murphy do , marido , yo ,
Glenn R. Gaudette un , *
un Ingeniera Biomdica, Instituto Politcnico de Worcester, Worcester, MA, Estados Unidos
segundo Biologa y Biotecnologa, Instituto Politcnico de Worcester, Worcester, MA, Estados Unidos
do Ortopedia y Rehabilitacin, Universidad de Wisconsin Escuela de Medicina y Salud Pblica, Madison, WI, Estados Unidos
re Departamento de Ciruga, Universidad de Wisconsin Escuela de Medicina y Salud Pblica, Madison, WI, Estados Unidos
mi Departamento de Ciencias Biolgicas, Universidad del Estado de Arkansas, Jonesboro, AR, Estados Unidos
F Instituto de Biociencias de Arkansas, la Universidad Estatal de Arkansas, Jonesboro, AR, Estados Unidos

gramo Centro de Ciencias Biomdicas e Ingeniera de la Universidad de Nova Gorica, Eslovenia

marido Ingeniera Biomdica de la Universidad de Wisconsin-Madison, Madison, WI, Estados Unidos
yo Ciencias de los Materiales e Ingeniera de la Universidad de Wisconsin-Madison, Madison, WI, Estados Unidos

informacin del artculo abstracto

Articulo de historia: A pesar de significacin fi avances de consideracin en la fabricacin de andamios bioingeniera para ingeniera de tejidos, la entrega de los nutrientes en los
Recibido el 4 de octubre de el ao 2016
tejidos humanos de ingeniera complejos sigue siendo un desafo. Al tomar ventaja de las similitudes en la estructura vascular de tejidos vegetales y
recibi en revisado el Formulario 8 de
animales, desarrollamos tejido de la planta descelularizado como andamiaje prevascularizados para aplicaciones de ingeniera de tejidos. descelularizacin a
febrero de 2017
base de perfusin fue modificado fi ed para diferentes especies de plantas, proporcionando diferentes geometras de andamios. Despus de la
Aceptado 9 de febrero de 2017 Disponible en Internet el
descelularizacin, andamios de plantas permanecieron patente y capaz de transportar micropartculas. andamios de las plantas se recelularizado con clulas
10 de febrero de 2017
endoteliales humanas que colonizaron las superficies interiores de la vasculatura de la planta. clulas madre mesenquimatosas humanas y los
cardiomiocitos derivados de clulas madre pluripotentes humanas adheridas a las superficies exteriores de los andamios de plantas. Los cardiomiocitos
palabras clave:
demostraron capacidades de la funcin contrctil y manipulacin de calcio en el transcurso de 21 das. Estos datos demuestran el potencial de las plantas
La medicina regenerativa
ingeniera de tejidos descelularizado como andamios para la ingeniera de tejidos, lo que finalmente podra proporcionar un coste-ef fi ciente, verde La tecnologa para la

descelularizacin Perfusable regeneracin de la masa de tejido vascularizado gran volumen.

Plantas de andamio

2017 los autores. Publicado por Elsevier Ltd Este es un artculo de acceso abierto bajo la licencia CC BY-NC-ND
licencia ( http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ ).

1. Introduccin
La necesidad de rganos y tejidos disponibles para el trasplante es muy superior a su
disponibilidad. Ms de 100.000 pacientes se pueden encontrar en la lista de espera de donantes en
un momento dado y un promedio de 22 personas mueren cada da a la espera de un donante de
rganos o tejidos que estn disponibles [1] . La ingeniera de tejidos ha hecho signi fi cativos avances
en la ltima dcada a travs del desarrollo de injertos de tejido, lo que aumenta el nmero potencial
de las soluciones viables para estos
pacientes. Sin embargo, todava hay cuestiones que impiden su traduccin en la clnica. Uno de los
principales factores que actualmente limitan la aplicabilidad clnica de soluciones de ingeniera tisular
es la falta de una red vascular funcional [2] . Sin una red vascular viable, el 100 mi 200 metro lmite de
difusin m oxgeno dentro de los tejidos no se puede superar, en consecuencia, la restriccin del
tamao de injerto que se pueden disear y retener viabilidad. La mayora de las tcnicas de
bioingeniera actuales no son capaces de crear vasos de perfusin de patentes. Tcnicas tales como
la carga de los andamios con factores pro-angiognicos

[3] , Formacin de la red vascular celular guiada [4] y diseos microfabricados [5] han demostrado un
xito limitado en la recapitulacin totalmente vasculatura nativa. Adems, microvasculatura

* Autor correspondiente.
Direccin de correo electrnico: gaudette@wpi.edu (GR Gaudette).

