KEMIJSKO-TEHNOLOKI FAKULTET U SPLITU

Zavod za organsku tehnologiju

Skripta za internu upotrebu

VJEBE IZ BIOTEHNOLOKIH PROCESA

Dr.sc. Branka Andrii, izv.prof.

Split, 2006.
SADRAJ

Vjeba 1. PROCES FERMENTACIJE KVASACA SOJA Saccharomyces........... 4

Vjeba 2. IMOBILIZACIJA STANICA PEKARSKOG KVASCA NA
ALGINATU. 8
Vjeba 3. PRIPRAVA SIRA... 12
Vjeba 4. EKSTRAKCIJA DEOKSIRIBONUKLEINSKE KISELINE IZ
PLODOVA BILJAKA (kivi, graak, enjak) 15
Vjeba 5. SINTEZA BIODIZELA TRANSESTERIFIKACIJOM OTPADNOG
JESTIVOG ULJA 18
6. METODE ODREIVANJA FIZIKALNO-KEMIJSKIH
KARAKTERISTIKA SIROVINA I GOTOVIH PROIZVODA 22
6.1. ODREIVANJE GUSTOE... 22
6.2. ODREIVANJE KISELINSKOG BROJA.. 22
6.3. ODREIVANJE PEROKSIDNOG BROJA 22
6.4. ODREIVANJE KINEMATIKE VISKOZNOSTI.. 23
6.5. ODREIVANJE PLAMITA.. 25
 I. PRIPREMA ZA VJEBE U LABORATORIJU

Detaljno proitati tekst vjebe prije ulaska u laboratorij.

Ukoliko imate neka pitanja uvezi vjebe, zapiite ih i pitajte voditelja vjebi.
Jednostavno pitanje moe znatno skratiti vrijeme potrebno za izvoenje vjebi.

Sve podatke zapisujte u biljenicu. Ne koristite listove papira ili razliite

blokove jer se papiri lako zagube.

Napravite potrebne tablice i eventualno proraune za potrebne kemikalije kako

bi prije zapoeli vjebe.

Operite laboratorijsko posue na kraju vjebi tako da je spremno za druge

vjebe. Mnogi studenti nepotrebno troe vrijeme na pranje i suenje posua
koje e im sluiti samo da prokuhaju vodu. RAZMILJAJTE!

Mnogi studenti se toliko ure zavriti vjebu da zaborave zabiljeiti vana

zapaanja kao to su: vrijeme kad se neto dogodilo, promjenu boje,
endotermnu ili egzotermnu promjenu, promjenu agregatnog stanja, vrelite,
talite, temperaturu u laboratoriju, itd.

Pogledajte rezultate! Izgledaju li logino za izvedenu vjebu? Ako sumnjate,

ponovite dio vjebe. Najbolje se ui na vlastitim grekama. Ako i tada niste
sigurni, pitajte voditelja vjebi ili laboranta.

Kad voditelj vjebi razgovara s drugim studentima, sluajte i vi, moda ete
uti neto to vam moe pomoi.

Vano je znati to se smije, a to ne smije, iz sigurnosnih razloga, raditi u

laboratoriju; ne samo zbog vae osobne sigurnosti, ve i zbog sigurnosti vaih
kolega.

1
 II. SAVJETI I MJERE OPREZA PRI RADU U LABORATORIJU

Koristiti zatitne naoale.

Obavezno je nositi zatitnu odjeu (bijeli mantil) radi zatite ostale odjee od
kemikalija.

Dugu kosu treba zavezati kako ne bi dola u dodir s kemikalijama ili

plamenom.

U laboratoriju je zabranjeno jesti, piti i puiti.

Nikad ne raditi u laboratoriju bez nadzora ili znanja laboranta ili voditelja
vjebi.

Doite u laboratorij pripremljeni. Ako ne znate to treba raditi, pitajte

voditelja vjebi ili laboranta.

Otvoreni plamen moe se upaliti samo kad nema zapaljivih otapala u blizini
(to u laboratoriju organske tehnologije znai skoro nikada).

Treba biti vrlo paljiv pri rukovanju zapaljivim otapalima poput etera, acetona
ili metanola. Nikad ne isparavati ova otapala iznad kuhala i sl. Koristiti
zatvoreni sustav za isparavanje.

Nikad ne pipetirajte ustima. Postoji propipeta. Izbjegavajte udisanje

kemikalija i ne miriite kemikalije.

Zapamtite, VRUE posue izgleda kao i HLADNO. Pazite to uzimate u

ruke.

Uvijek oznaite reagense u tikvicama, aama i sl. Veina organskih

kapljevina, vodene otopine kiselina i luina prozirne su i bezbojne poput vode.

Organske kapljevine najbolje je mjeriti volumenom. Pomou laboratorijskih

prirunika s podatcima o gustoi lako im je odrediti masu.

Neke sintetike tkanine mogu se otetiti djelovanjem npr. acetona ili etil-
acetata. ak i razrijeena sumporna kiselina oteti pamune tkanine. Nemojte
nositi svoju najbolju odjeu dok radite vjebe.

U hladilu hladna voda ulazi na dnu, a izlazi na vrhu. Ne pretjerujte s

otvaranjem vode. Uvijek provjerite tee li voda prije nego ukljuite grijanje.

Pri destilaciji nikad ne isparavajte do suha. Ostatak moe postati nestabilan i

eksplodirati (pogotovo ako ste radili s eterom ili alkoholom koji stvaraju
organske perokside).

2
 Kad provodite ekstrakciju sauvajte oba sloja dok niste potpuno sigurni koji
treba ostaviti, a koji odbaciti.

Nikad ne ostavljajte reakciju ili proces bez nadzora. Ukoliko morate izii,
zamolite kolegu da pripazi.

