Vjeba broj 9

ODREIVANJE AKTIVNOSTI ENZIMA: -AMILAZE I KATALAZE

1. TEORETSKI DIO

Postoji niz metoda za odreivanje aktivnosti amilaze. Prema njihovom principu mogu se podijeliti na
slijedee grupe:

- Viskozimetrijske metode (zasnivaju se na smanjenju viskoznosti rastvora kroba zbog

hidrolitikog djelovanja amilaze);
- Saharogene metode, zasnivaju se na odreivanju reduktivnih spojeva koji nastaju hidrolizom
kroba. Ove metode nisu precizne;
- Hromogene metode, koriste se u proteklih 20-tak godina, a zasnivaju se na djelovanju
amilaze na krob ili amilozu ili amilopektin koji su kovalentno vezani (eterski ili esterski) za
neku boju koja je derivat trijazina, koja se oslobaa pri hidrolizi kroba (amiloze ili
amilopektina) , centrifugiranjem odvaja i mjeri fotometrijski;
- Nefelometrijske metode, zasnivaju se na smanjenju zamuenosti reakcione smjese kroba i
ispitivanog materijala (urin, plazma, pljuvaka) nakon hidrolize kroba;
- Spektrofotometrijske i fluorimetrijske enzimske metode u kojima se prati oksidoredukcija
nikotinamidadenin dinukleotida (NAD-a);
- Fotometrijske metode sa sintetskim supstratima iji se razgradni produkti mogu mjeriti
fotometrijski, kontinuirano. Takvi su supstrati razni: p-nitrofenilni i Cl-p-nitrofenilni maltozidi
(u obliku testova). To su najnovije i dosta precizne metode. Zamjenjuju klasine metode zbog
toga, to hidrolizom kroba pod djelovanjem amilaze nastaju produkti koji nisu tano
definirani u datom momentu (amilo-, eritro-, ahromodekstrini);
- Amiloklasine metode-zasnivaju se na svojstvu kroba ili amiloze da sa jodom daju plavi
produkt (amilopektin sa jodom daje ljubiastu boju). Djelovanjem amilaze na krob nastaju
prvo amilodekstrini (sa jodom daju plavoljubiastu boju), zatim eritrodekstrini (sa jodom daju
crvenu boju), ahromodekstrini (ahrodekstrini) sa jodom se ne boje U grupu amiloklasinih
metoda ubraja se i metoda odreivanja amilaze po Wohlgemuth-u.

Prva metoda za odreivanje aktivnosti amilaze koja se zasniva na tome koje razrijeenje uzorka jo
razgrauje krob, pa se dodatkom joda (Lugolovog rastvora) ne javlja plava boja. Metodu je uveo
Wohlgemuth kao prvu metodu odreivanja enzima u dijagnostike svrhe. Najveu dijagnostiku
vrijednost metoda je pokazala kod oboljenja pankreasa i parotitisa. Tako -amilaza iz pljuvake
(ptijalin) ima poveanu aktivnost u pljuvaci, serumu i urinu kod akutnog parotitisa (zaunjaka) ili kod
ira (ulcusa) na elucu. Amilaza iz pankreasa (dijastaza) ima poveanu aktivnost u serumu i urinu kod
akutne nekroze pankreasa u poetnom stadiju, akutnog pankreatitisa. Znaajno povienje aktivnosti
dijastaze u urinu javlja se kod upala une kese, uremije, perforacije ira na elucu, postoperativnih
stanja.

Katalaza je iroko rasprostanjen enzim i sree se kod prokariaota i eukariota. Predstavlja dio
antioksidativne zatite organizma. Katalaza razlae toksini vodikperoksid na molekul kisika i vodu.
Katalaza je tetramer sastavljen od etiri polipeptidna lanca, svaki sadri preko 500 aminokiselina.
Sadri etiri porfirinska hema, grupe koje omoguavaju enzimu da reaguje sa vodikperoksidom.
Zastupljen je gotovo kod svih organizama, poev od mikroorganizama (aerobnih i anaerobnih),
biljaka, ivotinja do ovjeka. Kod ovjeka je iroko zastupljenja posebno u elijama jetre u
peroksizomima i crvenim krvnim zrncima. Optimalni pH za ljudsku katalazu je oko 7, dok kod ostalih
organizama, u zavisnosti od vrste pH se kree izmeu 4-11. Ljudska katalaza djeluje na 37C, dok kod
nekih jednoelijskih organizama optimalna temperatura djelovanja je 90C. Osnovna uloga ovog
enzima je razgradnja vodikperoksida.