http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2017.02.011
0142-9612 / 2017 los autores. Publicado por Elsevier Ltd Este es un artculo de acceso abierto bajo la licencia CC BY-NC-ND licencia ( http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ ).
14 JR Gershlak et al. / Biomateriales 125 (2017) 13 mi 22
(<10 metro m de dimetro) no puede ser fabricado funcionalmente con tcnicas Biofabrication
actuales, tales como impresin 3-D.
En lugar de tratar de disear una red vascular, el enfoque actual se ha desplazado hacia los
enfoques inspirados en la biologa, ms impulsado por el advenimiento de las tcnicas basadas en
perfusin para descelularizacin
[6] . La descelularizacin elimina el material celular a partir de un tejido u rgano dejando atrs un
andamio acelular consistente de la matriz extracelular (ECM), la composicin de la que depende el
tejido u rgano fromwhich se deriv [7] , Preservando al mismo tiempo una red vascular intacta [8] . Al
eliminar el material celular del tejido de un donante, un injerto descelularizado se volvera no
inmunognico mientras que conserva la estructura del rgano bruto [9] . tejidos y rganos
descelularizado se pueden entonces recelularizado con las propias clulas de un paciente para crear
un injerto autlogo [8] . composicin bioqumica nativo y la estructura del tejido jerrquica de un injerto
descelularizado potencial se derivan del donante del tejido u rgano. Esto lleva inherentemente a la
inconsistencia entre tejidos u rganos derivados de diferentes pacientes, o descelularizarse utilizando
diferentes mtodos, debido a variables de confusin tales como edad, del organismo o patologa del
tejido, y la especificidad fi cs del protocolo descelularizacin [7,10,11] . En particular, la protena de
anlisis de la composicin a travs de espectrometra de masas ha demostrado diferencias drsticas
en la composicin de los tejidos descelularizados entre diferentes pacientes [12,13] . tejidos de
mamferos descelularizado tambin son escasos y, incluso cuando estn disponibles, son caros. Por
otra parte, una cantidad considerable de investigacin adicional debe llevarse a cabo antes de
rganos descelularizados enteras pueden ser considerados como una opcin prctica clnica [14] . En
consecuencia, una fuente de tejido ms consistente, rentable y fcilmente disponible para la
descelularizacin producira mejores perspectivas mediante el aumento de los nmeros de viables de
los injertos en un signi fi cativamente menor costo.
La mayora de los enfoques actuales de bioingeniera estn limitadas por el aislamiento fsico e
intelectual de la investigacin bsica en diferentes organismos a sus respectivos reinos biolgicos.
Este desafo crtico puede ser superada mediante la explotacin a travs del reino contribuciones
dentro de la misma plataforma de bioingeniera. Las plantas y los animales explotan
fundamentalmente diferentes enfoques para el transporte de Florida UIDs, productos qumicos, y
macromolculas, sin embargo, hay sorprendentes similitudes en sus estructuras de red vasculares ( Figura en etanol al 95%). Las secciones se lavaron en dos cambios de etanol al 100% (2 min / paso) y
1 ). vasculatura planta sigue la ley de Murray [15] , Que es la ley fisiolgica que describe el cnica, la
ramificacin diseo de la red del sistema cardiovascular humano [diecisis] . Estructuras dentro de
tejidos vegetales [17] , Como los tejidos humanos [18] , Exposicin vari propiedades mecnicas, lo
que permite diversas funciones. paredes celulares de plantas se componen de una variedad de
polisacridos, la ms destacada de las cuales son de celulosa, pectina, y la hemicelulosa [19] . La
celulosa, que es el componente ms abundante de las paredes celulares de la planta,
es un bien estudiado
biomaterial para una variedad de aplicaciones clnicas [20] . La celulosa es biocompatible y se ha
demostrado para promover la curacin de heridas
[21] . Adems, los andamios de ingeniera de tejidos celulsicos derivados de rodajas de manzana
descelularizados han demostrado la capacidad para la unin de clulas de mamfero y la
proliferacin [22] y se encontr que ser biocompatible cuando se implanta subcutneamente en vivo [ 23]
. Pectina [24] y hemicelulosa [25] Tambin se han estudiado como biomateriales para ingeniera de
tejido seo y la curacin de heridas, respectivamente. Las similitudes evidentes innatas y
biocompatibilidad de ECM planta nos impulsaron a buscar a travs de los reinos e investigan si las
plantas y sus vasculatures innatas podran servir como andamios perfusable para la ingeniera de
tejidos humanos. tcnicas de descelularizacin se aplicaron a diferentes especies y tejidos de plantas
con el fin de generar acelulares, andamios de ingeniera de tejidos pre-vascularizados. La
abundancia y el rpido crecimiento de muchas especies vegetales proporciona tambin un material
de soporte menos costoso, ms abundante y sostenible.
2. Materiales y mtodos
La descelularizacin planta: Espinacas y perejil fueron adquiridos froma mercado local. Artemisia
annua hojas (SAMcultivar, el espcimen MASS bono 00317314) se cosecharon a partir de plantas
del suelo cultivado. Man races peludas se generaron a travs rhizogenes- Agrobacterium transformacin
gentica mediada [26,27] . La descelularizacin para los diferentes tipos de plantas fue adaptado a
partir de tcnicas de perfusin descelularizacin conjunto de rganos [6 mi 8] . hojas de espinacas
fueron canuladas por el pecolo y tallos de perejil fueron canuladas por el extremo basipetal del
segmento de vstago. Las cutculas se retiraron de las plantas a travs del tratamiento en serie con
hexanos (98%, ismeros mezclados, Alfa Aesar, Haverhill, MA) y 1x PBS. Un 10% de dodecil sulfato
de sodio (SDS) en solucin de agua desionizada se perfundi a travs de las cnulas durante 5 das,
despus de lo cual fueron perfundidos con un 0,1% de Triton-X-100 en un blanqueador de clorito de
sodio al 10% (Aqua-Tab, Beckart Ambiental , Kenosha, WI) en una solucin de agua desionizada
durante 48 h. agua desionizada estril se thenperfused para un adicional de 48 h. Perfusionwas
realizadas desde un cabezal de presin constante de 152 mmHg y Florida ow fue iniciado por la
gravedad. A. annua y man races peludas se descelularizado utilizando la misma tcnica pero en
lugar de canulacin y la perfusin, que se empaparon en las soluciones. Despus de
decellularizationwas completos, los tejidos se almacenaron en agua desionizada estril a 4 C hasta
que se necesite para un mximo de dos semanas.
Anlisis histolgico: Las muestras de hojas se cortaron en ~ cuadrados de 1 cm,
preferentemente de corte con el canal vascular principal de la hoja por la mitad de la plaza. Las
races y tallos se cortaron en trozos de longitud aproximadamente ~ 1 cm. Las muestras de tejido
fueron fi fijos durante la noche en un procesador automtico de tejidos ATP-1 (tringulo Ciencias
Biomdicas, Carolina del Norte) y luego embebido en parafina fi norte. parafina fi n bloques se
seccionaron a 14 metro metro. Las muestras que fueron
teidas utilizando safranina de Sass y el protocolo Fast Green para la tincin de plantas se realizaron
como se inform anteriormente [28] . En resumen, las secciones se tieron durante 1 h en acuosa al
1% (w / v) safranina-O, y luego se enjuagaron en agua desionizada durante aproximadamente 5 min,
o hasta que todo colorante residual se elimin de las secciones. Las secciones se deshidrataron en
70%, a continuacin, 95% de etanol y se sumergieron durante 10 s en Fast Green FCF (0,1% w / v
borran en dos cambios de xileno (2 min / paso). Las muestras se tieron para la lignina durante 10
min en una solucin saturada de phloroglucionol en clorhidrato de 20%, como se inform
anteriormente [29] . Las muestras se visualizaron mediante el uso de un microscopio vertical DMLB2
(Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL).
Microscopio electrnico de barrido de imagen: La preparacin de muestras para microscopa
electrnica de anlisis de barrido (SEM) consisti fi fijacin con 1,5% de glutaraldehdo en recin
preparada tampn cacodilato 0,07 M de sodio durante 2 h. Las muestras se enjuagaron a
continuacin en
cacodilato 0,07 M de sodio con la adicin de 2,5% de sacarosa y deshidratado por inmersin en una
serie graduada de etanol en H 2 O, en serie en las siguientes concentraciones: 30, 50, 80, y 95%.
Entonces las muestras se sumergieron en hexametildisilazano (HDMS) en soluciones de serie de
etanol en las siguientes concentraciones: 30, 50, 80, y 95%. Las muestras se dejaron secar en el
soporte de muestra y despus oro recubrieron por deposicin antes de la imagen en SEM.
ADN / protena Quanti fi catin: Ambas hojas nativas y descelularizado se pusieron en tubos de
centrfuga en un bao de nitrgeno lquido y se moli con una mano de mortero. Los fragmentos se
procesan adicionalmente tirando a travs de una aguja de jeringa de calibre 25 y por sonicationwith 5
pulsos realiz 3 veces para reducir la hoja de tamao del fragmento. a continuacin, el ADN se midi
usando un telfono directo Ensayo de proliferacin de CyQUANT (Thermo Fisher, Waltham, MA) y
proteinwas medida usando un Coomassie (Bradford) Kit de ensayo de protenas (Thermo Fisher).
Las concentraciones se determinaron usando un espectrofotmetro Victor3 (Perkin Elmer, Waltham,
MA).
Los estudios de perfusin: hojas de espinaca descelularizado se eliminaron
 JR Gershlak et al. / Biomateriales 125 (2017) 13 mi 22
Fig. 1. Comparacin de los animales y vascular planta patrn de red de ramificacin y estructuras. Un corazn de rata se descelularizarse, como se describi previamente [6] Y se perfundi con una mancha roja de Ponceau para visualizar la
vasculatura. UN Buddleja davidii la hoja se perfundi con Florida uorescena marcado PEGDA de visualizar la vasculatura hoja.
de almacenamiento refrigerado y se secaron con Kimwipes antes del comienzo de los diferentes
estudios de perfusin. Un 0,1% Ponceau Red (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO) en solucin de cido
actico al 1% se sometieron a perfusin a travs de la cnula unida al pecolo de cada hoja de
espinaca descelularizado. Rojo Ponceau se perfundi a partir de una presin constante de 152
mmHg a travs por gravedad Florida Ay. Las imgenes fueron tomadas antes y despus de la
canulacin para investigar la permeabilidad restante de la vasculatura hoja descelularizado.
Las microesferas (1, 10, 50, y 100 metro m de tamao) (Phosphorex Inc., Hopkinton, MA) se
utiliza para determinar el dimetro interior Florida limitaciones flujo de la vasculatura de la hoja. La
perfusin se logra a travs de una jeringa de bomba con una Florida velocidad de flujo de 200 metro l
/ min. Antes de la perfusin de microesferas, en blanco Florida uidwas perfundido a travs de la hoja
con el fin de medir cualquier automvil Florida fluorescencia del lquido de perfusin. A la perfusin en
serie de diferente singular Florida tamaos de microesferas fluorescentes se realiz empezando con la
ms pequea hasta dimetros ms grandes. Despus que se complet la perfusin, se recogi el
escurrimiento de cada microesfera de tamao individual y se analiz usando un lector de microplacas
Victor3 (Perkin Elmer) frente a una curva estndar conocido para cada microesfera de tamao
individual. Hubo cierta Florida la prdida de fluido experimentado en la recogida de las escorrentas de
la perfusin. Esta Florida prdida uid se puede atribuir a las estructuras porosas de las hojas que
causan pequeos volmenes de lquido para recoger en la hoja. Para los vdeos de alta velocidad,
una cmara HiSpec4 de alta velocidad (FastTec, San Diego, CA) se une a un microscopio DMIL
invertido (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL) y vdeos de alta velocidad fueron tomadas a 60
cuadros por segundo. Una mezcla de las diferentes microesferas se perfundi durante los videos.
microesferas Florida debido travs de la vasculatura eran falsas de color blanco para aumentar el
contraste entre la esfera y el fondo. Confocal imgenes de hojas de verificacin fi ed atrapamiento de
microesferas. Las imgenes fueron adquiridas mediante un SP5 punto de exploracin confocal (Leica