Mnoge organske kemikalije ne mijeaju se s vodom. Ne izlijevajte organske

kemikalije u sudoper i druge odvode. Za to postoje posebne boce na kojima
pie OTPAD.

3
Vjeba 1.

PROCES FERMENTACIJE KVASACA SOJA Saccharomyces cerevisiae

Svrha vjebe: Prepoznavanje faza u razvoju kvasca. Praenje kinetike rasta

stanica kvasca. Odreivanje optimalne koliine supstrata.

UVOD
Kvasci soja Saccharomyces (pekarski i pivski kvasac) su jednostanini organizmi
(gljivice) koji anaerobnom fermentacijom, tj. metabolizmom uz nedostatak kisika,
vre enzimsku konverziju glukoze u alkohol i ugljini dioksid. Za njihov rast i
razmnoavanje neophodan je supstrat bogat glukozom, vlagom i aminokiselinama. U
prirodi se uobiajeno nalaze na razliitom liu i plodovima biljaka. Vee koliine
kvasaca, za industrijsku primjenu, prireuju se kultiviranjem na odgovarajuim
hranljivim podlogama. Kvasci se razmnoavaju pupanjem ili dijeljenjem stanica. Rast
kvasaca na nekom supstratu odvija se u nekoliko faza, slika 1.1.

3 4
5
Broj stanica kvasca

Vrijeme, t

Slika 1.1. Faze u razvoju kvasaca: 1. faza prilagodbe, 2. eksponencijalna faza,

3. post-log faza, 4. stacionarna faza, 5. faza ugibanja.

U eksponencijalnoj fazi, u svakom trenutku od jedne nastaju dvije stanice kvasca, tj.
ako se pone s jednom stanicom, u sljedeem trenutku bit e 2, zatim 4, pa 8 itd., to
znai da broj stanica (X) raste eksponencijalno s vremenom (t).

4
Matematiki, to se moe opisati:
dX/dt X (1)
Poveanjem broja stanica poveava i njihov ukupan volumen te se tada broj stanica,
X, moe supstituirati volumenom stanica, V. Ako se znak proporcionalnosti iz prve
jednadbe zamijeni konstantom () dobije se :

dV/dt = V (2)
gdje oznaava specifinu brzinu rasta i predstavlja brzinu kojom se pojedinane
stanice dijele.
Pretpostavi li se da je konstantna te se integrira izraz (2) u vremenu izmeu t0 i t1
kada je volumen stanica V0 i V1 dobije se :

V1 1 t
1
V V dV = t dt (3)
0 0

odnosno:
ln V1 - ln V0 = (t1 t0) (4)

Crtanjem ovisnosti ln V nasuprot vremenu t u eksponencijalnoj fazi rasta kvasca

dobije se pravac iji nagib, prema jednadbi (4), odgovara specifinoj brzini rasta ,
slika 1.2.

=nagib= [(lnV2-lnV1)/(t2-t1)]
ln V

t2, lnV2

t1, lnV1

Vrijeme, t

Slika 1.2. Grafiko odreivanje specifine brzine rasta

5
Ako se specifina brzina rasta odreuje za razliite koncentracije supstrata, [S], dobije
se u veini sluajeva Langmuirov tip grafa, slika 1.3. (Postoje i sluajevi kada zbog
inhibicije rasta supstratom doe do opadanja specifine brzine rasta s porastom
koncentracije supstrata.) Koncentracija supstrata pri kojoj je specifina brzina rasta
jednaka polovici svoje maksimalne vrijednosti naziva se konstanta zasienja, Ks.

max

max/2

Ks [S]

Slika 1.3. Ovisnosti specifine brzine rasta stanica

o koncentraciji supstrata

Matematiki izraz za ovisnost specifine brzine rasta stanica o koncentraciji supstrata

izveo je Jacques Monod i glasi:

= maxS / (Ks+ S) (5)

Rast stanica pekarskog kvasca lako je pratiti. Ukupna promjena volumena je rezultat
poveanje broja stanica kvasca, ali i nastajanja ugljinog dioksida. Ipak, praenjem
rasta kvasaca na prethodno opisani nain mogue je dobiti uvid u faze razvoja kvasca
te odrediti specifinu brzinu rasta

EKSPERIMENTALNI DIO

Potrebni pribor i materijal:

- odmjerne tikvice - pekarski kvasac, suhi ili svjei
- menzure - eer (glukoza ili saharoza)
- zaporna ura - brano

6
Postupak
U odmjernim tikvicama od 100 cm3 napraviti 2, 4, 5, 6, 8 i 10 %-tne otopine eera
(saharoze ili glukoze) u vodi (w/v). U menzuru od 100 ml uliti 20 cm3 otopine eera,
dodati 3,6 g svjeeg kvasca te paljivo promijeati. Moe se dodati i 2g brana jer je
tada promjene lake pratiti. Zabiljeiti poetni volumen i temperaturu u prostoriji.
Svake 2 minute oitavati volumen. Mjerenje je zavreno kada volumen pone opadati.
Isti postupak ponoviti za preostale koncentracije supstrata.
Prvi korak u obradi podataka je za svaku koncentraciju posebno nacrtati krivulju
rasta kvasca, tj. ovisnost V nasuprot vremenu t, gdje je V = Vt - V0. Procijeni se
eksponencijalna faza rasta te se za tu fazu nacrta ovisnost lnV nasuprot t (najmanje 5
toaka). Nagib najvjerojatnijeg pravca koji prolazi kroz dobivene toke predstavlja
specifinu brzinu rasta, (mi), za zadanu koncentraciju eera. Kada se na prethodno
opisani nain odrede specifine brzine rasta za sve koncentracije supstrata [S], nacrta
se ovisnost nasuprot [S]. Iz tako dobivenog grafa odredi se maksimalna brzina rasta
i Ks.

