Capitulo 31g REPLICACION, REPARACION Y RECOMBINACION DEL DNA 1, Replicacion del DNA: Introduccion A. Horquillas de replicacion B. Funcién de la DNA girasa C. Replicacién semidiscontinua D. Cebadores de RNA ‘A. DNA polimerasa | B. DNA polimerasa Il C. Helicasas, proteinas de unién y DNA ligasas 3. Mecanismos de replicacién procariética A. Bacteriofago M13. B. Bacteriéfago 6X174 ©. E.coli D. Fidelidad de la repli 4.’Replicacion del DNA eucaridtico A. El ciclo celular B. DNA polimerasas eucariéticas ©. Transcriptasa inversa 5. Reparacién del DNA ‘A. Reparacién directa B. Reparacion por escision C. Reparacién por recombinacién D. La respuesta SOS E. Identificacion de carcinégenos Recombinacién y elementos genéticos méviles ‘A. Recombinacién general B. Transposicion 7. Metilacion de! DNA Los seres vivos somos los instrumentos del DNA para fabricar mas DNA. Anon En este capitulo, se tratara de la sintesis y el mante- nimiento del DNA. La necesidad de la transmision de la informacién genética a las siguientes generaciones suficientemente fidedigna, pero con capacidad para admitir las mutaciones beneficiosas, ha llevado a la evolucin de complejos mecanismos para la replica- cién, reparacién y recombinacién del DNA. Los as- pectos generales de estos procesos ya se conocen, si bien los detalles quedan atin por dilucidar. 1. REPLICACION DEL DNA: INTRODUCCION El hist6rico articulo de Watson y Crick sobre la estructura de la doble hélice de DNA acababa con la siguiente frase: “Es evidente que el apareamiento especifico que postulamos para las bases del DNA sugiere un posible mecanismo de reproduccién del1018 Secci6n 31-1. ReplicaciOn del DNA: Introduccién DNA molde s—> 5 ‘fey : coe — NA replcado Figura 31-1 By oH NY DNA polimerasa iM Las DNA polimerasas ensamblan los desoxinucledsido trifosfatos entrantes sobre moldes de DNA monohebra, con lo que la hebra creciente es extendida en direccién v3 material genético.” En un articulo posterior, estos au- tores se extendieron en sus suposiciones sefialando que una hebra de DNA puede actuar como molde para dirigir la sintesis de su hebra complementaria ‘Aunque en 1958, Meselson y Stahl demostraron que la replicacin del DNA era semiconservadora (Sec- cién 28-2A), no fue hasta 20 aftos después cuando se llegé a conocer con suficiente detalle el mecanismo de la replicacion del DNA en procariotas. Ello se debe, como veremos més adelante en este capitulo, a que el mecanismo de la replicacién del DNA rivaliza con el de la traduccion en complejidad, pero esta mediado por ensamblajes de proteinas débilmente asociadas, de las que solo estan presentes unas pocas copias por célula, La sorprendente complejidad de la replicacién del DNA, en comparacién con la transcripcién, que usa mecanismos quimicos parecidos (Seccién 29-3), proviene de ta necesidad de una fidelidad extrema en Ia replica- cién del DNA, con el fin de mantener la integridad del genoma generacién tras generacién, A. Horquillas de replicacion La replicacién det DNA se lleva a cabo mediante enzimas conocidos con el nombre de DNA polimerasas dirigidas por DNA o simplemente como DNA poli- ‘merasas, Estos enzimas utilizan DNA monohebra como molde sobre el que catalizan la sintesis de la hebra complementaria, a partir de los desoxinucleési- dos trifosfato adecuados (Fig. 31-1). Los nuevos nu- cletidos se seleccionan por su capacidad para apa- rearse, segiin la complementariedad demostrada por Watson y Crick, con las bases de la molécula molde, de modo que la hebra recién sintetizada forma una doble hélice con la hebra molde. Casi todas las DNA polimerasas conocidas pueden aftadir tinicamente el nu- cledtido aportado por un nucleésido trifosfato, al grupo 3-H libre de un polinucledtido, que tiene sus bases apareadas, de forma que la hebra de DNA se extiende s6lo en la direcci6n 5’ —» 3’. Las DNA polimerasas se describen en secciones posteriores: 31-2A, 2B y 4B. EI DNA daplex se replica semiconservadoramente en las horquillas de replicacion John Cairns obtuvo las primeras pruebas sobre el mecanismo de replicacién de los cromosomas me- diante autorradiografias de DNA en replicacién. Estas autorradiografias de cromosomas circulares creciendo en un medio que contenia ['H]timidina mostraban Ojo de repicacién Figura 31-2 Autorradiogratia y dibujo actaratorio de un cromosoma de E. colireplicandose. Las bacterias se cultivaron durante algo mas de una generacion en un medio que contiene PHitimina, marcandose asi el DNA de nueva sintesis que aparece como una linea de granos oscuros en la emulsion fotografica (Ineas rojas en e! dibujo actaratoric). El tamatio dol ojo de replicacién indica que el cromosoma circular se hha duplicado una sexta parte en la vuelta de replicacién en curso. [Por cortesia de John Caims, Cold Spring Harbor Laboratory,Copa 31. Repco repay combina del DNA 1008 gue 31 Peano OMA, Ja existendia de “ojos” o “burbujs” de repiacin (fig 31-2), Estas estructura, denominadasestract 1280 (por su parecida a esta lea griega) indican que IDNA dip se veplica por una progreioaseparaiin elas doe bres paternay.scompena de ao se- Sis de sus heres complomentara, dando Laer deforma Semicnseondor, 2 as dbs bres hase. 91-3) EY mecanismo de replicacion del DNA basado en las estrutuas 6 es connddo como replleaion 8 El punto de separacion de las dos hebras ene ojo de roplicacion, donde la sntesis ene lugar, se de- omina horguila de replicaci, Una barbuja de e- plcaion puede contener una o dos horguls de Feplcacon(replicacion unllrecclonalo bidireclo- ‘al Los estudios mediante autoradiogafias han de- ostrado que lareplcacion de tipo Os cas siempre Didvecconal (Fig 51-4). Ademds,dchos expermen- ton, junto con algunas evidencosgenies an eet blecide que el DNA procantice jel de los barter {ages silo poseen un anico origen de replication (punto donde se inca In sntess del DNA}. B. Funci6n de la DNA girasa la necesidad de desenrollr Ia hebtapterna del DNA en a horglla de replcason (Fg 31-3) prods ce grandes problemas a nivel topologic, Por ejem: Plo el DNA de E coll se replica 2-una veloddad Eprosimada de ~ 1000 nuclesidos/s. isu cromouo ‘a de 1300 um de longi fuera lineal, debera gar dentro de los 3m de longitu de una ctl de Eel 42.100 revolucones/s recutdese que el B-DNA tiene unas 10 bp por yuo). Pero, incluso eto ne Sela posible, ya que de hecho el comoaoma de & {alles creat Pot el conta, Ia molécua de DNA ‘cumulara +100 supernvllamients/s (vee Seceon 25-54. para una revision del supeenvllamieno), Insta que legara a estar demasiado retorida sobre risa como para contnuar desensolandose. El su- petentllamiento negative que tiene lugar en el DNA aural promueve la desespualizacion de icamente '$'5 Bede sus elas duplex (recutrdese que los DNAs que se encuenzan en a natualeza no estn completamente superenolados, les alla una super” ie prada ~20 yt dpe Sect 285. Sin embargo, en organisms procaiouce, los super- cqllamientos nogatvos se pueden estableer en el [DNA por ls acon de una topossomeraa del Tipo Il (DNA grasa; Secion 28-50) a expensas dela hldl- Sis de ATP- Este proceso es esencal en Ia vepicacion cin \ Ve » ‘ferns, near aoresograa, ne replessen sndrecoenlyirecatea ge NA. (shun organ se nace recor rate aris erases aman meses ease con mara par gets sSNA so vole on na ‘szraaogri Uns poe eepunde ede sa ‘SRK erie de pus), s ode cue ira gre ster tees frases eri ‘apieaban undreedena sss ooaorstetonsente Imarace une ae os puts esis poe spr rose gua epeacisn Saeco provers dos do oe pros Go ramsacon ate me (i adormagrate co DNAse ol tae dee Ime fone: que cones su eaten bareecel {Gonuls de Davis Mc Prose, Ute of Coeace)1020 Seccién 31-1, Replicacion del DNA: Introduccién del DNA procaristico, como lo demuestra la deter cién de la replicacién del DNA en presencia de inhit dores de la DNA girasa, como la novobiocina o el Acido