Laporan Penelitian Tahun Il Hibah Penelitian Kerjasama Antar Perguruan Tinggi (HIBAH PEKERT!} Analisis Komunitas dan Filogeni Bakteri- Bakteri Termofilik Sumber Air Panas di Wilayah Jawa Tengah Oleh: Agustina L. N. Aminin, M.Si. Mukhammad Asy‘ari, M.Si. Dra. Nies Suci Mulyani, MS. Didenai oleh: Proyek Peningkatan Paneltian Pendidikan Tinggl (P47), Direktoral Jenderal Perdiidiken Tinggl, Departemen Pendidikan Nasional, sesual dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan Perelitian Kerjasama Antar Parguruen Tinggi Nannor 324/P4T/DPPM/HPTPIIV/2004 targgal 20 April 2004 Universitas Diponegoro Semarang 2005Holoman Pengesahan Laporan Akhir Penelitian Hibah Penelitian Kerjasama Antar Pergoruan Tinggi 1. Judul Penelitien 2, Ketua TPP Nama Jabaton/Golongan Laberaterium/lurasan: Fakultas/Universisas Anggota TPP 3. Ketua TPM. Nama Laboratoriun/Juusan Fakultas/Universitas 4, Biaya Tahun £ Bieya das DIKTI 5. Lama Perelitian Il 6 Tempat Penelitian Analisis Konsunitas dan Filogeni Bakteri-Bakteri Termofilik Sumber Air Panas di Wilayah Jawa Tengah Agustina L.N.A, SSi., MSi,/ NIP 132 221 662 Asisten Abi ILA. Laboratorium Biokimia’Jurusan Kinia FMIPA/Universitas Diponegoro — Semarang 1, Mukhammad Asy'ari, Si, M.Si 2 Dra. Nies Suci M, MS. Akhmaloka, DipLBiotech,PhD/NIP, 13} 690 330 Laboratorium KBK Asam Nukleat dan Genetika Molekul /Departemnen Kimia FMIPA/Iostitut Teknologi Bandung, Rp 68.000.000,00 Rp 68.000.000,00 7 (exjuh) bulan 1. Laboratorium KBK Asam Nukleat dan Genetika Molekul (rem) 2, Laboratorium Biokimia (TPP) Semarang5 November 2005 Menyetujui TPM Kern TPP ” ‘Dipl Biotech PhD Agudina LNA, SSi., MSi DIR. 131 660 330 NIP. 132231 662RINGKASAN Analisis Komunitas dan Filogeni Bakteri-Bakteri ‘Termofilik Sumber Air Panas di Wilayah Jawa Tengah Agustina L.N. Aminin”, M.Asy’ati™, N.S. Mulyani”, Akbmaloka’” ° Jurusan Kini FMIPA, Universitas Diponegers, Semarang ” peperiamen Kiowa = Fae, titi Tilo! Borda, Honding Pada tahun pertama telah diperoieh 7 amplikon untuk dianalisis lebib lanjut. Produc PCR tersebat bervpa flagmen DNA Derukuran sekiter 400 po yang diperoleh dari basil amplifikasi fragmen gea 168 sRNA menggunakan templat DNA kromosom. ‘sotat bakteri termofilk dari sumber air panas Gedong Songo, Dieng dan Baturraden, Ketujub amplikon tersebut dianalisis menggunakan metode Denaturing Gradient! Gel Electrophoresis (DGGE). DGGE dilakukan dalam berbagai kondisi terutama varinsi gzadien denaturan gel, desar tegangan dim wakta yang digunakan dalam proves clekaroforesis. Hasil analisis DGGE techadap fragmea DNA dari seluruh fealet Gedong Songe (GS) merainjukkes: adanya 12 pite, tiga pita pada masing-masing isolst berada peda posisi yang sejajar. Tyjub pita DGGE dari Gedongsongo telah dianalisis unutan nukleotidanye, tga pita menunjukkan kesamaan cukup tinggi dengan golongan ‘Thernaus sodangkan empat pita yong lein didaga merupakan spesies bar, Satu kolo, tunggnl dari GS (He) teridemifikesi sebagai Geobacillus, Pada isolat Banurraden (BR), hasil DGGE menunjukkan adanys 10 pita, ‘Tiga pita yang dianatisis uruten nukleotidanya menmnjukkan tingkat kelcerabatan tinggi dengan golongan Bacillus (Geobact#us), demikian pula dengan koloni tunggal dari BR yeity Mbw termasuk