Zadatak
1. Nacrtati krivulju rasta kvasca u otopinama eera mjerenjem promjene
volumena s vremenom.
2. Iz eksponencijalne faze rasta, crtanjem ovisnosti log V vs. t, odrediti
specifinu brzinu rasta za svaku koncentraciju supstrata.
3. Iz ovisnosti specifine brzine rasta o koncentraciji supstrata odrediti
maksimalnu brzinu rasta te konstantu zasienja.
4. Grafove crtati u Excel-u.

LITERATURA

1. W. Marison u: Biotechnology for Engineers; Biological Systems in

Technological Processes, Ed. A.H. Scragg, Ellis Horwood Ltd. Chichester,
1988, str. 184-194
2. http://www.np.edu.sg/~dept-
bio/biochemical_engineering/fermentation_tutorial
3. www.le.ac.uk/by/teach/biochem

7
Vjeba br. 2.
IMOBILIZACIJA STANICA PEKARSKOG KVASCA NA ALGINATU

Svrha vjebe: Imobilizacija stanica kvasca. Usporedba efikasnosti imobiliziranih

i neimobiliziranih stanica.

Uvod
Imobilizacija enzima definira se kao fizikalno ili kemijsko vezivanje ili
lokalizacija enzima na odreenom nosau uz zadravanje katalitikih svojstava
enzima i mogunosti ponovne i kontinuirane uporabe. U nekim sluajevima nije
potrebno proiavanje enzima. Meutim, ponekad je povoljnija imobilizacija stanica
jer stanice predstavljaju multienzimski sustav. Primjena imobiliziranih biokatalizatora
(enzima ili pak itavih stanica) u biotehnolokim procesima provodi se u svrhu:
1. dobivanja spojeva stereospecifinim reakcijama
2. proizvodnje energije biolokim reakcijama
3. selektivnog djelovanja na oneienja u svrhu rjeavanja problema u okoliu
4. analize razliitih spojeva s visokom osjetljivou i specifinou
5. proizvodnje novih lijekova, umjetnih organa itd.

Enzimi se mogu imobilizirati na vie naina, a stanice se imobiliziraju na etiri

osnovna naina i to: 1. adsorpcijom na nosa 2. zarobljavanjem u polimernoj matrici,
3. umetanjem (kapsuliranjem), 4. kombinacijom navedenih metoda.

Kao polimerna matrica esto se koriste razliiti polisaharidi: alginati, karagenani,

agar, agaroza
Alginska kiselina je polisaharid koji se dobiva ekstrakcijom iz morskih algi u obliku
svojih soli - alginata, a kao rezultat postojanja vie slobodnih karboksilnih skupina u
makromolekulama alginske kiseline (slika 2.1). Soli jednovalentnih metala (npr. Na)
su topljive u vodi. Takve soli slue u prehrambenoj industriji za podeavanje
viskoznosti razliitih proizvoda.
Zamjenom Na+ iona s dvovalentnim ionima poput Ca2+ dolazi do stvaranja
koordinativnih kompleksa koji su netopljivi u vodi. Upravo ovo svojstvo alginata
rabi se za imobilizaciju enzima ili stanica. Kvasci imaju iroku primjenu u industriji,
pa njihova imobilizacija ini procese u kojima su neophodni ekonominijim.

8
 Slika 2.1. Kemijska struktura ponavljajue jedinice u makromolekuli alginata

EKSPERIMENTALNI DIO

Potreban pribor: Materijal:

- Erlenmayerove tikvice od 250 cm3 - Na - alginat (E 401)
- magnetska mijealica - pekarski kvasac
- bireta - 0,1 M otopina CaCl2
- ae - supstrat za fermentaciju, pH=4,5:
- vrenjae 1. glukoza 80 g/dm3
2. (NH4)2SO4 4 g/dm3
3. MgSO4 x 7H2O 1g/dm3
4. KH2PO4 2g/dm3
- metilensko crvenilo (indikator)

Postupak

1. Imobilizacija stanica kvasca

U izvaganu au uliti 100 cm3 destilirane vode, zagrijane na 60C i otopiti 1,5 g Na-
alginata uz stalno mijeanje. Kad se alginat sasvim otopi, ohladiti na 30-40C i dodati
3,75 g suhog pekarskog kvasca i mijeati dok se kvasac ne suspendira u otopini
alginata. Izvagati au sa suspenzijom. Suspenziju kvasca uliti u izvagani lijevak za
dokapavanje i s visine od oko 15 cm dokapavati u au s 200 cm3 0,1 M otopine
CaCl2 uz lagano mijeanje pomou magnetske mijealice, slika 2.2. Dokapavanjem u
otopinu kalcijeva klorida nastaju kuglice koje sadre stanice kvasca zarobljene u
alginatnom gelu. (Potrebno je izvagati au i lijevak za dokapavanje nakon to je iz

9
njih ispranjen sadraj da se utvrdi masa udio suspenzije koji je ostao na stijenkama.
Izraunati koliko je stvarno kvasca zarobljeno u alginatnom gelu). Nakon 15 minuta
kapljevinu dekantirati i kuglice isprati svjeom otopinom CaCl2 da se kompletira
proces nastajanja kompleksa, a zatim isprati 4 puta s destiliranom vodom da se ukloni
viak Ca2+. Kuglice prenijeti na filter papir da se osue. Nastale kuglice ovrsnu u
vremenu 12 sata.