oxolinico, a excepcién de los mutantes en los que la DNA girasa no se une a estos antibisticos. C. Replicacién semidiscontinua Las imagenes de baja resoluci6n obtenidas median- te autorradiografias, como las de las Figs. 31-2 y 31-4b sugieren que las dos hebras antiparalelas del, DNA duplex se replican simultaneamente a medida que avanza la horquilla de replicacién. Pero, todas las DNA polimerasas conocidas tan solo pueden exten- der las hebras en la direccién 5’ — 3’. Como, enton- ces, la DNA polimerasa es capaz de copiar la hebra paterna que sigue la direccién 5’ > 3’, més alla de la horquilla de replicacién? Esta pregunta fue contestada en 1968 por Reiji Okazaki mediante los siguientes experimentos. Si durante el crecimiento de un cultivo de E. coli se realizan marcajes con pulsos de 30 s de ['H]timidina, la mayor parte de la radiactividad y, por ello el nuevo DNA sintetizado, tiene un coeficiente de sedimentacién en medio alcalino de 7S a 11S. Estos nuevos fragmentos sintetizados, llamados fragmen- tos de Okazaki, son tan s6lo fragmentos de 1000 a 2000 nucledtidos. Sin embargo, si después del pulso de 30 s con [°H] timidina, se transfiere el cultivo de E. coli a un medio no radiactivo (experimento de pulso y caza), el DNA tesultante, marcado radiactivamente, sedimenta a una velocidad que se incrementa con el tiempo que las células han crecido en el medio no radiactivo. De esta observacién, se deduce que los fragmentos de Okazaki deben haber sido incoporados covalentemente a moléculas de DNA de mayor ta- mato, ‘Okazaki interpret6 sus resultados experimentales en términos de un modelo de replicacién semidis- continua (Fig. 31-5). Las dos hebras paternas se repli- can de modo diferente. La hebra de DNA sintetizada de nuevo, que crece en direccién 5’ —» 3’, al igual que el avance de la horquilla de replicacién, es la denominada hebra conductora y es esencialmente sintetizada de ma- nera continua. La otra hebra de DNA sintetizada de ‘vance de i erate e repicacion Hebra conductors Hebra retrasada (Fragmentos de Okazak)) ST An as i A Figura 31-5 En la replicacién del DNA, ambas hebras hijas (rojo) se intetizan en la direccién &' -+ 3’. La hebra conductora se sintetiza de forma continua, mientras que la hebra retrasada lo hace de forma discontinua. Microgratfia electronica de un ojo de replicacion en el DNA de Drosophila melanogaster. Obsérvese que las regiones monohebra (fiechas), cerca de las horquillas de replicacion, tienen una configuraciOn trans, de acuerdo con el modelo ‘semidiscontinuo de replicacién del DNA. [Tomado de Kreigstein, H. J. y Hogness D. S., Proc. Natl. Acad. Sci. 71, 173 (1974) nuevo, la hebra retrasada, es también sintetizada en direccién 5’ + 3', pero de manera discontinua, formando los fragmentos de Okazaki, Estos fragmentos se unen covalentemente, después de su sintesis, en una reaccién catalizada por el enzima DNA ligasa (Seccién 31-20. Este modelo semidiscontinuo de replicacion del DNA se ve corroborado por micrografias de DNA replicandose, donde se muestran regiones de DNA mo- nohebra en una de las ramas de la horquilla de repli- cacién (Fig. 31-6). En el DNA que se replica bidirec- cionalmente, aparecen ademas dos regiones de DNA monohebra dispuestas, como era de esperar, en sitios ‘opuestos diagonalmente respecto a la burbuja de re- plicacion. D. Cebadores de RNA Uno de los requerimientos casi universales para todas las DNA polimerasas es el extender la hebra de DNA a partir de un extremo 3’-OH libre. Como con- secuencia de este hecho, resaltado por el estableci- miento del modelo semidiscontinuo, se plantea la siguiente pregunta: jcmo se inicia la sintesis de DNA? Analizando cuidadosamente los fragmentos de Okazaki, se observa que sus extremos 5” consisten en segmentos de RNA de 1 a 60 nucleétidos (esta longitud varia segin la especie), que son complementarios a la hebra de DNA molde (Fig. 31-7). E. coli posee dos enzimas que catalizan la formacién de estos cebado- res de RNA: la RNA polimerasa, el enzima que me- dia la transcripcién (Seccién 29-2), y otro de menor tamafio, la primasa (60 KD), que es el producto mo- nomérico del gen denominado dnaG. Esta primasa, contrariamente a la RNA polimerasa, es tesistente a la accién de la rifampicina (Seccién 29-2C). La observaci6n de que la rifampicina inhibeCapitulo 31. Replicacién, reparacién y recombinacién del DNA 1021 e LLU 5: RNA cebador| Figura 31-7 La sintesis de DNA se inicia en segmentos cortos de RNA. ‘inicamente la sintesis de la hebra conductora esta indicando que la primasa es la encargada de sintetizar los cebadores de los fragmentos de Okazaki. La inicia- cién de la sintesis de la hebra conductora en E. coli, tun suceso mucho menos frecuente que la de los frag- mentos de Okazaki, puede ser realizada in vitro por cualquiera de las dos polimerasas solas, la RNA poli- merasa o la primasa, pero el proceso es altamente estimulado cuando los dos enzimas estan presentes. Es por ello, que se piensa que estos dos enzimas actan sinérgicamente int vivo en el inicio la sintesis de la hebra conductora. EI DNA ya replicado, maduro, no contiene ningén fragmento de RNA. Los cebadores de RNA se elimi- nan durante el proceso de la replicacion y los huecos monohebra que dejan son llenados con DNA por el mecanismo descrito en la Seccién 31-24. 2. ENZIMAS DE REPLICACION La replicacién del DNA es un proceso complejo en el que intervienen gran variedad de enzimas. Los principales actores que participan en el proceso de replicacién, enumerados por su orden de aparicion son: (1) una DNA girasa, (2) proteinas que separan las hebras del DNA en la horquilla de replicacion, (3) proteinas que impiden la nueva union de las he- bras antes de su replicacion, (4) enzimas que sinteti- zan los cebadores de RNA, (5) una DNA polimerasa, (6) un enzima que elimina los cebadores de RNA y (2) un enzima que une covalentemente los fragments de Okazaki contiguos. Ahora describiremos las. pro- piedades y funciones de muchas de estas proteinas. A. DNA polimerasa I En 1957, Arthur Kornberg publicaba el descubri- miento del enzima que cataliza la sintesis de DNA en extractos de E. coli, gracias a su capacidad de incor- porar marcaje radiactivo en el DNA a partir de [C]ti- midina trifosfato. Este enzima, denominado desde entonces como DNA polimerasa I o Pol I, es un linico polipéptido de 928 restos. Pol I coloca desoxinucle6sido trifosfatos en los moldes de DNA (Fig. 31-1). La reaccién se produce por el ataque nucleofilico del grupo 3'-OH de Ia hebra de DNA que estd creciendo sobre el a-fosforilo del nucleésido trifosfa- to que se va a incorporar en la siguiente posiciOn. La reacci6n es impulsada por la consiguiente eliminacién de un grupo PP, y su posterior hidr6lisis por accién de la pirofosfatasa inorgénica. La reaccion global se parece a Ia catalizada por la RNA polimerasa (Seccion 29-2), pero difiere de ésta en el requerimiento estricto de que el nucléotido entrante debe unirse al extremo 3'-OH libre de un polinuclestido que tenga sus bases apareadas a la hebra molde (recuérdese que la RNA polimerasa inicia la transcripcién por la union de dos ribonuclestido trifosfatos sobre una hebra molde de DNA). La complementariedad entre el producto de DNA y el molde fue inferida por vez primera median- te estudios de la composicién de bases y de hibrida- cién, y, con el tiempo, fue establecida directamente mediante la determinacién de la secuencia de bases. EI nivel de error de la Pol I, cuando copia el DNA molde, es bastante bajo. Ello se demostré por la repli- cacién in vitro del DNA del bacteriéfago 6X174, la cual produjo DNA fagico con plena capacidad infec- ciosa. La especificidad de la Pol I por la base entrante, més que un mero reconocimiento, se cree debida a la necesidad de que la nueva base forme un par de bases de Watson-Crick con