Polymerase Chain Reaction PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) : TEKNIK DAN APLIKASINYA DI BIDANG KEDOKTERAN GIGI Elzal A dan Solachuddin J. Arief I. * Bagian Biologi Oral Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Abstrak Makalah ini’ membahas kemampuan PCR dalam menggandakan DNA dalem_upaya ‘memperbanyak sampel yang sangat sedikit yang dibutuhkan untuk berbagai tujuan seperti misalnya kkeperiuan diagnostik di bidang kedokteran gigi. PCR adalah suatu teknik penggandaan DNA in vitro yang secara Ivas telah dikenal sebagai suatu metode biologi-molekuler. Diperlukan DNA cetakan, primer, dNTP dan DNA polimerase , kemudian campuran ini akan dipapar dalam tiga macam subu dalam beberapa siklus secara berulang-ulang guna memperbanyak DNA. Satu siklus terdiri dari denaturasi double stranded DNA, annealing dan ekstensi schingga DNA diperbanyak dua kal. Sesudah siklus ke -n kali, jumlah DNA akan diperbanyak 2° kali, Abstract ‘This paper reviewed the ability of Polymerase Chain Reaction (PCR) in multiplying DNA in order to amplify an extremely small amount of sample using an in-vitro chemical reaction which is needed for various purposes such as diagnostic in dentistry Polymerase chain reaction (PCR) is a technique of amplifying DNA in vitro which has been widely recognized as a powerful molecular-biology method. DNA template primers, €NTP and DNA polymerase are needed, and this mixture will be exposed to three different temperatures for several cyces to multiply the DNA. The cycle consists of denaturation of double stranded DNA, annealing, and an extention phase ‘which then will multiply the DNA twice. After n times of cycles, the amount of DNA will be multiplied 2” times Pendahuluan Pesatnya perkembangan ——_ilmu pengetahuan dewasa ini telah merebak. ke berbagai cabang bidang ilmu, termasuk imu Kedokteran gigi. Saat ini kita menganalisis segala sesuatu yang lebih kecil daripada sekedar sel dan kita telah memasuki era molekuler pada tingkat DNA. Analisis molekuler pada saat ini telah banyak dilakukan sebagai salah satu cara pendekatan baik dalam ilmu kedokteran gigi dasar, forensik, maupun Klinik. Sebagian besar penyakit-penyakit gigi dan rongga mulut merupakan inféksi, Pada sebagian besar infeksi, kesembuhannya sangat ditentukan oleh diagnosis secara dini serta tindakan —tepat_ = dan—segera_— dalam. penanggulangannya. Akan tetapi ada kendala yang masih harus dihadapiyaitu tidak tersedianya alat diagnostik yang memenuhi persyaratan. Cara yang paling tepat guna menentukan adanya infeksi yaitu dengan cara mendeteksi adanya bakteri, virus atau Komponennya ( faktor-faktor virulensinya ) yang paling spesifik didalam sel atau jaringan yang berasal dari penderita. Saat ini dimungkinkan ‘untuk merancang probe DNA guna pendeteksian bakteri atau virus yang menyebabkan penyakit- penyakit infeksi gigi dan rongga mulut, disamping mendeteksi kelainan genetik. ** Jummal Kedokteran Gigi Universitas Indonesia, Vol.5.No.1.,1998 B‘Seringkali, mengingat jumlah sampel yang sangat sedikit, kita perlu memperbanyak DNA guna ‘mempermudah pendeteksian Teknologi DNA sccara luas telah digunakan sebagai penunjang dalam pengelolaan berbagai penyakit genetik maupun infeksi, dengan sensitifitas dan spesifisitas yang tinggi. Dalam —perkembangan biologi molekuler terdapatnya teknik teknik yang relatif baru seperti