golongan Geobactttus, Hasil DGGE filtrat sel kawah Dieng menanjukkea adenya empst pite yang culeup doncnan. Sta sv kul Deng yang dnunbunlan pada matin salah (ADS), aviabel $ dari gene 165 *RNA yang terumplifikasi dari DNA kromosomay® oat i kesomagn ting) dengen urutan mukleotida dari Pseudomonas sp. Hasil ji enzim ekstraselnler terhedap ‘muitur tunggal He, Mbw, dan AD3; menunjukkan bahwa He dan Mbw memiliki protease, amilase dan bets galaktosidase. Sedanghan AD3 hanya positif memiliki protease ekstraseluler. ‘Kata kuaci: DDGE, PCR, 16S rRNASUMMARY Community and Phylogeny Analysis of Thermophilic Bacteria from Some Hot Springs in Central of Java Agustina L.N.Aminin”, M.Asy’ari?, N.S, Mulyani”, Akhmaloka"®? sparen af Chen Pecup of Malietes nd Nota! Selene, Cipenegiro Unveray, Sarass eperimani of Chessy — Farny of MatNenrttes and Natnrot Selanoes, Bancing Intee of Technology Seven amplicons have been obteined st the first yoar, and need to be analyzed further. These PCR products were the gene ftagments of 16S rRNA that amplified chromosome! DNA of thermophilic bacteria ftom Gedongsongo, Beturraden, and Dieng bot springs. Those seven xnplicons have been anely2e6 using DGGE method, The DGGE were optimized according to doncturing gradient, voltege, aud ime electrophoresis runing. The DGGE result from all Cedongsonge isolates revered 12 different bands, three bends from cach sample present at the same ine. Seven bands have been Te-PCR and sequenced. Three bands have a phylogenctic relationship with Thermus sp. and the other four bands hav. been expected as novel bacterie. The single colony fom GS (He) bas a high similacity with Geabacillus sp. according to morphological study and 16S cRNA fragment gene sequence. The Boturaden DGGE pattem showed there are 10 different bans, Three of them have been sequenced their nucleotide and having relationship with Bacillus sp. Tho Mwy isolate of Baturraden single colony is Geobacillus sp. There are four predominant bands in Dieng DGGE. gel, Isolate ADS from Dieng that cultured in Sulfolobus medium showed a high sivilarty of their 16 rRNA gene fragment with Psercdomonas sp, Extra cellular enzyme analysis of He, Mow, and AD3 isolates revealed that He and ‘Mbw have protease, amylase, and beta-galactosidase, However AD3 has only extra cellular protease, Keywords: DGGE, PCR, 16S rRNADAFTAR ISI LAPORAN PENELITIAN Halaman LEMBAR IDENTITAS LEMBAR PENGESAHAN ii RINGKASAN DAFTAR ISI LAPORAN PZNELITIAN.... KATAPENGANTAR. BABI. PENDAHULUAN BABIL LANDASAN TEORETIK. . BABHL METODE PENELITIAN BABIV. HASILPENELITIAN ... BAB V. PEMBAHASAN HASIL PENELITIAN BAB VI, KESIMPULANDAN SARAN ..... DAFTAR PUSTAKA, LAMPIRAN .... -= 000 ¢0--KATA PENGANTAR Syukar Alhemdufillots kami panjetkan kepada ALLOW SWT, scimab dengan Ridho- aya telah menghantarkan kami dalam menyelessiken penelitian Hibah Pekerti tahun yong didonai oleh dana DP3M Dirjen Dikti tahun anggaran 2005/2006. Peelitian diimplementasiken bog! peningkatan ‘uelitas den kuantitas riset institusional di Laboratorium Biokimia - Jurusan Kimia, FMIPA - UNDIP Semarang, Delam pefaksammannya kami bekerjasama dengan Laboratorium KBK Asem Nubleat dan Geneuetika Moleloul, Dopariemen Kimia, F-MIPA —ITB. Kendatipun ada beberepa kendala dalam pelaksanawn penelitian, mamun pada okhirnya kami mampu menyelesaikan dengan baik sesuai dengan rencana kerja don jadwel yang telah disusun. Kami menyampaiken banyak terima kasih kepada kepada semua pihak yang telah memberikan bantuan maupua dukungan bagi terfoksanany® penelitian. Demnikian pula hatnya kepada pimpinan DP3M Dirjen Dikti, Lembaga Penefitian UNDIP, Fakultas MIPA, Departeman Kimia - ITB maupun Jurusan Kimia UNDP yang telch memfavititast terlaksanenya ponclitian Hibah Pekerti. Ketua Tim Peneliti viBABL PENDAHULUAN Akhirahir ini eksplorasi terhadap bekteri ekstremofilik banyak dilakukan oleh berbapai pihak karena mikroba in memiliki kerekter unik terutama beriaitan dongan sitet dan manfaat entim yang dikandungnya, Biokatalis jenis ini mampa memberi sumbangen beter baik untuk pengembangen ilmu daser maupun bideng industri, Salah satu sumber potensial enzim termostabil adalah hakteri tarmofilik yang berasal dati sumber air pans. Indonssia msrupaken negare tropis yang keya, akan sumber air panas, nermus eksplorasi torhudap bateri termofilik masih sangot terbatas, Dalam rangka mendapatian informesi mengenai komunites serta poton filogeni bakterl-bakter! temofilik dari sumber-sumber air panes Indonesia, dalam, penetition ini akan dilakuken analisis tochadap sumber-sumber yang ada di Jawa Tengah. Peneniuan pola komunitas dalteri dilakukan berdasarkan profil denamrasi gredien gel dan kontruksi pohion filogeni didasarkan atas uratan rukleotida gen 168 rRNA dari sampel bakteri. Sampel bakteri tomofili diekstraksi total DNA kromosomnya dan dipabai sebagai templat uatuc amplifikasi gen 16% rRNA dengan metode PCR secare parvial. Pola komunites bakteri ditenmkan dengan metode DGGE. Hasit amplifikas} lengkap akan Giffegmentasi pada gel DGGE bordasarkan perbedzan kandungan G-C pada masing-acasing untal DNA yang menentukan kecepaten denaturasi dari fragmen- fragmen yang bersangkutas, Frapmen yang diperoleh di re-PCR dan dieentukan ruta auklcotidanys, Hasil sckuonsing selmjunya dianelisis dengan cara dlibaadingkan dengan datebato GenBank Hasll yang diharapkan adalah diperolehaye informesi mengensi komonites dan phon filogeni bakteri termofilik ‘solat Joked, Hasil tersebut dihamapkan mempu memberikan sumbangan infonnasi ‘yang cukup luas dalam bidang bivdiversitas mikroba indonesia seita membuka pehaung bagi ckaplorasi onzims-onzim tormostabil berikutnys.‘Konteks Penelitian Enzim maupun protein temmostabil benyak dicksploresi dalam dasawarsa teralhit karera perannya yancy sangat Iuas dan penting bagi pengembangen ilmu dase maupua industri (Madigan et af, 1997). Kenyataan ini memicu berbagai pihak untuk melekukan eksplorasi terhadap berbagai organisme penghasil enzim termostabil. Salah sats suraber potoasial enzim tersebut adalah bakteri eemmofiik ‘yang fridup di sumber air pangs (Alves et af, 2003). Eksplorasi terhadep bakteri tormofilik secure unum dilakukan dengan cara menumbubkan bakteri tersebut pada motia sintotik, Nemun pada kenyatsaunya masih culeyp sulit menumbubkan bakteri pada medium sintetik karena seringkali media yang diberikna tidak sesutl cengars Komposisi medium alamian pestumbuhannya, Kondisi ini dipicn ofch