el molde (recuérdese que los cuatro pares de bases, A-T, T-A, G:C y C-G po- seen todos formas casi idénticas; Seccién 28-24). Ello explica que la Pol I pueda intercambiar la timina solo con el 5-bromouracilo y la guanina sélo con la hipo- xantina. Se dice que la Pol I es procesiva porque cataliza una serie de pasos sucesivos de polimeriza- cin, normalmente unos 20 o més, sin liberar el mol- de. Por supuesto, la Pol I puede actuar también en Bases no apareadas Sito de hidouiss? x e la exonuceasa a5 Figura 31-8 La actividad exonucleasa 3° -+ 5’ de la DNA polimerasa | elimina nucleétidos no apareados desde el extremo 3' de la hebra de DNA naciente.1022, Seccién 31-2. Enzimas de replicacion Sto ela exonucleasa 5' -» 3 Corteen una sola hebra Figura 31-9 La actividad exonucleasa 5’ -+ 3'de la DNA polimerasa | elimina hasta 10 nuclestidos a partir del extremo 5° de un corte que se ha producido en una sola hebra. El nuclestido que se encuentra inmediatamente después del corte puede ‘estar apareado 0 no. sentido inverso, degrandando el DNA mediante piro- fosforolisis. Esta reaccion inversa probablemente no tiene ningun significado biologico, ya que la concen- tracion in vivo de PP,, procedente de la accion de pirofosfatasa inorgénica, es muy baja Pol I puede corregir sus errores Ademas de su actividad polimerasa, la Vol I tiene dos actividades hidroliticas independientes: @ Figura 31-10 Estructura de rayos-X del fragmento Klenow de la Pol | (2) Dibujo de cintas, en el que la discontinuidad entre las helices H e | (izquierda) indica la posicion de un segmento desordenado de 50 restos. La divisién entre los dominios Pequerio (verde) y grande (purpura) de la proteina se encuentra en el lazo entre las hélices F y G. (Segun Ollis, LL, Brick, P., Hamlin, R., Xuong, N. G. y Steitz, T. A., Nature ‘313, 762 (1985).] (b) Dibujo de espacio leno, basado en, parte en la construccién de modelos, del fragmento Klenow de la Pol | con el B-DNA de doble hebra colocado en la hendidura propuesta de fijaci6n del ONA (el cristal de Pol | ‘no contiene DNA). La hebra cebadora (verde) acaba en la regién del probable sitio activo de la polimerasa, mientras que la hebra molde (amarillo) atraviesa el enzima. Una molécula de dTMP (purpura) se muestra unida, en la Posicién observada, al sitio activo de la exonucleasa 3' +5’. [Por cortesia de Thomas Steitz, Yale University.) 1. Puede actuar como exonucleasa 3’ -» 5’ 2. Puede actuar como exonucleasa 5’ -» 3’, La reacci6n exonucleasa 3’ — 5° difiere quimicamente de la reaccién de pirofosforolisis s6lo en que el acep- tor de nucleétidos es el H,O en lugar del PP,, Sin embargo, estudios cinéticos y cristalograficos (ver mas, adelante) indican que estas dos actividades cataliticas ‘ocurten en sitios activos diferentes. La funcion exonu- cleasa 3’ — 5’ es activada por un nucle6tido terminal en 3’, desapareado, con un grupo OH libre. Cuando la Pol I incorpora, por error, un nuclestido equivoca- do (desapareado) en el extremo de la hebra de DNA que esta creciendo, la actividad polimerasa se inhibe y la actividad exonucleasa 3’ 5’ elimina el nuclesti- do erréneo (Fig. 31-8). A continuacién, la actividad polimerasa reanuda la replicacion del DNA. La Pol I, de este modo, tiene la capacidad de releer Ia hebra de DNA que esté sintetizando y corregir sus propios errores. Ello permite explicar la gran fidelidad de la replica- cion del DNA, a pesar de la relativamente poca ener- ©Capitulo 31. Replicacin, reparacin y recombinacién del DNA 1023 gia libre que posee una tnica interaccién por aparea- miento de bases (los aspectos energéticos de la fidelidad en la unién se discuten en la Seccién 30- 2C). El coste de esta elevada fidelidad es que ~ 10 % de los nuclestidos incorporados corfectamente son también eliminados. Cuando actia como exonucleasa 5’ 3, la Pol Ise une a los puntos del DNA daplex que presentan muescas en una sola hebra, independientemente de las caracteristicas del nucledtido en 5’ (5'-OH 0 grupo fosfato, apareado 0 no). La Pol I corta el DNA en una region apareada proxima a la muesca, degradandolo a mononucledtidos u oligonuclestidos de hasta 10 res- tos (Fig. 31-9). En cambio, la actividad exonucleasa 3’ +» 5’ elimina tnicamente los mononuclestidos des- apareados con grupos 3'-OH libres. La actividad polimerasa y las dos actividades exonucleasa de la Pol I tienen lugar en sitios, activos distintos La actividad exonucleasa 5’ -> 3’ de la Pol I es independiente de las otras dos, exonucleasa 3” — 5’ polimerasa. De hecho, como hemos visto en la Seccién 28-6C, algunas proteasas como la subtilisina © la tripsina digieren la Pol I en dos fragmentos: el fragmento grande o fragmento “Klenow” (posiciones 324-928), en el cual se encuentran las actividades polimerasa y exonucleasa 3’ —» 5’, y un pequefio fragmento (posiciones 1-323), que contiene la activi- dad exonucleasa 5’ 3’, Asi, la Pol I contiene tres sitios activos en una sola cadena polipeptidica. La estructura de rayos-X del complejo formado por el fragmento Klenow y el dTMP, determinada pot Tho- mas Steitz, indica que esta proteina esta formada por dos dominios (Fig. 31-102). El dominio pequefio fija 4TMP, cuyo fosfato 5’ interacciona con dos iones metélicos divalentes. El sitio de fijacin de dTMP forma parte de la exonucleasa 3’ — 5’. Ello se demos- tro por la ausencia de esta actividad, y no de la actividad polimerasa, en un fragmento Klenow mu- tante, modificado por ingenieria genética, que carecia de los sitios quelantes de iones pero que, por lo demas, posefa una estructura normal. El dominio grande (a partir de la hélice G, en la Fig. 31-10a) posee una hendidura prominente, el sitio activo de la polimerasa. La construccién de modelos indica que éste tiene el tamaito y la forma apropiados para unir una molécula de B-DNA, en una forma que recuerda a una mano derecha agarrandose a una barra (Fig. 31- 108). Un segmento de la proteina, constituido por 50 restos, que saldria del pulgar de la mano imaginaria (hélices H e I en la Fig. 31-102), no es visible en la estructura de rayos-X y, por ello, se cree que posee una conformacion desordenada. Steitz ha sugerido que este fragmento esta unido de una forma flexible a la proteina, cerrando el cuarto lado de la hendidura cuando ésta contiene DNA. Este mecanismo podria reducir enormemente la velocidad de disociacién del DNA de la polimerasa, explicando asi el caracter pro- cesivo observado en la Pol I. Los estudios de modela- do indican, ademés, que las hélices J y K se extienden hacia el interior del surco mayor del DNA. De esta forma, queda fijada la orientacin helicoidal del DNA. en el sitio activo de la Pol I, de una forma muy semejante a la rosca de una tuerca, Si estas dos carac- teristicas estructurales son realmente ciertas, el DNA. deberia atornillarse, avanzando hacia un nuevo extre- mo 3’, entre las etapas de polimerizacion. Con la intencion de caracterizar mejor la funcién polimerasa de la Pol I, se cristalizé el fragmento Klenow unido a un fragmento de DNA, diseniado para imitar el complejo molde-cebador: un DNA de 8 bp, en el que la hebra molde presenta un segmento monohebra de 3 nuclestidos que sobresale en el ex- tremo 5’. La estructura de rayos-X de este cristal revelé que el DNA, contrariamente a lo esperado, se une al sitio de la exonucleasa 3’ > 5’, dejando sola- mente un segmento visible de 4 nucledtidos (el resto est probablemente desordenado) que se extiende ha: cia el sitio de la polimerasa, que se encuentra a ~ 30 A, Ello sugiere que el sitio de la exonucleasa 3’ > 5” compite con el sitio de la polimerasa por el extremo 3’ del DNA recién sintetizado (Fig. 31-11). Como sea que el sitio de la exonucleasa puede fijar tnicamente DNA monohebra, cuando el extremo 3’ est desapa- reado y provoca por tanto la fusion del DNA, favore- ce claramente la unin de