Microsystems).
Pruebas Mecnicas: hojas de espinaca nativas y descelularizado se cortaron en un 1 2 cm de la
forma de hueso de perro. Las hojas se cargan en las garras de la probador mecnico con el extremo
apical de la hoja siendo vertical. Un tester ElectroPulse E1000 (Instron Corp., Norwood, MA) se utiliz
para estirar uniaxialmente las hojas. Las hojas se estiran a una tensin constante de 10 mm de fallo /
mmuntil. mdulo tangente mximo, resistencia a la traccin, y la tensin en el fallo se calcularon.
mdulo tangente mximo fue establecido por
15
fi tting una lnea a la mxima pendiente regin lineal de la grfica de tensin-deformacin. resistencia
a la traccin y deformacin en la rotura se calcularon a partir de los grficos de tensin-deformacin
generados.
Cultivo de clulas de mamferos y de siembra: Para nicos experimentos de fijacin HUVEC y
hPSCM, andamio tallos de las hojas se recubrieron con
fi bronectin. La fibronectina (a partir de plasma bovino, Sigma Aldrich) se inyect a travs de la cnula
de los andamios de hojas a una concentracin de 10 metro g / ml y se dej que la capa durante 24 h
en un incubador estndar. Antes de HUVEC de la siembra, las hojas fueron inyectados con PBS
estril para eliminar cualquier no recubierto fi bronectin de la hoja. Para la siembra HPS-CM, fi bronectin
se aplic a la superficie de la hoja al mismo tiempo la concentracin y la incubacin. Antes de la
siembra HPS-CM, hojas se lavaron en PBS estril.
HUVEC (CRL-1730, la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia) se
mantuvieron usando un kit de crecimiento de clulas endoteliales mi VEGF (ATCC) segn las
instrucciones del fabricante. HUVEC fueron Florida uorescently marcado a travs de la captacin de
acetilado lipoprotena de baja densidad (Dil-Ac-LDL) (Thermo Fisher). Etiquetado se produjo por
HUVECs de incubar durante 4 h a inmedium 37 C que contiene 10 metro l / ml Dil-Ac-LDL. A 500 metro
l alcuota que contenga
375000 marcada HUVECs se inyect en el vstago canulado de una hoja de espinaca
descelularizado. HUVECs se permiti 24 h para la adherencia y despus se lavaron a continuacin
con PBS. HUVECs adherentes se visualizaron utilizando una rodamina fi filtro en una SP5 punto de
exploracin confocal (Leica Microsystems).
La viabilidad de HUVEC despus de recellularizationwas determin usando un ensayo de
captacin de LDL. HUVECs no marcados se inyectan en el vstago canulado como se describi
anteriormente; 24 h despus de la siembra, HUVEC sembr tallos y no sembrado tallos se
trasladaron a un medio que contiene 10 metro l / ml Dil-Ac-LDL durante 4 horas a 37 C. Imgenes de
tallos fueron adquiridas antes de la incubacin LDL, 24 h despus del final de la incubacin, y 48 h
despus del final de la incubacin usando un Rodamina
fi filtro en un microscopio DMIL invertido (Leica Microsystems).
P4 mi P8 hMSCs (Lonza, Walkersville, Maryland) se mantuvieron en medio de crecimiento
MSCGM (Lonza) hasta que alcanzaron 70 mi 80% con Florida uencia. Los hMSCs se trataron durante
24 hwithMSCGMmedium suplementado con 8,2 nM Qdot 655 ITK carboxilo Quantum Dots (Thermo
Fisher). Despus del tratamiento de 24 h, los hMSCs dot-cargado cuntica se lavaron suavemente
con PBS y se mantuvieron en uso mediumuntil crecimiento. hMSCs cargados se sembraron en la
superficie de la
diecisis JR Gershlak et al. / Biomateriales 125 (2017) 13 mi 22
espinacas descelularizado deja durante 24 h para permitir la unin. hMSCs adherentes se
visualizaron utilizando QDOT 655 fi ltro ajustes en el SP5 punto confocal de barrido.
cardiomiocitos derivados de clulas madre embrionarias (HPS-CM) (proporcionados por el Dr.
Michael LaFlamme, Universidad de Toronto, Toronto, Ontario) [30] se mantuvieron en medio RPMI
que contena 2% B27, 1% Pen / Strep y 1% L- Glutamina (Thermo Fisher). Los HPS-CMs se
descongelaron y se sembraron inmediatamente sobre la superficie de las hojas de espinaca. Las
clulas se les dio 24 h de la siembra antes de que se sustituye medio, y posteriormente fueron
reemplazados cada 48 h durante la duracin de 21 das.
HPS-CM contraccin y Anlisis fluorescente: Una cmara de alta velocidad HiSpec4 (FastTec,
San Diego, CA) se une a un microscopio invertido DMIL (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL) y
vdeos de clusters contratantes HPS-CM fueron tomadas a 60 cuadros por segundo. Un algoritmo de
seguimiento basado en speckle, la cartografa de alta densidad
[31] , Se aplic a la contraccin de los vdeos. El nivel de desplazamiento algorithmmeasures subpixel
de un objeto de intensidad de la luz al azar. A partir de estos desplazamientos subpxeles, la tensin
de contraccin se puede calcular a travs de una regin de inters. vdeos fluorescentes se
registraron a 71 fotogramas por segundo y se analizaron a travs de un cdigo de MATLAB a
medida, que mide el cambio relativo en intensidad con el tiempo.
Estadstico Anlisis: Todas resultados se presentan como
media desviacin estndar. Las comparaciones estadsticas se realizan a travs de la utilizacin de
la prueba t de Student o ANOVA de una va con la prueba post-hoc de Tukey. Tanto las pruebas
estadsticas se realizaron dentro de SigmaPlot (Systat Software Inc, San Jose, CA). signi estadstica fi cance
se determin que era p < 0.05.
3. resultados
3.1. Preparacin y caracterizacin de los andamios de plantas descelularizados
La estructura natural de las plantas ms altas permite el transporte de nutrientes a travs de
xilema y floema a las clulas distales, por ejemplo, de las races a las hojas y las hojas a las races u
otras hojas. Para explorar el potencial de un tejido diseado andamio, descelularizacin perfusin
basada en plantas [6] fue adaptado para uso con Spinacia oleracea ( hojas de espinaca. Hojas de la
espinaca se utilizaron como una especie modelo debido a su fcil disponibilidad, su patrn de red
vascular y la densidad, y su peciolo dimetro ancho. pecolos de las hojas de espinacas fueron
canuladas ( Fig. S1 ) Y luego perfundidos con solucin de descelularizacin (10% de dodecilsulfato
sdico (SDS) en agua desionizada) durante 5 das, seguido de 2 das de la perfusin con solucin
clarificadora (0,1% TritonX-
100, 10% de clorito de sodio en agua desionizada). Un da despus de la iniciacin del proceso de
descelularizacin, las hojas comenz a perder su color verde debido a la prdida de clorofila, que
denota la prdida de cloroplastos del tejido de la hoja ( Figura 2 A y B). Hojas translcidas se hicieron
con una tonalidad verde para el da 5 ( Figura 2 DO). La adicin de clorito de sodio esteriliza el tejido
al mismo tiempo que la eliminacin de cualquier clorofila residual, resultando en una hoja incoloro y
translcido por el da 7 ( Figura 2 RE). identi anlisis histolgico fi clulas ed con ncleos y los
cloroplastos en las hojas nativos ( Fig. 3 , A y C), ninguno de los cuales se ha visto en sus homlogos
descelularizados ( Fig. 3 , B y D). Por otra parte, la lignina, que es un componente biopolimrico
importante de la vasculatura hoja, estaba presente antes y despus de descelularizacin como se
muestra por tincin histolgica adicional ( Fig. S10 ). hojas de espinaca descelularizado mantienen el
mismo patrn y densidad de las redes vasculares observados en hojas nativas ( Fig. 3 E y F) cuando
se obtuvieron imgenes por microscopa electrnica de barrido (SEM), que indica que el proceso de
descelularizacin no afect a las propiedades topogrficas de la superficie de la hoja. Ni solucin de
descelularizacin ni compensacin solo fue capaz de decellularize completamente las hojas
( Fig. S2 ), Indicando que tanto detergentes aninicos y no inicos pueden ser necesarios para
completar la eliminacin de material celular de la planta.
descelularizado hojas contenan signi fi cativamente menos de ADN (9,4 1.3
1129 vs. 217,3 ng de ADN / mg de tejido, Fig. 3 G) y signi fi cativamente menos protena en
comparacin con las hojas nativas (2.4 0.6 vs. 19.1 1.9 metro g / mg de protena, Fig. 3 MARIDO).
Estos datos demostraron que el proceso de descelularizacin planta elimina casi todo el ADN y
protena. Los niveles de ADN restante satisfacen un requisito mnimo determinado para clasificar un
tejido como descelularizado (<50 ng de ADN por mg de tejido) [32] . La cintica de eliminacin de
protenas demostraron una rpida y signi fi disminucin no puede de contenido de protena durante el fi
primera 10 min. Los niveles de protena disminuyeron an ms durante los das subsiguientes y
llegaron a la concentracin ms baja despus de 3 das de la descelularizacin ( Fig. S3 ). Despus
de 5 das de la perfusin, se encontr que la desviacin estndar entre los niveles de protena en
diferentes muestras a ser insignificante y por lo tanto 5 das de la perfusin con la solucin de
descelularizacin fue elegido como el tiempo estndar.
Para robusto caracterizacin de una estructura de tejido, es imperativo para examinar las
propiedades mecnicas del material de soporte, ya que estas propiedades rigen la capacidad del
tejido para funcionar. Cuando se compara con hojas nativas, hojas descelularizado muestran signi fi-
cativamente menor resistencia a la traccin final ( pag 0.00925) y deformacin en la rotura ( pag 0.000287)
durante el anlisis mecnico de traccin uniaxial ( Fig. S4 ). A pesar de la aparente prdida de
integridad mecnica, mximo mdulo tangente de las hojas de espinaca descelularizado (0,3 MPa)
estaba dentro del intervalo de tejido cardiaco humano descelularizado normal (0,2 mi 0,5 MPa) [8] .
Tambin exploramos la aplicabilidad de esta tcnica a otras especies y tejidos vegetales. Petroselinum
crispum ( tallos de perejil,
Arachis hypogaea ( man) races peludas, y Artemisia annua hojas tambin se descelularizado con
xito ( Fig. 3 I) lo que sugiere potencial extendido para el uso de una variedad de especies de plantas
y tejidos para descelularizacin. El examen histolgico de estos diferentes sistemas de la planta
tambin se llev a cabo y se obtuvieron resultados similares a los observados en las hojas de
espinaca ( Fig. S5 ), Donde hay una prdida notable de material nuclear, mientras que el
mantenimiento de la microarquitectura planta bruto. races peludas y annua Aretemisia se empaparon
en las soluciones descelularizacin y compensacin en lugar de la perfusin debido a su delicado
vasculatura. los niveles de ADN de A. annua Tambin se midieron con el fin de verificar que el remojo
realizaron los mismos niveles de descelularizacin como perfusin ( Fig. S5 ).
3.2. Evaluacin de la hoja vasculatura permeabilidad post-descelularizacin
Una ventaja importante de la utilizacin de la hoja descelularizado como un andamio para la
ingeniera de tejidos es la vasculatura innata. as Hemos tratado de determinar si la vasculatura hoja
permaneci intacta y de patentes despus del proceso de descelularizacin. Rojo Ponceau fue
perfundido a travs de la cnula de hojas de espinaca descelularizado. El Rojo Ponceau perfundido
largo de la totalidad de la vasculatura hoja, con un poco de pequeas fugas observ ( Fig. 4 UN;
Pelcula S1). El lquido de perfusin tambin Florida adeudado en ya travs de las ramas ms
pequeas de la vena de la hoja ( Fig. 4 B) lo que indica que la microvasculatura de la hoja se mantuvo
bastante intacto.
de vdeo complementario relacionado con este artculo se puede encontrar en
http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2017.02.011
Para una vascularizado andamio por ingeniera de tejidos a ser clnicamente relevante, el
dimetro interior de cualquier vaso mimticos deben permitir la sangre Florida Ay. capilares humanos
tienen dimetros de los vasos entre 5 y 10 metro metro [33] que el apoyo de la Florida owof el 6 mi 8 metro
m de dimetro glbulos rojos [34] . Para predecir si la red vascular de una hoja descelularizado
apoyara Florida ow de tales clulas, hoja vasculatura se perfundi con medio que contena Florida microesferas
fluorescentes de varios dimetros de tamao. Este mtodo permite la evaluacin de tanto el dimetro
como la permeabilidad de cualquier recipiente dado. Videos (Pelcula S2)
 JR Gershlak et al. / Biomateriales 125 (2017) 13 mi 22 17