Slika 2.2. Imobilizacija kvasca u alginatnom gelu

2. Fermentacija glukoze
U dvije Erlenmeyerove tikvice uliti po 100 cm3 supstrata za fermentaciju. U jednu
tikvicu staviti kuglice imobiliziranih stanica kvasca, a u drugu masu kvasca jednaku
prethodno izraunatoj masi kvasca zarobljenog u alginatnom gelu. Obje tikvice sa
sadrajem izvagati i zabiljeiti masu (m0). Na otvor svake tikvice staviti vrenjau.
Vrenjaa je konstruirana tako da omoguava izlaz CO2, a sprjeava ulaz O2. U
vrenjau se do oznake ulije voda i stavi par kapi indikatora metilenskog crvenila,
kojem se mijenja boja zbog nastajanja CO2, slika 2.3. Promjenu mase biljeiti svakih
pola sata (mt) za vrijeme trajanja vjebe, a zatim jo nakon 24 i 48 sati. Razlika u masi
jednaka je masi nastalog CO2, a koliina etanola nastalog fermentacijom ekvivalentna
je koliini nastalog CO2, prema reakciji:
C6H12O6 (glukoza) 2 C2H5OH (etanol) + 2 CO2

10
Iskoritenje se rauna na sljedei nain:
Masa glukoze = 8 g ( 100 cm3 otopine koja sadri 80 g/dm3 glukoze)
Stehiometrijska masa etanola: (ms) = (8/Mgl) x 2 mola x MEtOH
= (8 /180) x 2 x 48 = 4,09 g
Eksperimentalno dobivena masa etanola: me =[(m1 - m0) / MCO2] x MEtOH
Iskoritenje: = (me / ms) x 100

Slika 2.3. Fermentacija s imobiliziranim kvascem

Zadatak
1. Imobilizirati stanice kvasca pomou alginata. Odrediti ukupnu masu i priblian
broj dobivenih kuglica.
2. Dobivene imobilizirane stanice upotrijebiti za fermentaciju glukoze.
3. Usporediti prinos na etanolu uporabom imobiliziranih i neimobiliziranih stanica
kvasca.
4. Navesti neke prednosti i nedostatke koje ste uoili pri radu s imobiliziranim
odnosno neimobiliziranim stanicama kvasca.

LITERATURA

1. A. H. Scragg, Biotechnology for Engineers; Biological Systems in

Technological Processes, Ellis Horwood Ltd. Chichester, 1988, str. 235-252
2. D. L. Vullo, M. B. Wachsman, J. Food Sci. Edu. 4 (2005) 53-55

11
Vjeba 3.

PRIPRAVA SIRA

Svrha vjebe: Razumijevanje procesa koagulacije kazeina i njegova praktina

primjena

Uvod
Mlijeko se sastoji od 66-89 % vode i 11-14 % suhe tvari. Suha tvar sadri 4,6-4,9%
laktoze, 2,6-4,2% proteina (kazeini i albumini), a ostatak ine masti, mineralne tvari,
vitamini i elementi u tragovima.
U prisustvu bakterija mlijeno-kiselog vrenja (Streptoccocus, Lactoccocus,
Lactobacillus) odvija se proces kiselo-mlijene fermentacije kojim se mlijeni eer,
laktoza, transformira u mlijenu kiselinu. Taj proces moe se prikazati:

-galaktozidaza
C12H22O11 glukoza + galaktoza
laktoza

glikoliza laktat-dehidrogenaza
C6H12O6 CH3-CO-COOH CH3-CHOH-COOH
glukoza pirogroana kis. mlijena kis.

Kao to se vidi iz gornje sheme, bakterije proizvode mlijenu kiselinu koja sniava
pH mlijeka. Sniavanjem pH mijenja se naboj kazeina u mlijeku te pri pH=4,6
(izoelektrina toka) dolazi do njegove koagulacije, dok albumini zaostaju u
kapljevini koja se naziva sirutka. Zakiseljavanje mlijeka na ovaj nain prvi je korak u
proizvodnji jogurta i nekih vrsta sira. Koagulacija se dodatno moe pospjeiti
zagrijavanjem.
U nekim procesima proizvodnja sira, odnosno koagulacija kazeina provodi se
dodatkom proteolitikih enzima npr. kimozina (sirite, sirilo, renin). Proteolitiki
enzimi cijepaju -kazein na povrini kazeinskih micela i omoguavaju agregaciju
micela i koagulaciju kazeina. Koagulirajui enzimi su biljnog ili ivotinjskog
porijekla ili pak iz razliitih mikroorganizama. Tradicionalni nain dobivanja enzima
je iz eluca mlade teladi i janjadi koja se hrane mlijekom. Danas se uglavnom koristi
rekombinantni kimozin.

12
Enzimima katalizirana koagulacija odvija se u dvije osnovne faze:
1. Cijepanje -kazeina i promjena strukture micela kazeina-zgruavanje. Za ovu fazu
neophodno je prisustvo iona kalcija.
2. Kontrakcija (sinereza) ugruaka i istiskivanje vode iz zgruane faze. Proces se
ubrzava zagrijavanjem.
Nastali sir se soli, formira u razliite oblike, a zatim ostavlja da zrije, bez ili uz
dodatak plemenitih plijesni.

EKSPERIMENTALNI DIO

Potrebni pribor i materijal

- vodena kupelj - neobrano, pasterizirano mlijeko
- ae razliitog volumena - kiselo mlijeko
- pipete - sirite
- drveni tapii
- kapaljka
- epruvete
- pH papir
- tkanina za cijeenje

Postupak
Napuniti vodenu kupelj vodom u visini 2-3 cm i zagrijati na temperaturu 37-42C.
Pomijeati obino i kiselo mlijeko u omjeru 3:1 i ostaviti da poprimi sobnu
temperaturu. Kiselo mlijeko dodaje se da snizi pH mlijeka i radi boljeg okusa sira.
-U au od 100 cm3 uliti 40 cm3 smjese kiselog i obinog mlijeka te staviti u vodenu
kupelj 1 minutu.
-Dodati 4 kapi sirita, sadraj ae promijeati okretanjem ae u krug oko 5 sekundi.
-Vratiti au u kupelj, ostaviti 1 minutu, bez mijeanja.
-Pomaknuti au i provjeriti dolazi li do koagulacije. Vratiti au u kupelj na jo 1
minutu.
-Drvenim tapiem promijeati sadraj i ostaviti u kupelj jo 3060 sekundi.
-Procijediti sadraj ae preko tkanine, skupiti vrhove i iscijediti tekuinu.

