Universidad de Concepcin

FACULTAD DE MEDICINA
CARRERA DE TECNOLOGIA MEDICA

Histoqumica de cidos
Nucleicos

T.M. Andrea Dibarrart Vera

2008
DISTRIBUCIN DE LOS AN
ARN
Surcos y Fuerzas
de estabilizacin
en el ADN.
 ESTABILIZACIN DE CIDOS
NUCLEICOS.
Nucleoprotenas se estabilizan bien; como la mayora de las
protenas. Poseen alto peso molecular (insolubilizacin).
cidos Nucleicos unidos a protenas (ADN y ARN unido a
poliribosomas) se conservan, no as los AN libres (ARNm,
ARNt)
Si el mtodo de tincin requiere de una hidrlisis previa, NO
SE DEBE UTILIZAR FIJADORES ACIDOS.
Si vamos a identificar ARNr hay que tratar de no destruir
membranas (evitar fijadores a base de solventes orgnicos) y
de eleccin, clulas con alta sntesis de protenas.
CH3COOH, buen precipitador de nucleoprotenas.
HISTOQUIMICA DE
ACIDOS NUCLEICOS
Base Nitrogenada
Pentosa

Radical Fosfato
 HQ DE AN: IDENTIFICACION
POR BASE NITROGENADA
ABSORCIN EN EL ULTRAVIOLETA DE BASES
NITROGENADAS.
El no apilamiento de bases, producto de la
desnaturalizacin determina que stas absorvan radiacin
UV. Los AN presentan una mayor absorcin de luz UV a 254-
260 nm debido a la interaccin entre la luz UV y los sistemas de
anillos de las purinas y pirimidinas. Cualquier molcula que
contenga bases nitrogenadas (nuclesidos; nucletidos y
polinucletidos) pueden analizarse utilizando luz UV.
Importancia: Localizacin; separacin y caracterizacin de AN
(aislamiento luego de separarlos por electroforesis, por ejemplo).
 HQ DE AN: IDENTIFICACION
POR SU PENTOSA

Reaccin de Feulgen
Hidrlisis cida dbil que puede ser realizada a
60C (HCl 1M) T A. (HCl 5 M).
La hidrlisis es capaz de provocar la formacin
de grupos aldehdos que
Son detectados con el reactivo de Schiff.
 REACCIN DE FEULGEN
La hidrlisis cida rompe aquellos enlaces de hidrgeno
que une a la doble hlice (desnaturalizacin), lo que
provoca la liberacin de bases pricas (A y G) con la
formacin de un cido apurnico y la generacin de
grupos CHOs en el C1 de la pentosa, donde se
hallaba la base nitrogenada.

=
Mtodo de Feulgen
consiste en una
depurinizacin por
hidrlisis cida del
ADN, y la posterior
utilizacin del
reactivo de Schiff
(leucobase).
 Para obtener el mayor nmero de grupos CHO reactivos, debemos
realizar una hidrlisis que libere la mayor cantidad de bases
pricas, sin producir despolimerizacin del ADN, ni romper las
uniones tipo ster con los fosfatos en los C3 y C5.

Variables a considerar:
HIDROLISIS ACIDA DEL ADN
Tiempo de hidrlisis;
pH

Cromatina Cromatina
Temperatura
Laxa Compacta
Fijador
Grado de compactacin
Sin Depolimerizar de la cromatina.

5 10 15 20 25 30 35
TIEMPO (HCl 1N/60C)
 Reactivos Seudo-Schiff
Distintos colorantes y fluorocromos que en presencia de
H2SO3 tambin se decoloran como lo hace la
pararosanilina, los que en presencia de grupos CHO del
tejido forman compuestos coloreados.
Son colorantes bsicos que presentan a lo menos un amino
primario y no presentan grupos cidos.
Estos compuestos son altamente sensibles y se pueden
cuantificar.
Los colorantes fluorescentes (fluorocromos) saturados con
SO3 emiten una fluorescencia particular en presencia de
grupos CHO
Ejps: Acridina; Acriflavina; Auramina 0.
FEULGEN
 HQ DE AN: IDENTIFICACION
DEL RADICAL FOSFATO

Utilizacin de colorantes bsicos a pH cido

Pironina Y ; PM= 302.812

C.I. 45005

Verde de Metilo; PM= 458.488

C.I. 42585
VERDE DE METILO/PIRONINA Y
Selectividad en la Tincin
1.- El Verde de Metilo sera ms catinico y, por lo tanto
presentara una > afinidad por molculas ms polimerizadas
(ADN).
La Pironina tiene afinidad por molculas menos
polimerizadas (ARN).
2.- Basado en un fundamento Estereomtrico: disposicin de
la molcula en el espacio. Existira un alineamiento espacial
de los grupos aminos (+) del colorante a los radicales
fosfato(-) en la doble hlice de ADN.
Nota: Si cambio el pH de la solucin, cambia la afinidad diferencial.
El pH en que hay selectividad se encuentra entre 4-5. Por otro lado, la
[ ] de ambos colorantes en solucin es crtica: ambos compiten.
VERDE DE METILO/PIRONINA Y
 GALOCIANINA
CROMOALUMBRE

El carcter de la Galocianina no es ni bsico ni

cido.
Al asociarse al Alumbre de Cromo forma una
LACA CATIONICA.
Este mtodo trabaja a pH = 1,5-1,75.
La Galocianina Cromo-alumbre dura slo 4
semanas. Conservar a 4C; frasco oscuro.
Color en los tejidos: Azul-pizarra.
 A pH bajo (<1,5), la Galocianina cromoalumbre reacciona
casi especficamente con AN . Aparentemente a pH bajo los
grupos fosfricos en el tejido permanecen disociados y
pueden formar una sal con la laca de cromo.