Fig. Lapso 2. Tiempo de descelularizacin hoja de espinaca. (UN) La hoja es verde y opaca oscuridad antes de descelularizacin en el Da 0. ( SEGUNDO) En el da 1, la hoja pierde parte de su coloracin oscura y comienza a aparecer translcido. ( DO)
Para el da 5, la hoja es completamente transparente, manteniendo un tono verde claro. ( RE) Despus de ser tratado y esterilizado con clorito de sodio, la hoja pierde el resto de su color y se vuelve completamente descelularizarse el da 7.

Fig. 3. Caracterizacin de los andamios de plantas antes y despus de la descelularizacin. Hoja de la espinaca ( UN) antes y ( SEGUNDO) despus de descelularizacin; ( DO) Nativo y ( RE) descelularizado hoja manchada con safranina y Fast Green. Safranina-O (rojo) tie para los

cromosomas y los ncleos. Fast Green (verde azulado) manchas de citoplasma y las paredes celulares de celulosa. Las esferas oscuras azules son indicativas de los cloroplastos, que son muy abundantes en las hojas. Las barras de escala: 250 metro m y 50 metro m (inserto).

Exploracin de la imagen del microscopio electrnico de topografa de la superficie para ambos ( MI) nativo y ( F) espinacas descelularizado deja con inserciones que muestran mayor Magni fi catin. Las barras de escala: 100 metro metro. ( GRAMO) contenido de ADN fue cuanti fi ed a

travs de un ensayo CyQuant ( pag 0,00002; norte 4).

(MARIDO) La protena total antes y despus de descelularizacin hoja fue cuanti fi ed por el ensayo de Bradford ( pag 0.0000007; norte 3). ( YO) proceso de descelularizacin se aplic a otros tipos y estructuras de la planta. (Para la interpretacin de
las referencias de color en este fi leyenda figura, se remite al lector a la versin web de este artculo).

fueron adquiridos a 60 cuadros por segundo para visualizar la microesfera
Florida ow ( Fig. 4 DO; Para aumentar el contraste, la perla blanca era falsa de color en estos videos). El
medio que perfunde a travs de la hoja ( Florida ow travs) se recogi y se us para calcular el
porcentaje de microesferas recuperado midiendo Florida fluorescencia intensidad. Mientras que todo
metro m perlas se recuperaron despus de la perfusin, el transporte de los granos ms
el 1 y 10
grandes se volvi progresivamente ms restrictiva; slo el 46% de la 50 metro m y 10% de la 100 metro
Se recogieron m microesferas ( Fig. 4 RE). Adems, el anlisis de blanco Florida uid ser perfundido a
travs del sistema muestra algunos ruido generado por auto Florida fluorescencia, donde el 100 metro
Se encontr recogida de microesferas m estar dentro de esta regin de ruido. Coleccin de la 1 y la
10 metro m microesferas se encontr que era estadsticamente mayor que tanto la
100 metro coleccin m microesfera ( pag 0,01 para 1 metro m y 10 metro m microesferas) y la pieza
en bruto Florida ruido UID ( pag 0,009 para 1 metro my
pag 0,01 para 10 metro m microesferas). Visualizacin de las perlas atrapadas dentro de las
redes vasculares de la planta dio resultados complementarios ( Fig. 4 E y F); es decir, slo 50 y 100 metro
Se encontraron microesferas mdiameter estar atrapado dentro del tejido de la planta. Tomados en
conjunto, estos resultados demuestran que la vasculatura de la hoja soporta la
Florida ow de partculas dentro del intervalo de tamao de un glbulo rojo.
3.3. Recelularizacin de andamios hoja descelularizados con clulas humanas

El uso exitoso de la planta descelularizado tejidos para los tejidos humanos

18 JR Gershlak et al. / Biomateriales 125 (2017) 13 mi 22

Fig. Andamios hoja vasculares 4. espinaca retener capacidades de permeabilidad y de perfusin despus de descelularizacin. hoja descelularizado ( UN) antes y ( SEGUNDO) despus de la perfusin de rojo Ponceau. microesferas fluorescentes de diferentes dimetros
(1, 10, 50, y 100 metro m) y blanco Florida uid se perfundieron a travs de una hoja descelularizado. No se encontraron diferencias estadsticas entre el porcentaje recogido entre ambos 1 y 10 metro m y la coleccin de 100 metro m y blanco Florida UID. (* Indica p < 0,05,
# indica p < 0,01). ( DO) Marcos video captura la ubicacin de microesferas dentro de una vena de la hoja con el tiempo, con la flecha seguimiento de una microesfera individual. ( RE) Las microesferas que atravesaban las paredes vasculares se recogieron y su Florida fluorescencia
cuanti fi ed (n 3). ( E, F) Las imgenes de fluorescencia de la vasculatura hoja perfundidos con los granos. Las imgenes muestran el 50 y el 100 metro esferas m retenidas dentro de la vasculatura. Las barras de escala: 100 metro m (E), 500 metro m (F).

cultura depende de la capacidad de las clulas humanas a adherirse a ECM plantproduced. Diferentes Esto permitira un tejido ms grande y ms compleja para ser formado en estos andamios.
tipos de clulas humanas se sembraron o bien en la parte superior de los andamios de plantas
descelularizado o se introducen en las redes de planta vascular a travs de la canulacin.