la hebra de nueva sintesis, al sitio de la exonucleasa. De esta forma, los errores de apareamiento son eliminados durante el proceso preferentemente. La funcién fisiolégica de 1a Pol I es la reparacién del DNA Durante los 13 afos que siguieron al descubrimien- to de la Pol I, fue comtinmente aceptado que este enzima era la DNA replicasa de E. coli, ya que no se habia detectado ninguna otra actividad polimerasa. En el afio 1969, esta presuncién fue cuestionada por Cairns y Paula DeLucia, al aislar un mutante de E. coli en el cual s6lo se detectaba < 1% de la actividad Pol I normal (aunque tenia niveles casi normales de acti- vidad exonucleasa 5’ > 3’) y que, a pesar de ello, su velocidad de reproduccién éra normal. Sin embargo, esta cepa mutante era muy sensible a los efectos, dafinos de la radiacion UV y a los mutégenos quimi- cos. Era evidente que Ia polimerasa Pol I desempefiaba un papel fundamental en la reparacién del DNA dafiado (modificado quimicamente). EI DNA alterado, tal como se describe en la Seccién 31-5, es detectado por diferentes sistemas de repara- ion del DNA. La mayoria de ellos cortan, mediante endonucleasas, el DNA dafado en el lado 5’ de la lesion, activandose la exonucleasa 5’ -> 3’ de la Pol I Mientras por un lado se elimina el DNA dafiado, por el otro, la misma Pol I va rellenando el hueco que resulta en una de las hebras, mediante la actividad polimerasa. Asi, la actividad exonucleasa 5’ > 3° se incrementa diez veces cuando la funcién polimera- sa esta activada. Es posible que la simultaneidad de las dos actividades de la Pol I, escision y polimeriza-1024 Secci6n 31-2, Enzimas de replicacién @ Sito activo de la polimerasa Sito acto ele excruclasa Figura 31-11 Modelo esquemitico del fragmento Klenow con el DNA Unido a (a) e! sito activo de la polimerasa: y (b) el sitio activo de la exonucleasa 3’ — 5’. Para desplazarse del sitio activo de la polimerasa al dé la exonucieasa, el extremo 3! de la hebra hia (rojo) debe recorrer la longtud de cuatro nucleétidos de DNA de doble hebra y cuatro de DNA monohebra. La hebra molde esta dibuiada en azul. (Seguin Freemont, P. S., Friedman, J. M., Bese, L. S., Sanderson, M . Ry Steitz, T. A. Proc Natl. Acad. Sci. 85, 8927 (1988),] cién, proteja al DNA de la accién de las nucleasas celulares, que podrian daar aun mas al DNA abierto. La Pol I cataliza la traslacién de muesca Las actividades exonucleasa 5’ -> 3’ y polimerasa de la Pol I pueden, conjuntamente, sacar y colocar nuevamente los nucleétidos en el lado 5’ de un corte, que se haya producido en una de las hebras de un DNA que, por lo demés, aparece intacto. Estas teac- ciones, de hecho, trasladan (mueven) la muesca hacia el extremo 3° de la hebra de DNA sin alterar, por lo dems, la molécula (Fig. 31-12). Este proceso de tras- lacién de muesca (“nick translation”), en presencia de desoxinucleésido trifosfatos marcados, es utilizado ena sintesis de DNA altamente radiactivo (las mues- cas pueden ser generadas por tratamiento del DNA con pequeftas cantidades de DNasa I pancreatica). La funcién fisiolégica de la exonucleasa 5’ —> 3’ de la Pol I es la eliminaci6n de los cebadores de RNA La exonucleasa 5'-» 3° también elimina los cebadores de RNA de los extremos 5 y rellena los huecos resultan- tes con DNA sintetizado de nuevo. La importancia de esta funcién fue demostrada por el aislamiento de mutantes de E. coli sensibles a la temperatura, los cuales no son viables ni muestran actividad exonu- cleasa 5’ + 3’ a la temperatura restrictiva de ~ 43 °C (el bajo nivel de actividad polimerasa de la cepa mutante en Pol I aislada por Cairns y DeLucia es, al parecer, suficiente para llevar a cabo este proceso fundamental de rellenar los huecos durante la replica- Tabla 31-1 Propiedades de las DNA polimerasas de E. coli Propiedad Poll Poll Pol lil Masa (kD) 109 = 120140 Moléculas/célula 400 2 10-20 Numero de recambio* 600 30 9000 Gen estructural polA pol poll Mutante letal condicional + - + Polimerizacién: 3° —> 5° + + + Exonucleasa: 3’ + 5° + + + Exonucleasa: 5 > 3° + - + -Nuclestidos polimerizados « min-! - molécula"! a 37 °C. Fuente: Kornberg A., DNA Replication, p. 169, Freeman (1980). cién cromosémica). Asi, la Pol I es indispensable en la replicacion del DNA de E. coli, aunque de una manera diferente a la que se suponia en un piincipio. B, DNA polimerasa III El descubrimiento de mutantes de E. coli, capaces de crecer normalmente, con una escasa actividad Pol 1, estimul6 la biisqueda de otras actividades polimeri- zantes del DNA. Este esfuerzo se vio recompensado cuando se encontraron dos enzimas mas, designados segiin el orden de su descubrimiento, DNA polime- rasa II (Pol I) y DNA polimerasa III (Pol II). Las propiedades de estos enzimas se comparan con las de la Pol I en la Tabla 31-1. La Pol I y la Pol Ill no se habian detectado con anterioridad debido a que sus actividades conjuntas, en las condiciones utilizadas, son normalmente <5 % de la actividad Pol I Los mutantes que carecen de actividad Pol II no presentan ningiin defecto aparente. Se desconoce, por tanto, la funcion fisiologica de la Pol Ul, sila tiene. La Pol Ill es la DNA replicasa de E. coli La interrupcion de la replicacién del DNA en mu- tantes de polC, sensibles a la temperatura, por encima de la temperatura restrictiva (alta) demuestra que la Pol Ill es la DNA replicasa de E. coli. Este enzima tiene i Muesca dNTPs DNA polimerasa I : Sn : Mononuclestidos \”}~7 | Figura 31-12 Traslacién de muesca catalizada por la Po! |Capitulo 31. Replicacién, reparacién y recombinacién del DNA 1025 Tabla 31-2 Componentes del holoenzima de la DNA polimerasa III Subunidad Masa (kD) Gen estructural e 130 polC (dnat) e 275 inaQ & 10 Desconocido e 7 anaZx* Y 52 naz? é 32 Desconocido B 40,6 dnaN Componentes del la Po! IL ‘Las subunidades y y + son codificadas por la misma secuencia génica; la subunidad y comprende el extremo N-terminal de la subunidad Fuente: McHenry, C. S,, Annu. Rev. Biochem. 87, 538 (1988), una composicién de subunidades del tipo ae, donde 4, el producto del gen polC (Tabla 31-2), contiene la fancion polimerasa. Las propiedades cataliticas de la Pol Ill se asemejan a las de la Pol I (Tabla 31-1), excepto por la imposibilidad de la primera de replicar DNA monohebra unido a un cebador o DNA duplex cortado en una de sus hebras. De esta manera, la Pol Ill actia in vitro sobre huecos de < 100 nucledti- dos en una sola hebra, situacién que recuerda el estado del DNA dentro de la horquilla de replicacion, La funcién exonucleasa 3° + 5’ de la Pol Ill, que reside en la subunidad & del enzima, es la principal correctora del DNA durante la replicacion; esta fun- cién aumenta hasta 200 veces la fidelidad del enzima en la replicacién. Sin embargo, la actividad exonucleasa 5’ > 3’ de la Pol Ill actiia anicamente sobre DNA monohebra, raz6n por la cual no puede catalizar la traslacion de muesca. La Pol III actiia in vivo como un complejo enzimatico abil, el holoenzima de la Pol III, formado como mini- $88 Holicasa a TTT Tt Hebrererasada <= Movimiento dela horquila B Hebra conductora & mo por siete tipos de subunidades (Tabla 31-2), Las liltimas cuatro subunidades de la Tabla 31-2 actian como moduladoras de la actividad de la Pol Ill. Por ejemplo, la fijacién del holoenzima de la Pol Ill a un DNA molde, con un cebador unido, requiere la hidr6- lisis de ATP en una reacci6n catalizada por la subuni- dad B. Mediante esta reaccién, el holoenzima queda sujeto al molde de DNA, formando un complejo que puede progresar por la doble hélice de una manera casi indefinida (> 5000 restos). En cambio, la Pol IIL por si sola, que no hidroliza ATP, tan s6lo es capaz de avanzar de 10 a 15 restos. Parece como si las subuni- dades del holoenzima, distintas de la Pol III, propor- cionaran algunos de los sitios de interaccion con otras proteinas