13
Zadatak
1. Provesti proces priprave sira prema opisanom postupku pri oko 40C.
2. Postupak ponoviti pri sobnoj temperaturi.
3. Isti postupak kao pod 1 ponoviti uz deseterostruko razrjeenje enzima.
4. Osnovni postupak provesti samo s obinim mlijekom (bez kiselog).
5. Zabiljeiti opaanja

Literatura
1. Lj. Tratnik, Mlijeko-tehnologija, biokemija i mikrobiologija, Hrvatska
mljekarska udruga, Zagreb, 1998.
2. http://www.biosystems.usu.edu/education/high_school/labs/cheese/

14
Vjeba 4.
EKSTRAKCIJA DEOKSIRIBONUKLEINSKE KISELINE IZ PLODOVA
BILJAKA (kivi, graak, enjak)

Svrha vjebe: Primjena razliitih fizikalno-kemijskih procesa i operacija pri

obradi intracelularnog produkta (down-stream processing)

Uvod
Deoksiribonukleinska kiselina (DNK) je genetski materijal prisutan u svim
organizmima, od bakterija do ovjeka. Osnovne graevne jedinice DNK nazivaju se
nukleotidi, a sastoje se od duine baze, eera i fosfatne grupe. Stotine tisua
nukleotida tvore lance, a dva takva lanca povezana vodikovim vezama preko duinih
baza u dvostruku uzvojnicu (heliks) tvore DNK. U organizmima ije stanice imaju
jezgru DNK se povezana s proteinima nalazi u kromosomima. Ljudski genom (ukupni
set gena u jednoj stanici) sadri 3109 osnovnih nukleotidnih parova. Kad bi se uzela
sva DNK iz stanice i razvukla, bila bi duga 2 m, a sama se nalazi u jezgri stanice
promjera 0,005 mm.
Kako bi se ekstrahirala DNK iz stanica, voe ili povre se usitnjava i zagrijava ime
se najprije mehaniki, a zatim toplinski cijepaju stanine stjenke. Da bi se otopili
lipidi u staninim membranama i ovojnicama jezgri dodaju se povrinski aktivne tvari
(detergenti). Slobodna DNK topljiva je u vodi jer fosfatne grupe svakog nukleotida
imaju negativan naboj. Pozitivno nabijeni ion natrija iz kuhinjske soli neutraliziraju
taj negativni naboj. Neutralizacija omoguava agregaciju molekula DNK, a da bi se
oslobodila prateih proteina mogu se koristiti razliiti proteoilitiki enzimi, npr.
subtilisin A (sadran u tabletama za deproteinizaciju kontaktnih lea), papain (iz
papaje) ili bromelain (iz ananasa). Dodatkom etanola u otopinu DNK precipitira na
meupovrini etanol/voda jer nije topljiva u etanolu.

Kako dokazati DNK?

Svaki tip molekule, zahvaljujui jedinstvenoj strukturi, posjeduje karakteristian
apsorpcijski elektromagnetski spektar. Apsorpcijski spektar odreuje se razliitim
spektrofotometrima (UV/VIS, IR) pri emu se biljei stupanj apsorpcije
(apsorbancija) pri svakoj valnoj duljini. DNK ima maksimalnu apsorbanciju pri valnoj

15
duljini od ~260 nm, a tipini proteini pri ~280 nm. Ova razlika u apsorbanciji, tonije
njihov omjer, moe posluiti kao mjera uspjenosti ekstrakcije DNK.
Ako je A260 nm / A280 nm = 1,81,9 - uzorak je praktino ista DNK.
Ako je A260 nm / A280 nm = 1,92,0 - uzorak je praktino ista RNK.
Ako su vrijednosti gornjeg omjera manje od 1,8 znai da je zaostalo dosta proteina
koji apsorbiraju UV zraenje pri 280 nm.

EKSPERIMENTALNI DIO

Potreban pribor i materijal

-sjeckalica za povre - kivi ili graak
-aa od 500 cm3 ili tikvica od 250 cm3 - etanol
-graduirane ae od 100 i 200 cm3 - led
-menzura - kuhinjska sol
-lijevak - detergent
-termometar - proteolitiki enzimi
-filter papir

Postupak
A. Ekstrakcija DNK
1. Pripremiti ledenu vodenu kupelj visine 58 cm. U au uliti 50 cm3
etanola i staviti u ledenu kupelj.
2. Pripremiti otopinu za ekstrakciju: u ai ili u tikvici otopiti 2 g kuhinjske
soli u 90 cm3 destilirane vode. Dodati 10 cm3 detergenta i lagano
promijeati da se ne zapjeni.
3. Kivi ili graak usitniti u sjeckalici. Od ove mase uzeti 30 g i prenijeti u
au od 200 cm3.
4. Usitnjeni materijal preliti s otopinom za ekstrakciju tako da je ukupni
volumen dvostruko vei od volumena usitnjenog materijala.
5. Pripremiti vodenu kupelj temperature 50 60C.
6. Staviti au u kupelj. Uz mijeanje zagrijavati 10-15 min.
7. Nakon perioda inkubacije prenijeti au sa sadrajem u ledenu kupelj. Uz
mijeanje hladiti 5 minuta.

16
 8. Filtrirati sadraj ae preko filter papira i filtrat hvatati u tikvicu.
9. Sadraj u tikvici promijeati. 5 cm3 filtrata prenijeti u 2 epruvete. U jednu
epruvetu dodati proteolitike enzime i povremeno mijeati u vremenu od
30 minuta. U drugu ne dodavati proteolitike enzime.