3.4. madre pluripotentes funcin cardiomiocitos derivados de clulas en los andamios de plantas
Para endothelialize la vasculatura hoja, clulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC)
descelularizados
fueron sembradas en la vasculatura hoja andamio. Hoja vasculatura era fi primero recubierto con fi bronectin
con el fin de promover la unin celular a la ligni fi ed walls de la vasculatura de la hoja. HUVECs
cardiomiocitos derivados de clulas madre pluripotentes (HPS-CM) se sembraron sobre la
marcadas con acetilado lipoprotena de baja densidad (Dil-Ac-LDL) se entregan a travs de la cnula.
superficie de los andamios de la hoja con el fin de investigar si las clulas podran adherirse y
Despus de 24 h, HUVEC fijacin a la superficie interior de la hoja de vasculaturewas con fi rmedwith
mantener la funcionalidad. HPS-CM unidos a la superficie y los grupos de clulas formadas ( Fig. 6 A)
microscopa confocal ( Fig. 5 UN). HUVEC viabilidad despus de recelularizacin se evalu usando un
dentro de los tres das de la siembra. Cinco das despus de la siembra inicial, HPS-CM comenz a
ensayo de captacin de LDL. HUVECs no marcados se inyectan a travs de la cnula y se dejaron
contraerse de forma espontnea (Pelcula S3) mientras se sembraron en el andamio de la hoja
24 h para adjuntar a las superficies internas del tallo de la hoja. Sin semillas y no sembrado tallos se
mientras que el control HPS-CM sembraron en plstico de cultivo tisular (TCPS) comenz
incubaron en medio Dil-Ac-LDL y Florida seal fluorescente se evalu 24 y 48 h despus de la
contraccin en el Da 3.
incubacin. En ambos puntos de tiempo, hubo una positiva Florida seal fluorescente presente para
cabeza de serie, tallos y ninguna seal durante unseeded tallos, lo que indica que la HUVECs se
anlisis contrctil ( Fig. 6 B), basado en el sub-pxel cambio de nivel en
mantuvo viable despus de recelularizacin ( Fig. S6 ). Aunque HUVECs unidos y permanecieron
la intensidad de la luz al azar del grupo HPS-CM [31] , Demostr aproximadamente 1% de
viables despus de recelularizacin, se necesitarn mejoras en la funcionalizacin de la vasculatura
deformacin contrctil a una tasa de contraccin de
de la hoja y el uso de biorreactores de perfusin antes de la endotelizacin completa de puede ocurrir
0.8 Hz en los miocitos sembr en andamios de hojas. mapas espaciales de tensin revelaron
la hoja entera.
contraccin presente a lo largo de todo el clster HPS-CM mientras que la superficie del andamio
muestra poca o ninguna seal de tensin ( Fig. 6 DO). la tensin contrctil aumento fromDay 5 al da
10. En el da 10, la contraccin alcanz su punto mximo y se estabiliz durante 7 das, hasta el da

17. Hubo una disminucin en la contraccin del da 17 al da 21 ( Fig. 6 RE). En el Da 21 ( Fig. 6 E),
HPS-CM contraccin disminuy a 0,6% a una tasa de contraccin de 0,5 Hz. Los grupos de control
Se utilizaron clulas madre mesenquimatosas humanas (hMSC) para la siembra en la superficie
HPS-CM sembrado ontoTCPS tena un highermagnitude de la cepa contrctil en todos los das de
exterior de una hoja descelularizado ( Fig. 5 SEGUNDO). Para superar automtico Florida fluorescencia
anlisis y de estas medidas se encontr que eran estadsticamente mayor en los das 7 ( pag 0,04)
generada dentro del tejido de la planta, visto sobre todo en las longitudes de onda ms cortas del
y 17 ( pag 0,04). No hubo diferencia estadstica entre los grupos HPS-CM en los andamios de las
espectro visible [35] , HMSCs se marcaron con puntos cunticos antes de la siembra, como se
hojas y de control pblicas para todos los otros puntos de tiempo. anlisis contrctil en el da 10 (el
describi previamente [36] . El hMSCs adhiere fcilmente a toda la superficie de la hoja de 24 h
valor pico para el HPS-CM sembr en el andamio de la hoja) ( Fig. S8 ) Produjo valores de
despus de la siembra. La unin celular se observ tambin en la superficie exterior de perejil
deformacin similares para las clulas sembradas en el TCPS con cepas contrctiles cerca de 1.0%
descelularizado tallos ( Fig. S7 ), Indicando que las superficies de plantas tridimensionales podran ser
con una frecuencia de 0,37 Hz.
utilizados como andamios, fromplants con especies variadas o estructuras macro escala.

Debido a la disminucin de la contraccin en el da 21, se investig

 JR Gershlak et al. / Biomateriales 125 (2017) 13 mi 22 19

Fig. 5. Las clulas humanas se pueden usar para recellularize las hojas de espinaca descelularizado. La imagen de la hoja en la esquina superior izquierda de la imagen da la posicin relativa del que se derivan las imgenes A y B. ( UN) clulas endoteliales de vena umbilical

humana Dil-Ac-LDL-marcado (HUVECs) se sembraron dentro de una vena de una hoja de espinaca descelularizado por perfusin. Barra de escala: 250 metro metro. ( SEGUNDO) clulas madre mesenquimatosas humanas (hMSC) se marcaron con los puntos cunticos y se

siembran sobre la superficie de una hoja de espinaca descelularizado. Las barras de escala: 250 metro m para una imagen principal, y 50 metro m para insercin.

si la capacidad de manejo de calcio de estas clulas se mantuvo usando GCaMP3 informaron clulas
transfectadas HPS-CM [30] , Proporcionando una Florida seal fluorescente correspondiente a la
seal de calcio intracelular. vdeos de fluorescencia (pelcula S4) detectan GCaMP3
Florida fluorescencia ( Fig. 6 F), que corresponde a calcio Florida ux durante la contraccin. El da 21, el
cambio en Florida intensidad de la seal fluorescente en racimos HPS-CM se midi durante varios
ciclos contrctiles y se compara con la seal desde la superficie de la hoja ( Fig. 6 G y H). La seal de
calcio procedente de la agrupacin HPS-CM fue ms intensa que la seal desde la superficie de la
hoja, lo que sugiere que el HPS-CM retenido capacidades de calcio de manipulacin cuando se
sembraron en los andamiajes de la hoja y no era un artefacto de auto Florida fluorescencia. Adems,
la seal de calcio tambin sigui una frecuencia similar,
0,5 Hz, como se ve con la contraccin en el da 21 sugiere que los dos estn relacionados entre s y
por lo tanto los cardiomiocitos estn funcionando normalmente en la hoja. La seal de calcio desde el
HPS-CMS que se sembraron en los andamios de hoja tambin se compararon con HPS-CMS que se
sembraron sobre TCPS en el da 21 ( Fig. S9 ). seales de calcio tenan similares Florida intensidades
fluorescentes con el HPS-CM que tiene una frecuencia de manipulacin de calcio superior. Esta
diferencia en la frecuencia se debe probablemente a la diferencia en el tamao de los diferentes
grupos analizados como los racimos de HPS-CM formadas en la TCPSwere ms grande que los
grupos formados en los andamios de hojas.
reinos, as como para imitar las caractersticas biolgicas de otros reinos. Este enfoque novedoso
puede ser explotado con el fin de utilizar paradigmas que han evolucionado en un reino biolgica con
el fin de proporcionar soluciones a los problemas que otro caras Unido, a travs de una interfaz
comn. Mediante la bsqueda de interfaces entre los sistemas de plantas y animales, las nuevas
soluciones pueden ser diseados con eficacia para una amplia variedad de disciplinas, como
medicina regenerativa.
Por ejemplo, el principal factor limitante que afecta a la traduccin clnica de la ingeniera de
tejidos es la falta de redes vasculares viables en los tejidos de ingeniera. tcnicas de fabricacin
actuales, tales como la impresin 3-D, no pueden con precisin y eficacia crear microvasculatura, tal
como el que se ve en los lechos capilares. Con todo esto en mente, hemos buscado inspiracin en el
reino de las plantas para hacer frente a este reto. vasculatura Plant, como vasculatura de mamfero,
apoya Florida flujo de Florida UID y el transporte de biomolculas importantes. Este transporte se logra
a travs de un mecanismo diferente en la planta de vasos inmammalian, pero las estructuras son
similares, especialmente la arquitectura microvascular. Adems, la celulosa que es el componente
principal de las paredes celulares de las plantas es un polisacrido bien estudiado y biomaterial. La
celulosa se ha utilizado en una amplia variedad de aplicaciones de medicina regenerativa, tales como
la ingeniera de tejidos de cartlago [37,38] , Ingeniera de tejido seo [39,40] Y cicatrizacin de heridas [20,21]
. Para estos estudios, la celulosa se deriva generalmente de bacterias con el fin de controlar el fi geometras
BER y propiedades qumicas. Ms recientemente, sin embargo, la celulosa se aisl de tejido
hypanthium manzana descelularizado y se utiliz para apoyar la unin celular y la proliferacin en un
andamio 3D [22] . Se encontr que el material a ser biocompatible cuando se implanta