participantes en la replicacién del DNA (Seccion 31-3). C. Helicasas, proteinas de union y DNA ligasas El holoenzima de la Pol Ill, a diferencia de la Pol I, no puede desenrollar el DNA diiplex. Asi pues, es necesario el trabajo coordinado de tres proteinas, la pro- teina Rep, la helicasa Il y la proteina de unién al DNA monohebra (SSB) (Tabla 31-3), para desenrollar el DNA antes del avance de la horquilla de replicacion (Fig. 31-13), en un proceso que es impulsado por la hidrélisis de ATP. La proteina Rep, producto del gen rep de E. coli, separa las hebras del DNA duplex, avanzando a lo largo de la hebra conductora del DNA. molde en direccién 3’ > 5’ y consumiendo, al mismo tiempo, dos ATPs por cada par de bases separado. De modo parecido, la helicasa II se desplaza a lo largo de la hebra retrasada del DNA molde en direccion 5’ 3’, La observaci6n de que, en los mutantes rep", nicamente se reduce la velocidad de la replicacion sugiere que la proteina Rep y la helicasa I trabajan juntas en la horquilla de replicacion desenrollando el DNA. La unién de la proteina SSB impide hibridar de nuevo a las hebras de DNA una vez separadas, detras del paso de la helicasa. Un gran nimero de copias de esta proteina tetramérica recubren cooperativamente el DNA monohebra, manteniéndolo asi desapareado. Obsérvese, sin embargo, que el DNA debe ser despo- jado de proteinas SSB antes de que pueda ser replica- do por el holoenzima de la Pol Ill. Proteina Rep Figura 31-13 Desenrollamiento del DNA por la accién combinada de la proteina Rep, la helicasa Il y la proteina SSB, La proteina Rep se mueve a lo largo del molde de la hebra conductora fen direccién 3’ -+ 5', acompafiada por la helicasa Il en el molde de la hebra retrasada, moviéndose en direccion 5’ 3". La unién de la proteina SSB impide la nueva hibridacion de las hebras del DNA previamente separadas. Tabla 31-3 Proteinas desenrolladoras y de unién al DNA en E. coli Estructura Masaen —_ Moléculas Proteina __subunidades_subunidades (kD) célula Proteina Rep’ Monémero 65 50 Helicasa Il Monémero 75 6000 SSB Tetramero 19 800 Fuente: Kornberg, A., DNA Replication, 1982 Supplement, p. $83, Freeman (1982) y DNA Replication p. 283, Freeman (1980),1026 Seccién 31-3. Mecanismos de replicacién procariética La DNA ligasa cierra los cortes producidos en una de las hebras del DNA La Pol I, como se ha visto en la Seccién 31-1D, sustituye los cebadores de RNA de los fragmentos de ‘Okazaki por DNA, mediante la traslacién de muesca. Los cortes resultantes en una de las hebras, entre dos fragmentos de Okazaki adyacentes, asf como en el DNA circular después de la sintesis de la hebra conductora, son cerrados en una reaccién catalizada por la DNA ligasa. La energia libre requerida para esta reaccion es obtenida, dependiendo de la especie, a través de la hidrdlisis acoplada de o bien NAD* a NMN* + AMP, © bien ATP a PP, + AMP. El enzima de E. coli, un monémero de 77 kD que utiliza NAD*, cataliza la reaccién en tres etapas (Fig. 31-14): 1. El grupo adenilo del NAD* es transferido al grupo g-amino de un resto de Lys del enzima, formando E~Lys—NH,—P—O—R—A AMP Figura 31-14 Reacciones catalizadas por la ligasa de E. coll. En las DNA ligasas de eucariotas y del fago T4, el NAD* es sustituido Por ATP, con lo que, en el primer paso de la reacciOn, se ‘elimina PP, en lugar de NMN*. un aducto fosfoamida poco comin que es, sin em- bargo, facilmente aislado. 2. El grupo adenilo del enzima activado es transferi- do al extremo 5'-fosforilo de la muesca, formando- se DNA adenilado. En este caso, el AMP se en- cuentra ligado al nucledtido en 5’ a través de un enlace pirofosfato, en lugar del habitual enlace fos- fodiéster, 3. La DNA ligasa cataliza la formacion de un enlace fosfodiéster, por ataque del grupo 3’-OH sobre el grupo 5’-fosforilo, cerrando asi la muesca y libe- rando AMP. Las DNA ligasas que requieren ATP, como las eu- cariéticas y la del fago T4, producen PP, en la primera etapa de la reaccién, en lugar de NMN*. La ligasa de T4 tiene, ademés, la peculiaridad de que, a elevadas concentraciones de DNA, es capaz de enlazar dos DNAs daplex (ligacién de extremos romos), reaccion sumamente importante en ingenieria genética (Sec- cin 28-88). 3. MECANISMOS DE REPLICACION PROCARIOTICA Los bacteri6fagos se encuentran entre las formas de vida més simples y los mecanismos de replicacion de su DNA reflejan claramente este hecho. Gran par- te de los conocimientos sobre el mecanismo de repli- cacién del DNA procede del estudio de este proceso en diferentes fagos. En esta seccién, examinamos la replicacién del DNA en los colifagos M13 y #X174 y, después, consideramos la replicacién del DNA en la misma E. coli. La replicacién del DNA eucaristico se tratara en la Seccién 31-4. A. Bacteriéfago M13 El bacteriéfago M13 posee un DNA circular mono- hebra de 6408 nucledtidos, conocido como la hebra virica o (+). Tras la infeccién de una célula de E. coli, esta hebra dirige la sintesis de su hebra complementa- tia o (~), formandose el DNA diplex circular, Hamado forma replicativa (RF), pudiendo estar en la forma superenrollada (RFD o relajada (RFID). Este proceso de replicacion (Fig. 31-15) puede ser tomado como ejemplo de sintesis de la hebra conductora en el DNA duplex. Cuando la hebra (+) de M13 entra en las células de E, coli, es recubierta por la proteina SSB, a excepcion de un segmento palindrémico de 57 nucleétidos que forma una estructura de horquilla. La RNA polimera- sa, en un proceso que requiere la subunidad ¢ para el reconocimiento del sitio de iniciacion (Seccién 29-2B), comienza la sintesis del cebador seis nuclestidos an- tes de la estructura de horquilla y extiende el RNA de 20 a 30 restos, formando un segmento de duplex hibrido RNA-DNA. El DNA, que resulta desplazadoCapitulo 31. ReplicaciOn, reparaciOn y recombinacién del DNA 1027 Hebre (4) del DNA de M13 | FA pliers Ey INGN 3 RNA cobador 1, Replicacion det ONA por la Pol II 2, Eliminacién del RNA y lenado del hueco resuitante por la Pol I 43, Sellado de la unién por la ONA ligasa 4, Superenrolamiento por la DNA grasa Figura 31-15 Sintesis de la hebra (~) del DNA de M13 sobre un molde de hebra (+), formandose el DNA de la RFI de M13. de la horquilla, es recubierto por la proteina SSB, de forma que cuando la RNA polimerasa llega a la posi- cion de SSB, termina la sintesis del cebador. A. conti- nuacién, el holoenzima de la Pol III extiende el ceba- dor de RNA alrededor del circulo, formando la he- bra (-). El cebador es eliminado por traslacion de miuesca, catalizada por la Pol I, formandose asi RFI, que es convertida a RFI por la accion secuencial de la DNA ligasa y de la DNA girasa. B. Bacteriéfago X174 El bacteri6fago #X174, al igual que M13, contiene ‘un pequefio DNA circular monohebra (5386 nuclesti- dos). Curiosamente, la conversién in vivo del DNA. virico de X174 a su forma replicativa es un proceso mucho més complejo que en el caso de M13. La replicacién de $X174 requiere la participacién de un Tabla 31-4 Proteinas del primosomat Estructura Masaen __ Moléculas Proteina _subunidades subunidades (kD) _célula n Dimero 4 80 n Monémero 76 70 n” Monémero v7 i Trimero 2 50 DnaB Hexamero 50 20 DnaC Monémero 29 100 Primasa Monémero 60 50 "El complejo de todas las proteins de primosom,excuyendo la primase; se conoce coco preprincsoma Fuente: Komberg, A. DNA Replication, 1982 Supplement p. $123, Freeman (1983), complejo proteico de casi 600 KD, conocido como primosoma (Tabla 31-4) La replicacién de la hebra (-) de #X174 es un ejemplo de sintesis de la hebra retrasada La sintesis de la hebra (-) de $X174 tiene lugar mediante un proceso de seis etapas (Fig. 31-16): 1. La secuencia de reacciones se inicia de la misma manera que en el caso de M13: la hebra (+) es recubierta con la proteina SSB, exceptuando una estructura de horquilla de 44 nuclestidos cerca de la posicién 2300. A continuacién, una secuencia de 55 nucledtidos que incluye la horquilla es recono- cida por las proteinas n, n’y n”, que se unen a ella. 2. Las proteinas i, DnaB y DnaC se afaden a este complejo, proceso que requiere ATP, formando el, preprimosoma. El preprimosoma, a su vez, une la primasa, convirtiéndose en primosoma. 