B. Precipitacija DNK
1. Sadraju u epruveti dodati 10 cm3 to hladnijeg etanola i to pipetom na
dno epruvete, staviti u dra za epruvete i pratiti to se dogaa.
2. Ostaviti oko 2-3 minute da se DNK istaloi to se primjeuje po stvaranju
bijelog pahuljastog taloga. Radi boljeg taloenja ostaviti preko noi u
hladnjaku.
3. Pomou kapaljke, staklene kuke ili tapia pokupiti DNK i prenijeti na
satno staklo.

Analiza produkta
1. Mikroskopija: malo precipitirane DNK staviti na staklo za mikroskop, dodati
kap metilenskog plavila i mikroskopirati.
2. UV spektroskopija: otopiti DNK u 5 cm3 destilirane vode. Po potrebi
profiltrirati i razrijediti destiliranom vodom. Slijepa proba je destilirana voda.
Odrediti apsorbanciju pri 260 i 280 nm standardnim postupkom.

Zadatak
1. Izvriti ekstrakciju DNK iz dostupnog izvora.
2. Analizirati ekstrahirani produkt mikroskopskom i UV/VIS spektroskopijom te
objasniti dobivene rezultate.

Literatura
1. www.exploratorium.edu
2. http://www.biosystems.usu.edu/education/high_school/labs/dna/
3. www.biotech.iastate.edu

17
Vjeba 5.

SINTEZA BIODIZELA TRANSESTERIFIKACIJOM OTPADNOG

JESTIVOG ULJA

Svrha vjebe: Dobivanje goriva iz otpadnog biljnog ulja

Biodizel je naziv za gorivo koje se proizvodi alkoholizom ili transesterifikacijom

biljnog ulja ili ivotinjskih masti, a slui kao zamjena ili dodatak mineralnom dizelu.
Transesterifikacija je naziv za kemijske reakcije u kojima se ester jednog alkohola
prevodi u ester drugog alkohola. Osnovna sirovina za proizvodnju biodizela je ulje
uljane repice, soje ili druge pogodne uljarice. S obzirom na cijenu ovih ulja kao
alternativna sirovina moe posluiti otpadno jestivo ulje. Kvaliteta biodizela izravno
je povezana s kvalitetom sirovine. Zagrijavanjem biljnih ulja, npr. tijekom prenja,
moe doi do toplinskih, oksidacijskih ili hidrolitikih reakcija, to dovodi do
kemijskih promjena ulja. Promjena kemijskog sastava ne ovisi samo o vrsti ulja ve i
o hrani koja je prena te temperaturi i vremenu prenja. Stoga se otpadna ulja moraju
u odreenoj mjeri rafinirati prije hidrolize. Najjednostavniji postupak je filtracija
zagrijanog ulja, hlaenje te fazna separacija zaostale vode. Sve sirovine moraju biti
bezvodne jer se uz prisustvo vode parcijalno odvija i reakcija saponifikacije
(nastajanje sapuna).

Alkoholiza ili transesterifikacija ulja openito se odvija prema sljedeoj shemi:

H2C OCOR' ROCOR' H2C OH

+
katalizator
HC OCOR'' + 3ROH ROCOR'' + HC OH
+
H2C OCOR'' ROCOR''' H2C OH

triglicerid alkohol smjesa alkilnih glicerol

estera

Reakcija tee zadovoljavajuom brzinom pri umjerenim temperaturama i

atmosferskom tlaku. Prikladni alkoholi su metanol, etanol, propanol, butanol i amilni
alkohol. Najee se upotrebljava metanol, zbog niske cijene i povoljnih fizikalno-

18
kemijskih karakteristika. Iako je stehiometrijski omjer alkohola i ulja 3:1, zbog
poveanja iskoritenja i ubrzanja kemijske reakcije, radi se s alkoholom u suviku.
Katalizatori mogu biti kiseli (sulfatna, fosfatna, kloridna kiselina) i bazni (NaOH,
KOH, karbonati, alkoksidi). Najee se provodi bazno-katalizirana transesterifikacija
jer je oko 4000 puta bra od kiselo-katalizirane.
Reakcija transesterifikacije efikasno se moe katalizirati ekstracelularnim i
intracelularnim lipazama (lipaze iz gljivica Muchor miehei, Candida antartica,
Pseudomonas cepacia) bilo u vodenom ili u nevodenom mediju. Meutim, lipaze su
znatno skuplje od nekog alkalnog katalizatora.
Prvi standard za biodizel dobiven iz repiinog ulja pojavio se u Austriji 1990 (ON
C1190). Slini standardi danas postoje i u vedskoj, Francuskoj, Njemakoj, Italiji,
ekoj i SAD-u.
Neke znaajke biodizela u odnosu na mineralni dizel prikazane su u tablici 5.1.

Tablica 5.1. Usporedba biodizela i dizelskog goriva

Svojstvo Biodizel iz repiinog Biodizel iz otpadnog Dizelsko gorivo

ulja repiinog ulja
3
Gustoa(g/cm ) 0,882 (15C) 0,895 0,8300,840(15C)
Cetanski broj 5159,7 53 35,5
Kinematika 4,2 (40C) 9,48 (30C) 3,5 (40C)
viskoznost
(mm2/s)
Plamite (C) 170 192 80
Sumpor (%) 0,009 0,002 0,36

EKSPERIMENTALNI DIO

Potreban pribor i kemikalije

- tikvica okruglog dna od 500 cm3 - metanol

- magnetsko mijealo - katalizator, KOH
- termometar - otpadno jestivo ulje
- lijevak za odjeljivanje, 2 kom

19
Postupak:
Predobrada sirovine: oko 300 g ulja zagrijavati uz mijeanje oko 5 minuta na 110C
da se ukloni eventualno prisutna voda, ohladiti do 5060C te filtrirati.
U tikvicu (slika 5.1) uliti 200 g prethodno obraenog ulja i zagrijati do 60C. Dodati
57,8 cm3 (43,4 g) metanola s otopljenim katalizatorom (1 % w/w KOH u odnosu na
masu ulja, tj. 2 g ).