4. Discusin

explorar biolgica ortogonalidad entre los reinos proporciona una oportunidad nica para
interconectar mltiples biolgica
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Fig. 6. cardiomiocitos derivados de clulas madre pluripotentes Humanos (HPS-CM) se adhieren y funcin en la superficie de un andamiaje de la hoja durante 21 das. (UN) HPS-CMs se adhieren y grupos de clulas formulario. La barra de escala: 50 metro metro. ( SEGUNDO)
cepa contrctil de HPS-CM fue cuanti fi ed a travs del desplazamiento de nivel de subpxel de los grupos de clulas. La contraccin se representa grficamente en el tiempo de los vdeos grabados y, en el da 10, se encontr el cmulo de contratar a cerca de un 1% de
deformacin. ( DO) cepa contrctil puede ser visualizado a travs de un mapa de calor. ( RE) strainwas contrctiles miden ms de 21 das para un grupo de clulas. strainwas contrctiles comparacin con un control de HPS-CM cultivaron sobre plstico de cultivo tisular
(TCPS). Las cepas calculados en los das 7 y 17 resultaron ser estadsticamente mayor en clulas sembradas en el TCPS en contraposicin a las clulas sembradas en los andamios de la hoja (* indica p < 0,05). No hubo diferencias estadsticas calculadas en cualquiera
de los otros puntos de tiempo. ( MI) Da 21 valores de deformacin que muestran la magnitud tensin contrctil bajado. ( F) HPS-CM fueron modi fi ed con un reportero GCaMP3 [30] , Proporcionando una Florida seal fluorescente correspondiente al intracelular Florida ux de
iones de calcio. ( G, H) El cambio relativo de Florida seal fluorescente se visualiz y se compara con relacin a la superficie de la hoja en el Da 21.

por va subcutnea en vivo [ 23] . El acoplamiento de las similitudes observadas entre vasculatura de
mamferos y de la planta con la aparente biocompatibilidad y propiedades regenerativas del tejido de
la planta, hemos tratado de
reinos cruzados y estudiar si las plantas descelularizado podran servir como un andamio perfusable
para la ingeniera de tejidos.
tcnicas de perfusin descelularizacin fueron adaptadas con xito para el uso con tejidos de la
planta. mltiples tipos de plantas, todas con diferentes geometras jerrquicos, fueron capaces de ser
descelularizado incluyendo, espinacas y A. annua hojas, tallos de perejil, y las races peludas de
man. Espinacas fue elegido como la hoja de modelo a travs del resto del estudio debido a su fcil
disponibilidad y su alta densidad vascular. Otras especies de plantas fueron elegidos para resaltar el
potencial generalizado de la tcnica. Descelularizacin era verificable fi ed a travs de la tincin
histolgica, as como cuanti fi cacin del contenido de ADN y protena. La tincin histolgica mostr la
prdida de materiales nucleicos a partir de tejido de la planta mientras se mantiene la estructura y la
composicin nativo que difiere del tejido, como se observ cuando la lignina se ti antes y despus
de la descelularizacin. La vasculatura se mantuvo patente despus de descelularizacin, como se
demuestra por perfusin microesfera. El uso de las microesferas, el dimetro de los vasos de la
vasculatura perfusable dentro de las hojas de espinaca podra ser aproximada, que se encontr para
apoyar Florida ow de partculas del tamao de las clulas de la sangre humana. El andamio planta
descelularizado tambin apoy recelularizacin clula humana. Adherido HUVECS exhibi cierta
aproximacin a las paredes vasculares interiores, y permaneci viable; MSCs adheridas a la
superficie de la hoja; y hPSCMs contraen espontneamente en el transcurso de 21 das mientras que
est unido a la superficie de los armazones de las hojas.
han demostrado ser un aspecto crucial cuando la ingeniera de tejidos. Dado que una amplia
variedad de estructuras anatmicas existe dentro del reino de las plantas [17] , fi Nding estructuras con
propiedades mecnicas que emulan los necesarios para un andamio de la ingeniera tisular, incluso
despus de la descelularizacin, debera ser factible. Esto es ventajoso debido a la diversidad en la
arquitectura de diferentes plantas y sus estructuras, con la esperanza de que puedan ser capaces de
recapitular algunas de las complejidades visto dentro de los tejidos de mamferos y por lo tanto dar
lugar a futuras aplicaciones clnicas. Una mayor optimizacin e investigacin sera necesario
entender que el tejido vegetal que sera apropiado para diferentes aplicaciones de ingeniera de
tejidos. Un tejido de la planta altamente vascularizado, como la hoja de espinaca, podra ser ms
adecuado para un tejido altamente vascularizado, como el tejido cardaco, mientras que la estructura
hueca cilndrica del vstago de Impatiens capensis podra adaptarse mejor a un injerto arterial. A la
inversa, las columnas vasculares de la madera pueden ser tiles en la ingeniera de hueso debido a
su fuerza relativa y geometras.
soluciones de ingeniera de tejidos a base de plantas necesitan ser aclarados y explorado antes
de la traduccin en las aplicaciones mdicas ms. Las soluciones descelularizacin utilizados en este
estudio contienen altas concentraciones de detergentes que se eligieron despus de una
investigacin inicial que represent el tiempo necesario para la descelularizacin. detergentes
residual presente despus de descelularizacin han sido demostrado que afectan a la viabilidad
celular [41] y por lo tanto podra ser problemtico con el uso de altas concentraciones de detergentes.
Haba por lo peores problemas de viabilidad slo limitadas en este estudio, sin embargo, este y otros
problemas potenciales debe abordarse con ms re fi refinamiento de las tcnicas de descelularizacin.