3. El primosoma es empujado en la direccion 5’ -» 3’, a lo largo de la hebra (+), gracias a la hidrdlisis de ATP catalizada por n’. Este movimiento, que des- plaza a la SSB de su camino, lleva una direccién ‘opuesta a la de lectura de la hebra molde durante la elongacion de la cadena de DNA. 4. En sitios seleccionados al azar, el primosoma in- vierte la direccién de su migraci6n, mientras que la, primasa sintetiza un cebador de RNA. La it ciacion de la sintesis del cebador requiere la parti- cipacién de la proteina DnaB que, mediante la hidrélisis concomitante de ATP, se ctee que modi- fica la conformacion del DNA molde, favoreciendo Ia accién de la primasa. El holoenzima de la Pol III extiende los cebadores, formando fragmentos de Okazaki 6. La Pol I elimina los cebadores y los reemplaza por DNA. A continuacién, la DNA ligasa conecta los1028 Seccién 31-3. Mecanismos de replicaciOn procaristica 1. Reconoeimiento i Proteins |, DnaB, Dnac, de unién & ATP rmenahebva a Primasa 3. Migracién ot ADP + Py Holeerzima de la ONA polimerasa Ill, dNTPs Pol igase, grasa 4QNTPs, NADY 6, Excision Uenado del hueco, ligacin, superenralamiento Figura 31-16 Sintesis de la hebra (-) del fago ¢X174 sobre un molde de hebra (+), formandose el DNA de la RFI de #X174. [Segin Arai, K., Low, R. Kobori, J. Schlomai, J. y Kornberg, A., J. Biol, Chem. 256, 5280 (1981),] fragmentos y la DNA girasa les confiere su estruc- tura superenrollada, formando la RFI de ¢X174. El primosoma permanece formando un complejo con el DNA (Fig. 31-17), situacién en la que participa en la sintesis de la hebra (+) (ver més adelante). La replicacién de la hebra (+) de 4X174 sirve como modelo para la sintesis de la hebra retrasada Una de las hebras de un DNA diiplex circular se puede sintetizar siguiendo el modelo del circulo ro- dante o replicacién c (llamada asi por el parecido de la estructura replicativa con la letra griega sigma; Fig. 31-18). La hebra (+) del fago X174 se sintetiza sobre un molde de RFI, mediante una variacién de este proceso, el modelo del circulo rodante con lazo (Fig. 31-19): 1. La sintesis de la hebra (+) comienza con la uni6n, asistida por el primosoma, del enzima codificado por el fago, proteina del gen A (60 KD), a su sitio de reconocimiento de ~ 30 bp. Una vez. alli, la proteina del gen A corta especificamente el enlace fosfodiéster que precede el nucledtido 4306 de la hebra (+), formando un enlace covalente con su grupo 5'-fosforilo, lo que conserva la energia del enlace roto. 2, Seguidamente, la proteina Rep (Seccién 31-2C) se une ala hebra (-), a la altura de la proteina del gen Ay, con la ayuda del primosoma que continta asociado a la hebra (+), empieza a desenrollar el DNA daplex a partir del extremo 5’ de la hebra (+). La hebra (+) desplazada es recubierta con SSB, lo cual impide su reasociacion con la hebra (-). La proteina Rep resulta esencial en la replicacién del DNA de $X174, a diferencia de lo que ocurre en el cromosoma de E. coli, tal como se demuestra por la incapacidad de #X174 para replicarse en células de Figura 31-17 Micografia electrénica de un primosoma unido al DNA de la RFI del fago ¢X174. Estos complejos siempre Contienen un tnico primosoma asociado a uno 0 dos pequefios lazos de DNA. [Por cortesia de Jack Griffith, Lineberger Cancer Research Center, University of North Carolina.]Capitulo 31, Replicacién, reparacién y recombinaciém del DNA 1029 Origen I ga Figura 31-18 Modelo del circulo rodante de replicacion del DNA. La hebra (+), que esta siendo sintetizada, es extendida desde un corte especifico realizado en el origen de replicacién (1), desplazando la antigua hebra (+) (2 y 3). La sintesis continua de la hebra (+) sobre un molde de hebra (~) circular produce una serie de hebras (+) unidas fen tandem (4), las cuales pueden ser separadas mas tarde mediante una endonucleasa especifica, E, coli rep. El holoenzima de la Pol Ill extiende la hebra (+) a partir de su grupo 3’-OH libre. 3. El proceso de extensi6n genera un circulo rodante con lazo, en el cual el extremo 5’ de la antigua hebra (+) permanece unido a la proteina del gen A en la horquilla de replicacion. Se cree que, a medi- da que la antigua hebra (+) se separa de la RE, el primosoma sintetiza los cebadores que se necesita- rin para la generacion posterior de una nueva hebra (-). 4. Una vez que la protefna del gen A ha dado toda la vuelta al circulo siguiendo la hebra (-), realiza un nuevo corte especifico en el origen de replicacién, con el fin de unirse covalentemente al extremo 5’ de la nueva hebra (+). Simultaneamente, el grupo 3'-OH terminal recién formado de la antigua hebra (#), la cual forma parte del lazo, ataca nucleofilica- mente el enlace 5-fosforilo con la proteina del gen. A, liberando asi la hebra (+) cerrada covalentemen- te. Resulta evidente que la proteina del gen A debe tener dos sitios activos que se alternan en su union, a los extremos 5’ de las sucesivas hebras (+) sinteti- zadas. La horquilla de replicacién progresa alre- dedor del circulo duplex, produciendo nuevas he- bras (+). En las etapas intermedias de una infeccion por el fago @X174, cada hebra (+) recién sintetizada dirige la sintesis de la hebra (-), formando la’RFI como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, en los tltimas etapas de la infeccién, las nuevas hebras (+) se empa- quetan dentro de las particulas viricas. C. E. coli El cromosoma de E. coli se replica desde un tinico origen de replicacion, siguiendo el modelo ® bidireccio- nal (Seccién 31-14). El modelo mas plausible para los suicesos que tienen lugar en la horquilla de replicacion de E. coli (Fig. 31-20) proviene, en gran parte, de estudios sobre los mecanismos de replicacion del DNA de colifagos, tales como M13 y éX174, mucho més sencillos y mas abordables experimentalmente. EI DNA diplex es desenrollado por la proteina Rep, en la hebra conductora del molde, en colaboracién con la helicasa Il y el primosoma, en la hebra retrasa- da. Una vez separadas, las dos hebras sencillas son recubiertas inmediatamente por SSB. La sintesis de la hebra conductora esta catalizada por el holoenzima de la Pol III, asi como la sintesis de la hebra retrasada después del cebado por la primasa asociada al primo- soma, Parece ser que tanto la sintesis de la hebra conductora como de la hebra retrasada tienen lugar en una tinica particula multiproteica, el replisoma. De esta forma, la hebra retrasada adquiere una estruc- tura de lazo (Fig. 31-20). Después de completar la sintesis de un fragmento de Okazaki, el holoenzima situado en la hebra retrasada se traslada a un nuevo cebador cerca de la horquilla de replicacion, El ceba-1030 Seccién 31-3. Mecanismos de replicacion procariética RF con primosoma asoclad a Protena del gen A Proteina del gen & origen & Rep, SSB, IL ete 2 & oS Dap n Figura 31-19 Sintesis de la hebra (+) del fago ¢X174 mediante el modelo del circulo rodante con lazo. dor que encabezaba el fragmento de Okazaki previa- mente sintetizado es eliminado mediante traslacion de muesca, catalizada por la Pol I, y la muesca se cierra por accién de la DNA ligasa. La replicacién del DNA de E. coli se inicia en oriC por un proceso mediado por la proteina DnaA El origen de replicacion del cromosoma de E. coli consiste en un tinico segmento de 245 bp, conocido como el locus oriC. Esta secuencia, cuyos segmentos estén muy conservados entre las bacterias gram- negativas, sostiene la replicacién bidireccional en los diversos plésmidos en que ha sido insertado. Basan- dose en experimentos con estos plasmidos, Kornberg Propone que el inicio de replicacién en E, coli ocurre siguiendo el siguiente proceso que consta de varias etapas (Fig. 31-21): 1, La proteina DnaA (52 kD) reconoce y se une hasta a cuatro tepeticiones de 9 bp en oriC, formando, ‘como indican los experimentos de proteccién fren- te a DNasal y microscopia electronica, un complejo con el DNA de oriC superenrollado negativamen- te, que envuelve un nucleo central de 20 a 40 monémetros de la proteina DnaA. Este proceso viene facilitado por la proteina HU, semejante a las histonas. 