Slika 5.1. Aparatura za provedbu procesa transesterifikacije

biljnog ulja

Reakcijsku smjesu snano mijeati 2 sata na zadanoj temperaturi, a zatim prebaciti u

lijevak za odjeljivanje da bi se odvojio glicerol (najmanje 4 sata ili preko noi).
Nakon isputanja glicerola dobiveni metilni ester prebaciti u drugi lijevak za
odjeljivanje i paljivo isprati sa 50 cm3 destilirane vode kako bi se uklonili nastali
sapuni, viak metanola i katalizator te ostaviti da se slojevi odvoje. Izraunati
iskoritenje prema oleinskoj kiselini budui je ona glavna komponenta ulja:

1 mol triglicerida + 3 mol metanola 3 mola metil-estera (biodizela)

+ 1 mol glicerola

20
Mm triglicerida (oleina) = 885 g/mol, a masa je 200 g, pa je to 200/885 = 0,226 mola.
Molni odnos metanola i ulja je 6:1 (dvostruka stehiometrijska koliina), a molekulska
masa metanola je 32 g/mol, pa je to 0,226 x 6= 1,356 mola x 32 = 43,4 g / 0,75 g/cm3
= 57,8 cm3.
Za teorijsko iskoritenje na biodizelu tj. metilnom esteru molekulske mase 296 g/mol
(metilni ester oleinske kiseline) vrijedi: 0,226 x 3 = 0,678 mola, a teorijska masa je
0,678 x 296 = 200,69 g
Stvarno iskoritenje u postotcima:
= (masa dobivenog biodizela / 200,69) x 100.

Zadatak
1. Odrediti karakteristike otpadnog jestivog ulja: gustou, kiselinski broj,
peroksidni broj.
2. Provesti sintezu biodizela iz otpadnog jestivog ulja.
3. Odrediti gustou, kinematiku viskoznost i plamite dobivenog metilnog
estera (biodizela) te izraunati iskoritenje.

Literatura
1. H. Fukuda, A. Kondo and H. Noda, J. Biosci. Bioeng. 92, 2001, 405-416
2. C. L. Peterson et al. Appl. Eng. Agriculture, 18, 2002, 5-11
3. B. Supple et al. JAOCS, 79, 2002, 175-178

21
6. METODE ODREIVANJA FIZIKALNO-KEMIJSKIH
KARAKTERISTIKA SIROVINA I GOTOVIH PROIZVODA

6. 1. ODREIVANJE GUSTOE

Tariranu (ili izvaganu) odmjernu tikvicu od 10 cm3 nadopuniti do oznake, pri

temperaturi 20C. Izvagati tikvicu i uzorak. Ako je tikvica tarirana oitana masa u
gramima (m) je masa kapljevine u tikvici. U drugom sluaju masu prazne tikvice treba
oduzeti od mase pune tikvice.

Gustoa, = m/10 (g/cm3)

6.2. ODREIVANJE KISELINSKOG BROJA

Kiselinski broj (KB) oznaava mg KOH potrebne za neutralizaciju 1 g uzorka.

35 g uzorka otopiti u 50 cm3 etanola neutraliziranog s alkoholnom KOH i titrirati s
0,1 M KOH uz indikator fenoloftalein do prve pojave ruiaste boje koja se zadrava.
Izraunava se prema izrazu:
a 5,61 f
KB =
m

a utroak 0,1 M KOH za titraciju / cm3

f- faktor 0,1 M KOH
5, 61 - masa KOH (u mg) sadrana u 1 mL 0,1 M alkoholne otopine KOH
m masa uzorka / g

6.3. ODREIVANJE PEROKSIDNOG BROJA

Peroksidni broj daje uvid u stanje oksidiranosti ulja, a po definicije predstavlja

koliinu tvari u uzorku koje oksidiraju KJ, izraenu u milimolovima aktivnog kisika
po kg (mmol/kg).

22
U suhoj erlenmeyerovoj tikvici od 250 cm3 s bruenim epom izvagati uzorak uz
tonost 0,001 g (0,30,5 g ako je otpadno ulje, a 1,22 g ako je novo ulje). Uzorak
otopiti u 10 cm3 kloroforma i 15 cm3 ledene octene kiseline, dodati 1 cm3 zasiene
otopine KJ, brzo zaepiti tikvicu i sadraj mijeati 1 minutu, a zatim ostaviti u tami 5
minuta pri temperaturi 1520C.
Nakon toga dodati oko 75 cm3 destilirane vode, 2 cm3 otopine kroba i titrirati s 0,01
mol/L (za peroksidni broj ispod 12) ili 0,02 mol/dm3 (za peroksidni broj iznad 12)
otopinom natrijeva tiosulfata uz snano mukanje. Napraviti i slijepu probu. Za svaki
uzorak rade se dva odreivanja. Peroksidni broj izraunava se prema izrazu:

(V V0 ) C
Pbr = 1000
2 m

V volumen otopine natrijeva tiosulfata potroen za titraciju uzorka / cm3

V0 - volumen otopine natrijeva tiosulfata potroen za titraciju slijepe probe / cm3
C koncentracija otopine natrijeva tiosulfata
1000 - konstanta, za izraavanje rezultata po kg uzorka
2- molovi tiosulfata koji odgovaraju jednom molu peroksida
m masa uzorka /g

Rezultat predstavlja aritmetiku sredinu dvaju odreivanja.