PCR (Polymerase chain reaction) , ‘molecular cloning, southern blotting, western blotting, nothern blotting, DNA sequencing, DNA hibridization, pulsed field gel electrophoresis dan lain-lain,' yang dapat ‘memberikan kemudahan serta__ menambah wawasan cara berfikir dalam melakeukan pendckatan problem yang fundamental maupun aplikasinya dalam bidang kedokteran gigi. PCR (Polymerase Chain Reaction) sendiri mulai dikembangkan pada pertengahan 1980an oleh Kary Mullis (Lewis). Dengan PCR dapat dikopi suatu jumlah yang tidak terbatas ari sekuen gen individu secara in vitro tanpa perlu di klon. Teknik ini sangat berguna untuk sampel dalam jumlah —sangat —_sedikit. Persyaratannya adalah sekuens basa dari gen yang akan dikopi harus diketahui dan berdasarkan atas informasi ini primer DNA dapat disintesis secara kimia yang akan berkomplementer dengan sekuens yang berlokasi pada kedua ujung gen target.'* Makalah ini membahas prinsip dasar_metode PCR serta penggunaannya dalam bidang kedokteran gigi DNA (Deoxi ribonucleic acid ) Sebenamya, setiap aktifitas yang terjadi didalam sel hidup hanya mungkin terjadi karena adanya informasi yang diturunkan yang telah disandi / dikode daiam molekul DNA. Informasi yang dibawa molekul DNA dapat dibagi atas sejummlah unit-unit yang terpisah yang dikenal sebagai gen. DNA adalah komponen dasar kromosom dan merupakan materi genetik pengkode protein, DNA yang mengandung informasi genetik tersebut terdapat di dalam inti sel, berupa gen-gen yang terkandung di dalam kromosom, atau lebih spesifik lagi dalam urutan Polymerase Chain Reaction nukleotida pada gen, yang akan dipindahkan pada mRNA ( messenger ribonucleic acid ). Selanjutnya mRNA akan keluar dari inti dan membawanya kepusat-pusat sintesis protein yaitu endoplasmik —retikulum dan nbosom di sitoplasma untuk mengalami proses translasi menjadi berbagai macam protein °”** Setiap urutan tiga mukleotida disebut kodon dan urutan kkodon akan menentukan urutan asam amino di dalam protein nantinya, Unsursunsur utama yang terdapat di dalam DNA, temyata bersifat universal, yakni dikandung oleh semua jenis organisme, sehingga memungkinkan dilakukannya rekayasa genetika, yaitu mengutak-atik gen dan memindahkan potongan gen-gen dari satu organisme ke corganisme lainnya, baik pada spesies yang sama. ataupun yang berbeda. °”* Setiap kali organisme direproduksi, instruksi_ yang == menuntun. perkembangan suatu organisme baru harus diturunkan dari orang tua kepada turunannya.® Mikroorganismepun memiliki informasi genetika yang sangat spesifik untuk dirinya, yang dapat membedakannya dari Famili, Genus, spesies bahkan strain maupun tipe lainnya. Teknik dan Prinsip PCR PCR adalah suatu metode biomolekuler yang canggih untuk perbanyakan segmen DNA spesifik secara in vitro, melalui suatu proses enzimatik dengan menggunakan exzim DNA polimerase dan primer nukleotida yang akan berhibridisasi dengan bagian DNA dari dua arah yang berlawanan. Dengan penggunaan teknik ini dapat diamplifikasi suatu segmen DNA diantara dua regio yang diketahui sekuennya, Sintesis serat_bara DNA bermula dengan terjadinya hibridisasi DNA primer secara spesifik pada bagian tertentu rangkaian DNA target yang akan dijadikan sebagai cctakan. Mengingat cetakan berupa DNA berserat ganda, maka dibutuhkan sepasang primer untuk menyalin kedua serat tersebut, Agar kedua serat baru hasil penyalinan tersebut dapat saling komplementer, diperlukan sepasang primer yang akan berhibridisasi pada dua daerah berlainan yang mengapit bagian DNA yang akan digandakan. ” Jurnal Kedokteran Gigi Universitas Indonesia, Vol.5.No.1.,1998 44Polymerase Chain Reaction Persyaratan penting untuk amplifikasi DNA adalah urutan / sekuens nukleotida pada kedua ujung ( sekuens yang mengapit kedua ujung_) harus diketahui.'