2. A continuacién, las subunidades de la proteina Dna abren sucesivamente las hebras de tres seg- ‘mentos ricos en AT, repetidos en tandem, de 13 bp (la secuencia consenso es 5'-GATCTnTTaTTTT~ donde n indica posiciones no especificas) y locali- zados cerca del limite “izquierdo” de oriC. La exis- tencia del complejo abierto resultante, de ~ 45 bp, se establecié a partir de la sensibilidad a la nuclea- sa Pl, una endonucleasa especifica para hebras, sencillas. La formacin de este complejo abierto requiere la presencia de la proteina DnaA y de ATP (el cual es fuertemente unido por la proteina DnaA, hidrolizandolo en una reaccién dependien- te de DNA) y tiene lugar tnicamente por encima de 22 °C (al menos, in vitro ). No cabe duda que la riqueza en AT de las repeticiones de 13 bp facilita el proceso de separacién de las hebras del DNA. Después, la proteina Dna guia un complejo for- mado por las proteinas DnaB y DnaC hacia la region con el DNA abierto, formando el denomi- nado complejo pre-iniciador. 4, En presencia de SSB y de girasa, la proteina DnaB, que posee actividad helicasa, desenrolla ain mas el DNA en el complejo pre-iniciador en ambas direcciones, permitiendo asi la entrada de la pri- masa y de la RNA polimerasa. La participacion de ambos enzimas en la sintesis de los cebadores de la hebra conductora (Seccién 31-1D), junto con la li- mitaci6n de este proceso al sitio oriC, sugiere que la RNA polimerasa debe activar a la primasa para que ésta sintetice al cebador. Ello podria explicar laCapitulo 31, Replicacién, reparacién y recombinacién del DNA 1031 Holoenzima de la DNA polimerase IIL @ Sse, Hebra conductora SWWWWWWY RNA cebador Fragrento de Okazaki reciente o WIWVUWWUWUWW Proteina Rep WWW WUWWUWUIUN. & Helicasa II TOODIOKYX 3 Hebra retraced WIMIWINIVIN Primasoma sintetizando tun nuevo RNA cebador o FS OWUIWUWUVWINIWVIVD Figura 31-20 Replicacién del DNA de E. col. (a) El replisoma del DNA. de E. coll, que se cree contiene dos holoenzimas de la Pol Il, sintetiza tanto la hebra conductora como la hebra retrasada. El molde de la hebra retrasada debe formar tun lazo para permitir que el holoenzima extienda la hebra retrasada, iniciada por el primosoma, (b) El holoenzima libera el mode de la hebra retrasada cuando similitud de los 13 nucledtidos ricos en AT del oriC con los promotores transcripcionales de la RNA. polimerasa (Seccién 29-28). Todo esta a punto para la replicacion bidireccional del DNA mediante el holoenzima de la Pol Il, tal como se ha descrito anteriormente. Helicasas de E. coli Se conocen diez enzimas de E. coli que poseen actividad helicasa. Cada uno de ellos parece tener en Ja célula una funcion especifica dirigida a facilitar procesos como la replicacién, reparacion y recom- binacion del DNA, asi como también la transcrip- DIVING Fragmento de Okazaki completo NING RNA cebador a sustituir por DNA mediante la Po! I; rmuesca sellada or la DNA ligasa Fragmento e Okazaki cecién Antiguo fragmento 6 Okazaki encuentra con el fragmento de Okazaki previamente sintetizado. Ello probablemente sirve de sefial para que ‘el primosoma inicie la sintesis del RNA cebador de la hebra retrasada. (c) El holoenzima se une de nuevo al molde de la hebra retrasada y extiende el RNA cebador, formando un nuevo fragmento de Okazaki. Obsérvese que, en este modelo, la sintesis de la hebra conductora, esté siempre mas avanzada que la de la hebra retrasada. cion del RNA. Estos enzimas, los cuales son todos ATPasas dependientes de DNA monohebra, incluyen la proteina UvrABC, que participa en la reparacion por escisién del DNA (Seccién 31-5B), la proteina RecBCD, que interviene en la recombinacién general (Geccién 31-64), el factor rho, el cual finaliza la trans- cripcién desenrollando la hélice de DNA « RNA en la burbuja de transcripcién (Seccién 29-2E) y varias pro- teinas mas que seran discutidas con detalle mas ade- lante, Diversas pruebas circunstanciales han sugerido que la helicasa Il (producto del gen worD), junto con la proteina Rep (producto del gen rep) participan en la propagacién de la horquilla de replicacién en E. coli1032, Seccién 31-3. Mecanismos de replicacién procaridtica aaa woe 3 rn ‘it Sau. 1 oD Mr-onan core | 20 abe sma corse sow Sensis a PL l jee onec | ATP coreio Sensiies a P14 Iniciacion y replcacion Figura 31-21 Modelo del inicio de la replicacién del DNA en oriC. (1) Las proteinas DnaA se unen a los cuatro 9-meros, de manera que oriC, convenientemente superenrollado, envuelva un nicleo proteico de 20 a 40 subunidades. (2) continuacién, las tres repeticiones de 13 bp, ricas ‘en AT, se abren en una reaccién impulsada por ATP, formando un complejo abierto, al cual (3) se une el ‘complejo DnaB-DnaC. (4) El complejo abierto es desenrollado aun mas mediante la actividad helicasa de la proteina DnaB, preparando de esta manera el ‘complejo para el inicio y la replicacién bidireccional. {Seguin Bramhil, D. y Kornberg, A., Cell §2, 752 (1988) (Geccién 31-2C). Por ejemplo, la helicasa II estimula Ia replicacion del DNA in vitro, en un proceso que esta activado por la proteina Rep y en el que los mutantes dobles rep/uvrD parecen ser inviables. Sin embargo, muchos de los fenotipos correspondientes a los mutantes wvrD, como pueda ser el aumento de sensibilidad hacia la radiacion UV y otros agentes que danan el DNA, implican a la helicasa II en los proce- 0s de reparacién y/o recombinacién. Las células de E. coli portadoras de genes rep mutantes son viables, si bien sus horquillas de replicacién parecen propa- garse mas lentamente de lo que es habitual en las células de la estirpe salvaje. De ahi que el papel fisiolégico de la proteina Rep en E. coli siga siendo desconocido (aunque se sabe seguro que participa en la replicacion del tipo circulo rodante del DNA de la RFI del fago X174 [Fig. 31-19). Recientemente, se ha demostrado que las proteinas de E. coli responsables de la desenrollamiento del DNA en la horquilla de replicacion son la proteina n’ (también conocida como proteina PriA, ya que es el producto del gen priA), que es una helicasa 3’ > 5’, y la proteina DnaB, que es una helicasa 5’ > 3", ‘Ambas proteinas son componentes del primosoma, el cual se cree que se une al molde de la hebra retrasada en la horquilla de replicacion y, por ello, esta obliga- do a avanzar en la direccién 5’ — 3 (Fig. 31-20). Asi pues, el desenrollamiento del DNA, por delante del avance de la maquinaria de replicacion (el repliso- ma), requeriria la accién de una helicasa 5’ -» 3’, como la proteina DnaB. Por tanto, se ha sugerido que Ja proteina n’ funcionaria como una translocasa, ha- ciendo pasar el lazo que forma el molde de la hebra retrasada a través del replisoma en la direccion 3’ + 5’, manteniendo asi el tamario del azo a medida que el replosoma avanza en la direccién 5’ —» 3’ La iniciacién de la replicacion del DNA de E. coli esta finamente regulada La replicacién del cromosoma en B. coli tiene lugar una sola vez en cada divisién celular, por lo que este proceso debe estar fuertemente controlado. El tiempo de division de E. coli a 37 °C varia segun las condiciones de crecimiento desde < 20 min hasta ~ 10 h. Sin embargo, la velocidad del movimiento de cada