Osim u mmol/kg postoje i druge jedinice za izraavanje peroksidnog broja:
- mg/kg ili g/g: Pbr x 16,
- meq aktivnog kisika / kg : Pbr x 2.

6.4. ODREIVANJE KINEMATIKE VISKOZNOSTI

Viskoznost predstavlja otpor fluida protiv smicanja njegovih estica.

Pojmovno se definira kao mjera ilavosti fluida koja pokazuje kojom e silom slojevi
meusobno djelovati jedan na drugi, po jedinici povrine, ukoliko se gibaju
jedininom relativnom brzinom na jedininoj udaljenosti. Tako definirana viskoznost
predstavlja dinamiku viskoznost (eta). Omjer dinamike viskoznosti i gustoe
fluida naziva se kinematika viskoznost (ni).

23
6.4.1. Odreivanje viskoznosti Ostwaldovim viskozimetrom
Ovo odreivanje sastoji se u mjerenju vremena protjecanja kapljevine kroz kapilaru
viskozimetra (slika 6.1).

Postupak:
Viskozimetar se uroni u vodenu kupku i temperira na 40C. Zatim se pipetira tono
odreena koliina uzorka i ulije u iri dio viskozimetra. Nakon toga uzorak se usie
kroz kapilaru viskozimetra do odreene oznake i mjeri se vrijeme u kojem tekuina
tee do druge oznake. Treba izvriti 3 mjerenja vremena, a kao rezultat uzima se
srednja vrijednost. Umnoak srednje vrijednosti vremena protjecanja i konstante
viskozimetra predstavlja kinematiku viskoznost:

= kt (mm s-1)

k konstanta viskozimetra (0,0384)

t vrijeme protjecanja kapljevine

Slika 6.1. Ostwaldov viskozimetar

24
6.5. PLAMITE

Pod plamitem se podrazumijeva ona temperatura pri tlaku od 760 mm Hg,

kod koje se iznad ispitivanog uzorka, zagrijavanog u propisanom aparatu, skupi toliko
njegovih para, da se one u smjesi sa zrakom prvi put, na trenutak, zapale kada dou u
dodir s plamenom ili iskrom.
Razlikuje se plamite u otvorenom i zatvorenom loniu. Poklopac na loniu
u ovom drugom sluaju sprjeava izlazak pare, te stoga plamite u zatvorenom
loniu predstavlja uvijek niu vrijednost. Ova je razlika vea, to se plamite nalazi
na vioj temperaturi.
Postoji nekoliko tipova aparatura za odreivanje plamita, a izbor aparature ovisi o
temperaturi plamita tekuine koja se ispituje. Kod tekuina s plamitem ispod 50 C
odreivanje se vri u aparatu po Abel-Penskyu, iznad 50 C upotrebljava se aparat po
Pensky-Martensu ili Marcussonu. Aparati po Abel-Penskyu i Pensky-Martensu imaju
posudicu sa poklopcem, dok je aparat po Marcussonu otvoren.

6.5. 1. Odreivanje plamita po Pensky-Martensu

Aparat po Pensky-Martensu upotrebljava se kod kapljevina s plamitem iznad

50 C. Aparat je strogo normiran i ima dva termometra. Kod tvari s plamitem ispod
100 C upotrebljava se termometar od 0 - 110 C, a za tvari s plamitem iznad 100 C
upotrebljava se termometar od 90 - 170 C. Aparata po Pensky-Martensu prikazan je
na slici 5.
Bronana posuda za uzorak O uloena je u zranu kupelj od lijevanog eljeza
A, koja se grije preko iane mreice ili bez nje. Grijanje se vri Bunsenovim
plamenikom. Bronana kupola D smanjuje na minimum gubitak na toplini. Tri otvora
na poklopcu posude za uzorak su pokrivena okretnim zaklopcem, koji se pokree
pomou ruke H. U ispitak kapljevine je uloeno mijealo sa irokim lopaticama za
mijeanje i s malim lopaticama iznad za mijeanje pare i zraka. Mijealo prolazi kroz
poklopac i pokree se rotiranjem ruke K. Temperatura kapljevine kontrolira se
termometrom T.

25
 Slika 6.2. Aparatura za odreivanje plamita po Pensky-Martensu

Postupak rada:
Svi dijelovi aparata moraju biti potpuno isti i suhi. Posudica se napuni
ispitivanom kapljevinom do oznake i postavi u pe, a povie nje stavi se poklopac s
termometrom. Zatim se upali i regulira plamiak prema standardnoj kuglici na
aparatu. Tada se zrana kupelj zagrije plamenikom, tako da temperatura ispitka raste
oko 5C po minuti, te se stavi u pogon mijealo kod priblino 60 okr./min. Najmanje
15C ispod oekivane toke plamita (u sluaju kada je nepoznato, izvri se prethodni
grubi pokus, ispitujui svake pola minute) pokua se sputati plamiak u posudu i to
do 100C kod svakog 1C, a za temperaturno podruje iznad 100C svako 2C. Kada
se sputa plamiak, prekida se mijeanje. Plamiak se mora spustiti u roku od 0,5
sekundi, drati na mjestu 1 sekundu i tada brzo vratiti u poetni poloaj.
Plamite je temperatura pri kojoj se od plamika jasno upali smjesa para i
zraka skupljene nad povrinom posude. Da je plamite blizu, poznaje se po tome to
plamiak postaje vei. Dva odreivanja smiju se razlikovati najvie za 2 C.
Kod odreivanja plamita vrlo viskoznih tvari ploha se stavi ve ugrijana u
posudicu, koja je takoer ugrijana na temperaturu blizu plamita, i provede
ispitivanje. Jedina razlika je brzina grijanja, 2 - 3 C/min., a mijeanje 70 - 80
okr./min.

26