? Pertama-tama DNA. cetakan akan di denaturasi dengan jalan pemanasan (94°) didalam campuran ‘yang juga berisi dua jenis primer oligonukleotida ,enzim DNA. polimerase dan empat macam ANTP (deoxyribonucleoside triphosphates) dalam jumlah berlebihan. Campuran reaksi tersebut- kemudian didinginkan sampai temperatur tertentu .(37°-56") yang» akan menyebabkan primer berhibridisasi ( anneal ) dengan sekuens target, kemudian apabila temperatur dinaikan lagi (72°-76°) _proses annealing tethenti dan proses extension dimulai, primer yang telah berhibridisasi akan diperpanjang dengan bantuan DNA polimerase. Demikianlah siklus denaturasi - annealing dan sintesis DNA akan berulang_ terus-menerus sampai didapat jumlah DNA yang diinginkan. Jumlah fragmen DNA tersebut akan bertambah secara exponential, misalnya suatu segmen DNA diamplikasi sebanyak 30 siklus replikasi, sctara teoritis akan dihasitkan 2°° fragmen turunannya, Schingga dalam beberapa jam jumlah DNA dalam nanogram dapat diperbanyak jutaan kali yang dapat menghasilkan bebcrapa miligram DNA yang dapat dengan mudah dipelajari. Hal ini dapat terjadi karena tersedianya primer dan ‘enzim polimerase yang berlebihan, maka produk dari siklus pertama dapat berfungsi sebagai cetakan untuk siklus berikutnya — demikian seterusnya. PCR telah dipermudah_—_ dengan penggunaan heat-stable enzyme taq polymerase dari Thermophilus aquaticus dan dilengkapi dengan pengatur suhu yang otomatis. Kekuatan PCR. bergantung pada tingginya sensitifitas pengikatan primer pada sekuens DNA target selama reaksi annealing. Pada penanganan sampel harus diperhatikan agar tidak terjadi kontaminasi. Mengingat kontaminasi DNA asing yang sangat kecil sekalipun dapat menyebabkan kesalahan yang besar ( positif palsu ) * sedangkan negatif palsu dapat diakibatkan oleh jumlah primer yang tidak adekuat ."* Aplikasi Polymerase Chain Reaction (PCR) Apabila dalam upaya _mendiagnosis suatu penyakit dengan menggunakan_teknologi DNA terlalu sedikit jumlah sampel yang tersedia, diperlukan suatu tindakan memperbanyak salinan DNA melalui proses sintesis yang akan dilakukan secara berulang dengan menggunakan suatu teknik yang dikenal sebagai teknik PCR“? Sampel dapat diambil dari cairan usi, saliva, gigi, spesimen patologik, sel mukosa ataupun jaringan mulut lainya, guna keperluan diagnostik, deteksi keganasan, —_ataupun ‘identifikasi individu pada kasus-Kasus forensik, PCR dapat digunakan bilamana isolasi dan analisis DNA dibutuhkan, ketika sekuens ‘genom target diketahui. PCR dapat digunakan untuk mengisolasi dan melabel fragmen DNA, ‘menganalisis interaksi protein-DNA, sekuens DNA-RNA dan manipulasi terapi gen Aplikasinya dalam bidang Kedokteran Gigi sangat Iuas Karena teknik ini dapat diterapkan pada spesimen yang telah difiksasi dengan formalin atau tertanam dalam perafin. Agen - agen infeksi kulit, jaringan dan lesi_ mukosa mulut dapat dideteksi, seperti bakceri, virus HIV, hepatitis, cytomegalovirus