Mediante el uso de la arquitectura natural del tejido de la planta, podramos disear con eficacia En la actualidad, an no est claro cmo la planta vasculaturewould integrarse en el sistema
una multiplicidad de tejidos de mamferos, dependiendo de la plantilla de la planta. Coincidencia de vascular humano nativo y si no sera una respuesta inmune. celulosa descelularizado es
propiedades mecnicas nativos
 JR Gershlak et al. / Biomateriales 125 (2017) 13 mi 22
biocompatible y biodegradable [23] , Pero no est claro el en vivo
respuesta a todo tejido vegetal descelularizado. tendr que ser hecho en la respuesta inmune
materna a ms complejos andamios de plantas de composicin futura investigacin. Adems, hemos
demostrado la capacidad de HUVECs para adjuntar a la vasculatura hoja interior despus de 24 h.
Tener un andamio no trombognico, necesidades endotelizacin completo debe ser demostrada y
debe haber funcionalidad.
La capacidad de recellularize totalmente el tejido descelularizado ha sido durante mucho tiempo
un problema importante en la fi Se necesitan estudios de campo y futuras a recellularize endotelio de
tejido vegetal. Ms reciente investigacin en recelularizacin tejido complejo, como la vascularizacin
de todo el pulmn [42] , Ha ido mejorando y estas nuevas tcnicas sern cruciales para mejorar el
potencial mdico de nuestros andamios vegetales y otros tejidos descelularizado. Uno fi aspecto final
de nuestros andamios planta que necesita ser desarrollado con el fin de mejorar la traduccin
mdica, es la pregunta sobre a cabo Florida ow en la vasculatura de la planta. vasculatura planta no
tiene una salida separada Florida sistema ow, tales como el sistema venoso. Un injerto de ingeniera
tisular potencial en base a los andamios de plantas podra utilizar mltiples hojas, donde algunos
actan como apoyo arterial y algunos actan como el retorno venoso.
El uso de plantas como la base para andamios de ingeniera de tejidos tiene muchos beneficios fi ts
fuera de sus redes vasculares innata. Hay una tendencia actual en el desarrollo de tecnologa para
becomemore
verde y el medio ambiente debido a la preocupacin por el cambio climtico antropognico y
disminucin de los suministros de recursos naturales. andamios de ingeniera tisular se producen
tpicamente ya sea de biomateriales derivados de animales o sintticos, ambos de los cuales tienen
un coste grande y gran impacto ambiental. biomateriales derivados de animales utilizados
ampliamente como materiales de andamiaje para ingeniera de tejidos incluyen protenas ECM
nativos tales como el colgeno I o
fi bronectin y tejidos animales enteros y rganos. Anualmente, 115 millones de animales [43] se estima
que se utilizar en la investigacin. Debido a este gran nmero, una gran cantidad de energa es
necesaria para el mantenimiento y la alimentacin de estos animales, as como para disponer de la
gran cantidad de residuos que se generan. Junto con este impacto ambiental, la investigacin con
animales tambin tiene una gran cantidad de consideraciones ticas, lo que podra ser aliviado por la
renuncia a los modelos animales en favor de ms biolgicamente relevante in vitro modelos de tejido
humano.
biomateriales sintticos se generan comnmente de transformacin qumica de los recursos no
renovables, como el petrleo, y su produccin a menudo produce subproductos txicos. Un ejemplo
de un biomaterial que afecta negativamente al medio ambiente se puede encontrar a partir de
politetrafluoroetileno Florida uoroethylene (Te Florida en), un biomaterial sinttico ampliamente utilizado
en aplicaciones cardiovasculares tales como ingeniera tisular injertos vasculares [44] . Durante alta
degradacin temperatura de Te Florida en, grandes cantidades de gases que agotan el ozono tales
como tri-
Florida cido uroacetic y chlorodi Florida uoroacetate [45] son generadas. Si bien esto no es un
problema en el cuerpo cuando Te Florida en se utiliza como un injerto, los subproductos de fabricacin
son una preocupacin importante para la produccin y el almacenamiento del material.
Recientemente, ms fuentes ecolgicas para la produccin de biomateriales han sido explorados,
tales como sntesis de aceites vegetales [46] y polimerizacin de bio-polmeros naturales como la
celulosa [47] . Mediante la explotacin de la qumica benigna de andamiaje de tejido de planta,
podramos abordar las muchas limitaciones y altos costos de materiales compuestos sintticos,
complejas. Por otra parte, hay muchos problemas en la produccin en masa de materiales que
podran superar el uso de tejido de la planta. Las plantas pueden ser cultivadas fcilmente usando
buenas prcticas agrcolas (BPA) y en ambientes controlados. Mediante la combinacin de tejido de
la planta con el medio ambiente con la descelularizacin a base de perfusin, hemos demostrado
que no puede haber una solucin sostenible para los andamios de ingeniera de tejidos
pre-vascularizados.
En este estudio, hemos demostrado la viabilidad de usar plantas descelularizado para
proporcionar andamiaje producida de forma sostenible para el tejido
21
Ingenieria. Mediante la aplicacin de paradigmas de un reino a otro, ideamos amethod para hacer
frente a la limitacin de la perfusin que existe en los enfoques tradicionales de la ingeniera de
tejidos y medicina regenerativa. Nuestra investigacin se han obtenido resultados prometedores,
pero todava quedan muchas preguntas antes que las plantas descelularizado se hacen clnicamente
relevante. El desarrollo de las plantas descelularizado para andamios abre la posibilidad de una
nueva rama de la ciencia que investiga el mimetismo entre los reinos, por ejemplo, entre plantas y
animales. Aunque se necesita ms investigacin para entender las futuras aplicaciones de esta
nueva tecnologa, creemos que tiene el potencial de convertirse en una verde solucin pertinente
para una gran variedad de aplicaciones de la medicina regenerativa.
Contribuciones de autor
JRG realizado y analizado los protocolos de descelularizacin,
estudios de perfusin, recelularizacin de mamferos, anlisis contraccin HPS-CM, y ensayo
mecnico. SH, SAL, y DMD adquiri y analiz el ADN y el contenido de protenas. GF adquiri
imgenes SEM. LRP realizado y analizado tincin histolgica. KJH adquiridos y analizados
contraccin HPS-CM. BYKB adquiri PEG /
Florida uorescena imgenes. TY y FM B man cultivado y descelularizado races peludas. PJW y CLC
provee supervisin de biologa vegetal. MWR asesor en el diseo y anlisis de datos
experimentales. TD y WLM proporcionan supervisin ingeniera de tejidos.
JRG y GRG dise el estudio. JRG recogi y reuni a los datos. GRG supervis el estudio. JRG,
PJW, TD, GRG escribi el manuscrito. Todos los autores revisaron y comentaron el manuscrito.
Expresiones de gratitud
Los autores desean agradecer al Dr. Michael La Florida amme (Universidad de Toronto) para
proporcionar la amabilidad de las HPS-CM utiliz en este estudio. Este trabajo est apoyado en parte
por el National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL115282 a GRG) y la Fundacin Nacional de
Ciencias (DGE1144804 a JRG, SH, KJH, DMD, MWR, TD,
GRG). Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto. Todos los datos necesarios para
evaluar las conclusiones formuladas en este documento estn presentes dentro de los datos
presentados en el trabajo y / o los materiales suplementarios. Los datos adicionales pueden
solicitarse a los autores.
Apndice A. Los datos complementarios
Los datos suplementarios relacionados con este artculo se pueden encontrar en http: //
dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2017.02.011 .
referencias
[1] Introduccin, Am. J. Transplant. 16 (2016) 8 mi 10, http://dx.doi.org/10.1111/
ajt.13665 .
[2] RK Jain, P. Au, J. Tam, DG Duda, D. Fukumura, Ingeniera vascularizado
tejido, Nat. Biotechnol. 23 (2005) 821 mi 823, http://dx.doi.org/10.1038/ nbt0705-821 .
[3] MC Peters, PJ Polverini, DJ Mooney, redes vasculares de ingeniera en matrices polimricas porosas, J. Biomed.
Mater. Res. 60 (2002) 668 mi 678 .
[4] H. Gerhardt, VEGF y orientacin endotelial en brotacin angiognico, Organogenesis 4 (2008) 241 mi 246 .
[5] JT Borenstein, H. Terai, KR King, EJ Weinberg, MR-Kaazempur Mofrad,
JP Vacanti, tecnologa de microfabricacin para la ingeniera de tejido vascularizado, Biomed. Microdevices 4
(2002) 167 mi 175, http://dx.doi.org/10.1023/A: 1016040212127 .
[6] HC Ott, TS Matthiesen, S.-K. Goh, LD Black, SM Kren, TI Netoff, et al.,
Perfusin-descelularizado matriz: el uso de la plataforma de la naturaleza para disear un bioarti fi corazn cial,
Nat. Medicina. 14 (2008) 213 mi 221, http://dx.doi.org/10.1038/ nm1684 .
[7] JR Gershlak, JIN Resnikoff, KE Sullivan, C. Williams, RM Wang, LD Black,
Las clulas madre mesenquimales capacidad de generar la tensin de traccin en respuesta a
22 JR Gershlak et al. / Biomateriales 125 (2017) 13 mi 22

