Protocolo 2.

Cuantificacin da actividade fosfatasa cida nun

extracto de fgado
1. Preparar unha batera de 4 tubos, e engadir os reactivos na orde e volume que
segue:

Tubo Blank B1 1 B2 2 B3 3

pNFP (S, mL) ---- 1 ---- 1 ---- 1

Tampn (mL) 1,975 0,975 1,95 0,95 1,9 0,9

Extracto heptico (E, mL) 0,025 0,025 0,05 0,05 0,1 0,1

2. Axitar suavemente os tubos e incubar as mesturas de reaccin durante 10 min a

30 C nun bao termostatizado (condicins ptimas de T y pH). Nota: Se toma como
inicio da reaccin o momento en que se engade a enzima (E, extracto de fgado).

3. Ao cabo dos 10 min parar a reaccin engadindo 5 mL de NaOH 0,2 N (inactiva a

enzima e alcaliniza o medio para que apareza a cor amarela dende o produto
formado (pNF)).

4. Ler as absorbancias a 420 nm no espectrofotmetro, axustando a absorbancia a 0

cos brancos (tubos Blank 1,2 e 3).

5. Recoller os datos de absorbancia para os tubos 1, 2 e 3, e coa axuda da recta

patrn obtida anteriormente calclanse os mol de pNF (P) formados en cada tubo.

Tubo Absorbancia (420 nm ) Cantidade pNF (mol)

3
Resultado

1. Calcular a Actividade enzimtica da fosfatasa cida (FAC) presente no extracto

de fgado, expresada en UI. Tase en conta que os valores de actividade
enzimtica non foron obtidos a partires do mesmo volume de extracto.
2. Facer a media dos tres valores obtidos sempre que non haxa mis dun 20% de
desviacin estndar en algn de eles. Pdese descartar un, pero se os tres saen
distintos, hai que repetir.

3. Calcular a Actividade especfica, expresada en UI / mg de protena total do

extracto (medida na prctica 3) (Nota: esta non a verdadeira Actividade
especfica, que se refire aos mg da protena purificada, neste caso a FAC).