sangat terbarasnya informasi mengenal kumusicas strain mikroba yang hidup pada sumber-sumber alam tersebut, Indonesia merupakan negara tropis yang kirya akan suber ait panas termasuk diantaranya sumber-sumber yang ¢erdapat di wilayab Jowa Tengah, name eksplorasi techadep bakteri-bekteri termofilik maupun enzim tenmostabiinya mast sangat terbatas, Metode analisis yang copet dalam rangka inendapatkan informasi biodiversitas atau komunites mikroda yang sangat kompleks merupakan tujuan peating ekologi miioba (Dunbar ef af, 2000), Lebih jauh Dunbar menyampaies: bahwa ‘keragamnan Komunites dapat ditentukan dalam beberapa tahep analisis. Metode analisis yang paling efektif sat ini didasarkan atas profil fragmen dan urutan tmrddeotida dasi gen pengkede sub unit ribosom 168 tRNA (melalui metode PCR dan kadangkaln diduti olch metode pemotongan dengan euzim resirksl tethadap campuran fragmen tesi! amplifikasi) dalam rangka mengidentifikas’ perbedaan Komposisl fragmen DNA dari komomitas terselit. Peadekatan torbarn mampu menggatnbarkan perbedaan tidak hanya daiem komposisi kemunites nam juga momps delom Jumpulan Komunites dengan mengukur jumleh dan relasive abuncemee deci spesies plylotypes. Analisis langsung terhadap klon goa 16S FRNA telah banyak dilaporkan (Sekiguchi et af, 2002; Rheims ¢# af, 1999; Fuchs <1 al, 1996; Trevisanato et ai, 1996, Lane ef af, 1985). Amplifikasi terhadap gen- gen 165 FRNA baktert mampu memberikan informasi yang sangat komprehensif, nant andlisis langsong terhadap Kion-klon gen 165 x2NA merupakan metodeyang ruahal dea tidak efision Salah satu metode yang cukup efisien adalah cengon terlebih dahulu melakukan penentuan distribusi populesi bakteri kemndian analisig uratan nukleotida gen 16S RNA, metode yang banyak dileporkan adalah menggunaken PCR-DGGE ysity amplifikasi sebagian gen 168 rRNA dan dilanjutkan dengan elektroforesis gel gradiett dengan menambahkan denaturant (Lapara ef af, 2000; Fertis ef al, 1997; Ferris ot al, 1996; Muyzer ef al, 1993), Metode Jain adalech amplifikasi gen lengkap 16S FRNA, dilanjutkan dengan ‘Kloming setta analisis fragmen cestriksi (erminal (T-RFLP / TRF) (Dunbar ef al, 2000; Liu ef ai, 1997). Pendekatan Isolasi bakteri-baktoni termofiik ditakukan inelahut metode filirasi euenggunaken ‘embran dengan pori sungat Kecil schingga tidak mampu dilewati oleh bakteri. Dengan carn ini Konmunitas lengkep bakteri baik yang bersifat dontinan maupan tidak dominan dasi svaty sumber difarapkan terjebak di membmn. Metode amalisis komunitas bakseri yung dilakukan dala peaclitian ini adaleh anptifikasi sebagian gen 16S rRNA dengan tnetods PCR (Polymerase Chain Reaction) yang dilanjutkan dengan metode DGGE (Denoturing Gradtent Gel Electrophoresis). Dimace komutitas bakteri dianalisis dengan terlebin dui melakuksn pérbunyeken gon parsial 16S rRNA dani mesingsmesing spesies, Distribusi populesi dekteri akan dienalisis kemudian bentasarken profil fragmantest amplikon (has{) PCR) dengan metode DGGE sorta penentuan urulan mukteorida masingsmasing frigmen. Fokus dari penelitian tahun pertama ini sdaleh mendopatkan komunitas bakteri dalam jtrolah exkup dan baik, dan mendapatican amuplikod gen 168 PRNA daci masing-nusing komunitas baxter.