rigidez sustrato es modulada por el cambio de composicin de la matriz extracelular del corazn durante el Arachidin-3 en cultivos de raz fasciculada de man Co-tratado con jasmonato de metilo y la ciclodextrina, J.
desarrollo, Biochem. Biophys. Res. Commun. 439 (2013) 161 mi 166, http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2013.08.074 Agric. Food Chem. 63 (2015) 3942 mi 3950, http: //
. dx.doi.org/10.1021/jf5050266 .
[8] JP Guyette, J. Charest, RW Mills, B. Jank, PT Moser, SE Gilpin, et al., [28] SE Ruzin, Planta Microtcnica y microscopa, Oxford University Press, 1999 .
Bioingeniera miocardio humano en la matriz extracelular nativa, Res circulacin.
118 (2015) 56 mi 72, http://dx.doi.org/10.1161/CIRCRE- [29] C. Hawes, PB Gahan, Plant histoqumica y citoqumica: una Introduccin, 1985 .
SAHA.115.306874 . CIRCRESAHA.115.306874.
[9] JJ Song, HC Ott, ingeniera Organ basado en andamios de matriz descelularizados, Trends Mol. Medicina. 17 [30] JJH Chong, X. Yang, CW Don, E. Minami, Y. -W Liu, JJ Weyers, et al., Human
(2011) 424 mi 432 . cardiomiocitos derivados madre embrionarias de clulas-regeneran corazones de primates no humanos,
[10] KE Sullivan, KP Quinn, KM Tang, I. Georgakoudi, LD Black III, extracelular Naturaleza 510 (2014) 273 mi 277, http://dx.doi.org/10.1038/ nature13233 .
remodelacin de la matriz despus de un infarto de miocardio en Florida uye el potencial teraputico de las clulas
madre mesenquimales, Tallo Res clula. Ther. 5 (2014) 1 mi diecisis, [31] DJ Kelly, Azeloglu UE, PV Kochupura, GS Sharma, GR Gaudette, Exactitud
http://dx.doi.org/10.1186/scrt403 . y la reproducibilidad de un mtodo de correlacin de fase subpixel extendido para determinar micras
[11] TW Gilbert, TL Sellaro, SF Badylak, descelularizacin de tejidos y rganos, desplazamientos de nivel en el corazn, Med. Ing. Phys. 29 (2007) 154 mi 162, http://dx.doi.org/10.1016/j.medengphy.2006.01.001
biomateriales 27 (2006) 3675 mi 3683, http://dx.doi.org/10.1016/ .
j.biomaterials.2006.02.014 . [32] PM Crapo, TW Gilbert, SF Badylak, una visin general de los tejidos y rganos entera
[12] TD Johnson, RC Hill, M. Dzieciatkowska, V. Nigam, A. Behfar, KL Christman, procesos de descelularizacin, Biomateriales 32 (2011) 3233 mi 3243, http: //
et al., Quanti fi cacin de matriz de miocardio humano descelularizado: una comparacin de seis pacientes, dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2011.01.057 .
Protemica Clin. Appl. 10 (2016) 75 mi 83, http://dx.doi.org/ [33] MP Wiedeman, Las dimensiones de los vasos sanguneos a partir de la distribucin de la arteria a
10.1002 / prca.201500048 . la recogida de la vena, Circulation Res. 12 (1963) 375 mi 378, http://dx.doi.org/
[13] SE Gilpin, JP Guyette, G. Gonzalez, X. Ren, JM Asara, DJ Mathisen, et al., 10.1161 / 01.RES.12.4.375 .
Perfusin descelularizacin de pulmones humanos y porcinos: llevar la matriz a escala clnica, J. Heart Lung [34] YC Fung, BW Zweifach, la microcirculacin: la mecnica de la sangre Florida flujo de cap-
Transpl. 33 (2014) 298 mi 308, http://dx.doi.org/ illaries, Annu. Rev. Mech fluido. 3 (1971) 189 mi 210 .
10.1016 / j.healun.2013.10.030 . [35] MD Fricker, NS blanco, consideraciones longitud de onda en la microscopa confocal de
[14] SF Badylak, D. Taylor, K. Uygun, la ingeniera de tejidos Whole-rgano: decellula- especmenes botnicos, J. Microsc. 166 (1992) 29 mi 42, http://dx.doi.org/10.1111/
rizacin y recelularizacin de andamios tridimensionales de matriz, Annu. Rev. Biomed. Ing. 13 (2011) 27 mi 53, j.1365-2818.1992.tb01505.x .
http://dx.doi.org/10.1146/annurev-bioeng-071910-124743 . [36] JP Guyette, M. Fakharzadeh, EJ Burford, Z.-W. Tao, GD Pins, MW Rolle, et
al., un nuevo mtodo basado en la sutura para ef fi ciente trasplante de clulas madre,
[15] KA McCulloh, JS Sperry, FR Adler, el transporte de agua en las plantas obedece Murray de J. Biomed. Mater Res. Un 101 (2013) 809 mi 818, http://dx.doi.org/10.1002/ jbm.a.34386 .
la ley, la naturaleza 421 (2003) 939 mi 942, http://dx.doi.org/10.1038/nature01444 .
[diecisis] CD Murray, El principio fisiolgico de trabajo mnimo: I. el sistema vascular y el costo de volumen de [37] A. Svensson, E. Nicklasson, T. Harrah, B. Panilaitis, DL Kaplan, M. Brittberg, et
sangre, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 12 (1926) 207 mi 214 . al., celulosa bacteriana como un andamio potencial para la ingeniera de tejidos de cartlago, Biomateriales
26 (2005) 419 mi 431, http://dx.doi.org/10.1016/
[17] LJ Gibson, la estructura y la mecnica de materiales vegetales jerrquica, JR j.biomaterials.2004.02.049 .
Soc. Interfaz 9 (2012), http://dx.doi.org/10.1098/rsif.2012.0341 [38] FA Mller, L. Mller, I. Hofmann, P. Greil, MM Wenzel, R. Staudenmaier,
rsif20120341 mi 2766. materiales de andamiaje a base de celulosa para la ingeniera de tejido de cartlago, Biomaterials
[18] I. Levental, Georges PC, PA Janmey, materiales biolgicos blandos y su impacto sobre la funcin celular, Soft 27 (2006) 3955 mi 3963, http://dx.doi.org/10.1016/
Matter 3 (2007) 299 mi 306 . j.biomaterials.2006.02.031 .
[19] FA Pettolino, C. Walsh, GB Fincher, A. Bacic, Determinando el polisacrido [39] J. Liuyun, L. Yubao, Preparacin y propiedades biolgicas de un armazn de material compuesto novedoso de /
composicin de las paredes celulares de la planta, Nat. Protoc. 7 (2012) 1590 mi 1607, http: // quitosano / celulosa carboximetil nano-hidroxiapatita para ingeniera de tejido seo, J. ... 16 (2009) .
dx.doi.org/10.1038/nprot.2012.081 .
[20] WK Czaja, DJ Young, M. Kawecki, RM Brown, Las perspectivas de futuro de mi- [40] M. Zaborowska, A. Bodin, H. B ackdahl, J. Popp, A. Goldstein, P. Gatenholm,
celulosa microbianas en aplicaciones biomdicas, Biomacromolecules 8 (2007) 1 mi 12, http://dx.doi.org/10.1021/bm060620d celulosa bacteriana microporosa como un andamio potencial para la regeneracin sea, Acta Biomater.
. 6 (2010) 2540 mi 2547, http://dx.doi.org/10.1016/
[21] W. Czaja, A. Krystynowicz, S. Bielecki, RM Brown, celulosa microbiana re el j.actbio.2010.01.004 .
poder natural para curar heridas, Biomateriales 27 (2006) 145 mi 151, http: // [41] B. Zvarova, FE Uhl, JJ Uriarte, ZD Borg, AL Coffey, NR Bonenfant, et al.,
dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2005.07.035 . mtodo residual deteccin de detergente para la evaluacin no destructiva de citocompatibilidad andamios
[22] DJ Modulevsky, C. Lefebvre, K. Haase, Z. Al-Rekabi, AE Pelling, Apple deriva todo el pulmn descelularizados, Tissue Eng. Parte C Mtodos 22 (2016) 418 mi 428, http://dx.doi.org/10.1089/ten.TEC.2015.0439
andamios de celulosa para el 3D de cultivo de clulas de mamfero, PLoS ONE 9 (2014) e97835, .
http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0097835 . [42] X. Ren, PT Moser, SE Gilpin, T. Okamoto, T. Wu, LF Tapias, et al., Ingeniera
[23] DJ Modulevsky, CM Cuerrier, AE Pelling, biocompatibilidad de subcutane- vasculatura pulmonar en rata descelularizado y los pulmones humanos, Nat. Biotechnol. 33 (2015) 1097 mi 1102,
http://dx.doi.org/10.1038/nbt.3354 .
biomateriales de celulosa derivados de plantas ormente implantados, PLoS ONE 11 (2016) e0157894, http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0157894
. [43] K. Taylor, N. Gordon, G. Langley, W. Higgins, las estimaciones para el uso de animales de laboratorio en todo el
[24] F. Munarin, SG Guerreiro, MA Grellier, MC Tanzi, MA Barbosa, P. Petrini, et mundo en 2005, Atla 36 (2008) 327 .
biomateriales inyectables, basadas en pectina al. para la ingeniera de tejido seo, Biomacromolecules 12 [44] H. Shin, S. Jo, AG Mikos, materiales biomimticos para ingeniera de tejidos, Biomaterials 24 (2003) 4353 mi 4364 .
(2011) 568 mi 577, http://dx.doi.org/10.1021/bm101110x .
[25] LM Ferreira, CS Sobral, L. Blanes, MZ Ipolito, EK Horibe, proliferacin de las [45] DA Ellis, SA Mabury, JW Martin, DC Muir, termlisis de Florida uoropolymers
como una fuente potencial de cidos orgnicos halogenados en el medio ambiente, Naturaleza 412 (2001)
fi fibroblastos cultivados en un apsito hemi-celulosa, J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 63 (2010) 865 mi 869, http://dx.doi.org/10.1016/j.bjps.2009.01.086
. 321 mi 324, http://dx.doi.org/10.1038/35085548 .
[26] J. Condori, G. Sivakumar, J. Hubstenberger, MC Dolan, VS Sobolev, F. Medina- polmeros, basados en aceite vegetal-[46] S. Miao, P. Wang, Z. Su, S. Zhang como futuro
Bolivar, la biosntesis inducida de resveratrol y los estilbenoides prenylated arachidin-1 y arachidin-3 en biomateriales polimricos, Acta Biomater. 10 (2014) 1692 mi 1704, http: //
cultivos de raz fasciculada de cacahuete: efectos de medio de cultivo y la etapa de crecimiento, Plant Physiol. dx.doi.org/10.1016/j.actbio.2013.08.040 .
Biochem. 48 (2010) 310 mi 318, http: // [47] A. Gandini, polmeros a partir de recursos renovables: un desafo para el futuro de
dx.doi.org/10.1016/j.plaphy.2010.01.008 . materiales macromoleculares, Macromolecules 41 (2008) 9491 mi 9504, http: //
[27] T. Yang, L. Fang, C. Nopo-Olazabal, J. Condori, L. Nopo-Olazabal, C. Balmaceda, dx.doi.org/10.1021/ma801735u .
et al., la produccin mejorada de resveratrol, piceatannol, Arachidin-1, y