hor- guilla de replicacion es constante e igual a ~ 850 nu- cledtidos/s, 1o que fija el tiempo de replicacién cro-1034 Seccién 31-3. Mecanismos de replicacién procariética @ o Fou 3124 Si una DNA polimerasa pudiera sintetizar DNA en direccién 3° > 5': (a) El acoplamiento de cada ucle6sido trifosfato a la cadena creciente estaria, tales como el motivo hélice-giro-hélice (Seccién 29- 3C) 0 el dedo de zinc (Seccién 33-3B). La observacion de que cuando la proteina Tus se fusiona a una se- gunda proteina de unién al DNA, la replicacion es inhibida en el sitio de unién de la segunda proteina, sugiere que la proteina Tus no actia como una simple gtapa, sino que interacciona con la proteina DnaB inhibiendo su accién helicasa. Curiosamente, el gen tus empieza s6lo 10 bp corriente abajo del sitio TerB, lo cual sugiere que la transcripcion de tus esta auto- regulada D. Fidelidad de la replicacion Si un tnico polipéptido, tan pequeito como el frag- mento Klenow de la Pol I puede replicar el DNA por si solo, gpor qué E. coli mantiene una serie de > 20 pro- teinas coordinadas entre si para replicar su cromoso- ma? Al parecer, la respuesta es para asegurar Ia casi perfecta fidelidad de Ia replicacién del DNA, requerida para conservar la integridad del mensaje genético de generaciin en generaci6n. Las velocidades de reversion de los mutantes de E, coli o del fago T4 a la estirpe salvaje indican que solo, ocurre un error de apareamiento por cada 10* a 10" pares de bases replicados. Ello corresponde a ~ 1 error por cada 1000 bacterias y por generacién. Esta gran precision en la replicacion es debida, en parte, a las funciones exonucleasa 3’ > 5’ de la Pol Ty de la Pol III, que detectan y eliminan los errores ocasiona- les producidos por su funcién polimerasa. De hecho, las mutaciones que aumentan la actividad exonuclea- sa correctora de las DNA polimerasas disminuyen las tasas de mutacién de otros genes. La incapacidad de una DNA polimerasa para iniciar la elongacién de una cadena sin un cebador parece ser un factor que aumenta Ia fidelidad de Ia replicacin del DNA. Los primeros nucledtidos de una cadena, que se et ony e Pep, pep, |p| oH, a poo, P| p |e. impulsado por la hidrélisis del nucledsido trifosfato unido previamente. (b) La eliminacién de un nucledsido trifosfato 5'-terminal incorrecto haria imposible continuar la elongacién de la cadena de DNA. esta formando, son los que més frecuentemente pue- den estar desapareados, debido a la naturaleza coope- rativa de las interacciones en el apareamiento de las bases (Seccion 28-3). Igualmente, la correccin de un oligonucledtido daplex corto es un proceso sujeto a errores. E] uso de cebadores de RNA elimina esta fuente de error, ya que el RNA es sustituido al final por DNA, en unas condiciones que permiten un apa- teamiento de bases preciso. Nos podemos preguntar por qué las células en su evolucién han mantenido un sistema complejo de sintesis discontinua mediante hebras retrasadas, en lugar de una DNA polimerasa que pudiera simple- mente extender las cadenas de DNA en la direccién 3’ — 5’. Si consideramos la quimica de la extension de la cadena de DNA, podemos observar que este Moss Preparacion_y division para la mitesis celular 26h Th Preparacién Repicacin para a GelONA- —repicacién 68h del DNA. Quiescencia variable) Figura 31-25 El ciclo de la célula eucaridtica. Las células en G, pueden entrar en la fase de quiescencia (Go), en lugar de seguir el ciclo.Capitulo 31. Replicacion, reparacién y recombinacion del DNA 1035 Proceso también conduce a una elevada fidelidad en la replicacion. La unién de 5'-desoxinucle6tido trifos- fatos en direccion 3’ > 5’ requeriria la conservacion del grupo trifosfato 5’-terminal de la cadena creciente para facilitar el siguiente paso de acoplamiento (Fig. 31-242). Después de corregir un nucledtido 5’-termi- nal desapareado (Fig. 31-248), esta supuesta polime- rasa podria, andlogamente a la Pol I, por ejemplo, climinar el nucledtido erréneo, dejando un grupo 5’-OH o bien un grupo 5’-fosfato. Ninguno de es- tos grupos terminales puede proporcionar la energia necesaria para continuar la extension de la cadena. Por la misma raz6n, una DNA polimerasa 3° -> 5” correctora tendria que ser capaz de reactivar su pro- ducto corregido. La complejidad inherente de este sistema, probablemente, ha sido un factor decisivo para que no fuera escogido durante la evolucién. Cualquier error que permanezca en un DNA da- plex despues de su replicacion o que aparezca poste- tiormente, debido a ataques quimicos y/o fisicos, puede ser corregido mediante diversos procesos de reparacion del DNA (Seccién 31-5). Estos capacitan a Ja célula para mantener su herencia genética durante su ciclo vital 4, REPLICACION DEL DNA EUCARIOTICO Cada vez parece mas evidente Ia existencia de un elevado grado de similitud entre los mecanismos de re- plicacién del DNA en procariotas y eucariotas, Existen, sin embargo, diferencias significativas entre estos dos sistemas de replicacién, como consecuencia de la mu- cho mayor complejidad de los eucariotas en compara- cion con los procariotas. En esta seccién considerare- mos estas diferencias. A. El ciclo celular El ciclo celular, la secuencia general de sucesos que ocurren durante la vida de una célula eucaristica, se divide en cuatro fases distintas (Fig. 31-25): 1. La mitosis y la division celular ocurren durante la fase M (de mitosis), que es relativamente corta. 2. Esta fase es seguida por la fase G, (de ‘gap’, intervalo), la cual representa la parte més larga del ciclo celular. 3. La fase G, da paso a la fase S (de sintesis). Esta fase, a diferencia a lo que ocurre en procariotas, ¢s el iinico periodo durante el ciclo celular en que se sintetiza DNA. 4, Durante la fase G,, relativamente corta, la ahora célula tetraploide se prepara para la mitosis. A continuacién, se entra de nuevo en la fase M y asi empieza una nueva vuelta del ciclo celular. El ciclo de las células en cultivo ocupa normalmen- te un periodo de 16 a 24 h. En cambio, la duracién del Ciclo celular de los diferentes tipos celulares de un organismo pluricelular puede variar entre sélo 8 h y >" 100 dias. Esta variacién se debe, en su mayor Parte, a la fase G;. Ademés, la mayoria de células diferenciadas terminalmente, como las neuronas 0 las células musculares, nunca se dividen; adquieren un estado quiescente 0 de reposo, que se conoce como la fase Gy La “decision” irreversible de proliferar, por parte de la célula, se realiza durante G,. La quiescencia se mantiene si, por ejemplo, los nutrientes se agotan 0 si la célula entra en contacto con otras células (inhibi cin por contacto). Por el contrario, la sintesis de DNA puede inducirse por diversos agentes, tales como carcinégenos 0 virus tumorigenos, los cuales desencadenan la proliferacién celular incontrolada (cancer; Seccién 33-4C); la extirpacién quirargica de un tejido, que puede resultar en una répida regenera- ci6n; 0 por proteinas conocidas como mitégenos, que se unen a los receptores de superficie celulares € inducen de algin modo la division celular. Las células en crecimiento contienen factores citoplasmaticos que estimulan la replicacién del DNA. Por ejemplo, los, extractos de huevos de rana inducen la sintesis de DNA en células del bazo de rana. No obstante, el modo de accién de estos factores es hasta ahora des- conocido (sin embargo, véase mas adelante). Tabla 31-5 Propiedades de las DNA polimerasas de animales a 8 Y 8 Localizacion Niicleo Naicleo Mitocondria Nacleo ‘Masa (kD) 120-220, 30-50 150-300 140-160 Inhibidores: Afidicolina Si No No Si Didesoxi NTPs Debi Fuerte Fuerte Debil Arabinosil NTPs Fuerte Debit Débil Fuerte Fuerte Debi Fuerte Fuerte N-Etilmaleimida (NEM)' + Reacciona con las dsteinas (Tabla 6-3). Fuente; Principalmente Kornberg, A., DA Replication, p. 208, Freeman (1980)