dan Epstein Barr virus. PCR juga dapat digunakan dalam ‘mendetcksi DNA Herpes simplex virus (HSV) dalam Iekosit yang bersirkulasi pada penderita herpes labialis rekuren yang akut dan lain-lain. ‘Dengan semakin banyaknya dapat di klon dan di sekuens gen-gen yang bertanggung jawab atas fenotip Klinis semakin meningkat pula enggunaannya teknik PCR untuk mendiagnosis dan memonitor pengobatan beberapa penyakit. PCR dapat pula digunakan sebagai suatu marker untuk menentukan sidik DNA spesifik untuk tumor malignan tertenta dan memonitor adanya sel-sel neoplastik selama pengobatan dengan anti kanker. Penggunaan PCR juga penting dalam penentuan adanya virus dalam lesi-lesi oral premalignan. Kesimpulan PCR merupakan suatu metode yang sederhana, cepat dan sangat potensial dalam proses perbanyakan DNA terutama pada keadaan jumlah sampel yang mengandung sangat sodikit Jurnal Kedokteran Gigi Universitas Indonesia, Vol.5.No.1.,1998, 45DNanya. PCR digunakan untuk mensintesis DNA secara in vitro dengan proses enzimatik ‘menggunakan 2 primer oligonukleotida yang, akan berhibridisasi dengan rantai tunggal DNA target. Perbanyakan (amplifikasi) DNA dilakukan dengan sikiusberulang yang melibatkan rangkaian reaksi-reaksi denaturasi DNA. template, hibridisasi primer, proses perpanjangan / elongasi DNA (extension) yang kemudian akan menghasilkan fragmen DNA yang spesifik. Dewasa ini teknik PCR telah digunakan secara meluas diberbagai bidang termasuk bidang Kedokteran gigi Kepustakaan 1. Kocher TD & Wilson AC. DNA amplification by polymerase chain reaction.n’ Essential ‘Molecular Biology a practical approach volume TI. 1% ed. Oxford: IRL Press,1994 : 185-207. 2. Epplen JT. Et al . On the potential of simple repetitive DNA for fingerprinting in clinical, forensic and evolutionary dynamic studies, Clin Invest 1992;70(11):1043-51. 3. Ibrahim E. Aplikasi analisis DNA dalam Bidang Forensik. JDU/ 1995; 263): 21-6. 4, Tenover FC. Diagnostic deoxyribonucleic acid probes for infectious diseases. Clin Microbiol Rey 1988;1:82-101 5. Hyypia T, Huovinen P, Holmberg M & Petterson UL Nucleic acid probes in the diagnosis of human microbial pathogens. In: Symons RH, eds. Nucleic acid probes. Boca Raton: CRC Press Inc, 1989: 81-112. 6. Kleinsmith LI & Kish VM, The flow of genetic information. In: Principles of Cell and ‘Molecular Biology 1995. 2" ed. New York Harper Collins College Publishers: 105, 7. Scebandrio AWK. Seminar Pelatihan Biologi Molekuler Bagi Klinisi, FKUL 22-24 April 1997. Polymerase Chain Reaction 8, Tjokronegoro A. Kemajuan IPTEK Kedokteran, Biologi Molekular dan Bioteknologi, M7 1994, 44: 725-728. 9. Alberts B et al. Macromolecules : Stucture, Shape, and Information. In: Molecular Biology of the Cell . 3° ed, New york: Gardland Publishing, Inc 1994 : 99-111. 10.Mouton C & Menard C. DNA fingerprinting of Porphyromonas gingivalis by acbitrarily primed PCR. In : Robert Genco etal eds Molecular pathogenesis of periodontal disease. Washington DC: ASM Press,1994 :33-46, I.Janeway CA & Travers P. The Polymerase chain Reaction. In: Immunobiology The Immune System in Health and Disease. 3" ed. New york: Gardland Publishing Inc, 1997: 2:42, 12Ficarra G & Eversole LR. Polymerase chain reaction : relevance for oral pathology. Min ‘Stomatol 1992 ; 41(10) : 425-9. Jurnal Kedokteran Gigi Universitas Indonesia, Vol.5.No.1.,1998 46