Oxazina anfotrica.
Galocianina-Cr-Al
MTODOS DE EXTRACCIN DE
CIDOS NUCLEICOS
1.- ENZIMTICA: RNasa y DNasa.
2.- QUMICA: ATC (4%/90C/15 min: ARN y
ADN) ; HClO3 (10%/4C toda la noche: - ARN;
5%/60C/30 min : ARN y ADN); HCl 1 M
/60C: -ARN en tiempo ptimo.Econmica pero
variable.
Nota: La extraccin de ARN con cido perclrico tambin extrae
bases pricas y pirimdicas del ADN, el que puede ser detectado
con el reactivo de Schiff.
FLUOROCROMOS
Internalares
No intercalares

Mixtos
 IDENTIFICACIN DE ADN POR
MEDIO DE FLUOROCROMOS.
Los fluorocromos que se utilizan para el
estudio de ADN son generalmente
catinicos, con anillos aromticos y
planares.
Al unirse al ADN pueden actuar como:
A.- INTERCALARES: Fenantrinas y
Acridinas
B.- NO INTERCALARES (Minor-
Groove binders) Indoles e
Imidazoles
C. MIXTOS: Derivados de las Cianinas
DAPI
 INTERCALARES
Fenantrinas y Acridinas

Forman complejos estables con el ADN:

ANARANJADO DE ACRIDINA. Presenta
a lo menos un grupo polar (atraccin Acridine Orange
electrosttica) y adems se intercala entre las
bases . Se unen al polianin por atraccin
electrosttica.
QUINACRINA (regiones A-T, brillantes y
G_C, oscuras). Ethidium Bromide
BROMURO DE ETIDIO
PROPIDIUM YODADO (PI): No
presentan selectividad por pb y su unin es
estequiomtrica (1: 4-5 pb).
Propidium Iodide
 NO INTERCALARES
Indoles e Imidazoles
Va dominios hidrfobos. Se unen externamente y no se
intercalan:
DAPI (A-T selectivo)
Hoechst 33342 (A-T);
Actinomicina O (G-C); Hoechst 33342

DAPI

SURCO MENOR
 MIXTO
Derivados de las Cianinas

Se pueden unir externamente al ADN (alta

proporcin colorante:pb) y por
intercalacin (baja relacin colorante:pb)
Son extremadamente sensibles y presentan
una fluorescencia ms estable (alto costo).
Fluorescen slo cuando se unen al ADN.
Ejm: TOTO-1; YOYO-1
TOTO-1
 HIBRIDACIN DE ADN y ARN
Desnaturalizacin del ADN blanco:
Hibridizacin de los AN en presencia de una sonda
marcada
Marcadores:
1.- Radioactivos (isotopicos): 3H; 125I; 35S.
2.- No radioactivos (no isotopicos): digoxigenina, biotina,
fluorescencia
Hibridacin In Situ:
Cromognica (CISH)
Fluorescente (FISH)
 ESTUDIO DE APOPTOSIS
Tincin nuclear simple
I.S.E.L. (IN SITU END LABELLING )
1.- TUNEL
2.- In Situ Nick Traslation
I.S.O.L.
Anexina V
IHQ (Bax, Caspasas, Fas)
 TUNEL
Terminal Uridine Nick End Labelling

Enzima: La Tranferasa
terminal (tdT)
Sustrato: Deoxiuridina
trifosfato marcado
(dUTP)+ Co+2.
In Situ Nick Traslation Se
diferencia del TUNEL en
la enzima: Polimerasa I
 ISOL
In situ Oligo Ligation

Enzima: Ligasa
 ANEXINA V
La anexina-V es una protena que se une
especficamente al fosfolpido: fosfatidilserina, el cual se
encuentra en la cara interna de la membrana plasmtica
y es expuesto en la cara externa de dicha membrana
cuando comienza el proceso de apoptosis.
Para la unin de la protena con el fosfolpido es
requerida la presencia de calcio, por lo que ser
necesario la preparacin de un binding buffer donde se
mantendr la suspensin celular
ESTUDIOS DE PROLIFERACION
MTODOS MORFOLGICOS (figuras
mitticas, utilizacin de precursores del ADN
marcados)
MTODOS INMUNOLGICOS (Ki-67,
PCNA, alfa-DNA polimerasa, etc)
ESTUDIO DEL CONTENIDO DE
ADN
CITOMETRIA DENSITOMTRICA: Esttica y de
Imagen
CITOMETRIA DE FLUJO