Odreivanje koncentracije proteina kolorimetrijskom metodom

Metoda po Bradford-ovoj (1976)

Pribor i reagensi:
BSA standard (albumin iz goveeg seruma,
eng. Bovine Serum Albumin)
rukavice
mikroploice
pipete
CBB reagens (Coomasie Brilliant Blue)

Naruavanjem normalne ravnotee organizma vanjskim utjecajima dolazi do niza

promjena, koje se mogu pratiti na razini populacije, tkiva ili stanice. Promjene na staninoj
razini utjeu na sintezu ili funkciju proteina, zbog njihove uloge u odvijanju ivotnih procesa.
Time odreivanje ukupnog sadraja staninih proteina predstavlja rani biopokazatelj
antropogenih ili drugih utjecaja na indikatorski organizam u stanitu u kome ivi. Jedna
od metoda za kvantitativno odreivanje staninih proteina je kolorimetrijska metoda po
Bradford-ovoj. Metoda se temelji na obojenju otopljenih proteina s reagensom Coomasie
Brilliant Blue G-250 (CBB) pri emu dolazi do vezanja anionske boje za NH3 skupine
proteina, to je praeno promjenom boje reagensa (smea u plavu) i pojavom apsorpcijskog
maksimuma kod 595 nm. Koncentracije proteina se odreuju u staninom citosolu.

Stanice su osnovne graevne jedinice tkiva koja tvore razliite organe i organske
sustave. Osnovni dijelovi eukariotske stanice koji se mogu uoiti svjetlosnim mikroskopom su
jezgra i citosol. Unutar jezgre je smjeten cjelokupni genetiki materijal stanice, a u citosolu
se nalaze svi organeli bitni za ivot stanice (mitohondriji, ribosomi, endoplazmatska mreica,
Golgijevo tijelo, lizosomi). Citosol ili citoplazma je osnovna supstanca koja ispunjava stanice.
Sainjava je 80% vode i obino je prozirna. U citosolu se nalaze i proteini (ukljuujui
enzime), vitamini, ioni, nukleinske kiseline i nukleoidi, aminokiseline, eeri,
ugljikohidrati, masne kiseline, itd.


Tonost mjerenja ovisi o nizu postupaka kojima je svrha ouvati nativnu strukturu proteina.

Tkivo (1 g)

100 mM Tris HCl/Base + 1 mM DTT; pH=8,1 (4C)

peterostruko vei volumen od mase tkiva (5 ml)

homogeniziranje
homogenat

centrifugiranje
50000xg, 120 minuta, 4C
talog SUPERNATANT (S50)

Odreivanje ukupnih citosolskih proteina metodom po Bradford-ovoj

Shematski prikaz obrade tkiva u svrhu odvajanja citosolske frakcije i odreivanja ukupnih
proteina

Na temelju linearne ovisnosti apsorbancije o sadraju proteina, kvantitativno se

odreuje koncentracija proteina. Nepoznate koncentracije proteina u uzorcima staninog
citosola se oitavaju iz kalibracijskog pravca nainjenog nizom razrjeenja otopine
albumina goveeg seruma (BSA) i izraavaju kao mg proteina u ml citosola.

y = 0,1409x + 0,0008
R2 = 0,9475
0,30
Apsorbancija pri 595 nm

0,25 Oitana
apsorbancija na
0,20 fotometru (0,155)
0,15
0,10 Koncentracija proteina u uzorku
(1,094 mg ml-1 ) odreena iz
0,05 kalibracijskog pravca
0,00
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 1,75 2,00
Koncentracije albumina goveeg seruma/ mg ml-1