Katalaza je veoma aktivan enzim, jedna molekula katalaze konvertuje million molekula
vodikperoksida u vodu i kisik svake sekunde. Katalaza moe katalizirati i oksidaciju, pomou
vodikperoksida, razliitih metabolita i toksina, kao to su formaldehid, mravlja kiselina, fenoli,
acetilaldehid i alkoholi. Deava se slijedea reakcija, iji mehanizam je i dalje nepoznat.

H2O2 + H2R 2H2O + R

Joni tekih metala (kao to su bakarni joni) mogu da se ponaaju kao nekompeticijski inhibitori
katalaze. Otrovi, kao to su cijanidi su kompeticijski inhibitori katalaze, snano se vezuju za hem
katalaze i zaustavljaju enzimsku reakciju. Kod ovjeka i drugi enzimi mogu da razgrade vodikperoksid.
Glutationperoksidaza je u fiziolokim uslovima (mala koncentracija vodikperoksida) je ak aktivnija od
katalaze. Kada koncentracija vodikperoksida poraste ukljuuje se katalaza. Katalaza test je jedan od
tri glavna testa koji se koristi u mikrobiologiji za identifikaciju bakterija. Prisustvo enzima katalaze se
detektuje upotrebom vodikperoksida. Bakterije koje su katalaza-pozitivne dodavanjem
vodikperoksida oslobaaju kisik.

2. EKSPERIMENTALNI DIO

Odreivanje aktivnosti -amilaze

U stalak se pripremi 10 istih epruveta i u svakoj odpipetira po 1 ml fiziolokog rastvora (0,90% NaCl).
U posebnu, istu epruvetu se sakuplja profiltrirana pljuvaka bez dodatka vode radi lakeg i breg
filtriranja. Sakupi se neto vie od 1 ml, a potom odpipetira 1 ml i stavi u prvu epruvetu. Sadraj
epruvete se dobro promijea i na taj nain se dobije dva puta razblaena pljuvaka. Nakon toga se
odpipetira 1 ml tako razblaene pljuvake i stavi u drugu epruvetu. Sadraj i ove epruvete se dobro
promijea i dobije etiri puta razblaena pljuvaka. Postupak se ponavlja sve do desete epruvete iz
koje se 1 ml pljuvake izbaci. Potrebno je prilikom ovog razblaivanja pipetu kojom se pipetira i
prebacuje sadraj jedne epruvete u drugu, nakon svakog prebacivanja sadraja isprati vodom. Kada
se naprave razblaenja pljuvake, u svaku epruvetu se odpipetira po 1 ml 0,1% koloidnog rastvora
kroba. Sadraji u svakoj epruveti se promijeaju, sve se vrati u stalak i termostatira na sobnoj
temperaturi. Poslije 15 minuta termostatiranja u svaku epruvetu (od desete do prve) se doda po
jedna kap Lugolovog reagensa. U epruvetama u kojima je krob hidroliziran nema plave boje, a u
kojima nije hidroliziran pojavljuje se plava boja. Izmeu obojenih i neobojenih sadraja u epruveta
javlja se jedan koji sa Lugolovim rastvorom daje crvenu boju. Boja potie od razgradnih produkata
kroba-eritrodekstrina sa jodom iz Lugolovog reagensa. U toj epruveti razblaena pljuvaka sadri
jednu enzimsku jedinicu -amilaze, po Wohlgemuth-u. Jedna enzimska jedinica -amilaze po
Wohlgemuth-u je ona aktivnost ovog enzima pri kojoj se na temperaturi od 38 C hidrolizira 1 mg
kroba za 30 minuta, odnosno 0,00055 mg kroba za jednu sekundu. Najmanje razblaenje uzorka u
kome se za 30 minuta na temperaturi od 38 C hidrolizira jedan mg kroba do produkata koji sa
Lugolovim rastvorom ne daju plavu boju (eritrodekstrini-daju crvenu boju) sadri jednu jedinicu -
amilaze po Wohlgemuth-u (1 WJ).
Pretvaranje IU u katale:

1 kat = 1 mol/s = 60 mol/min = 60x106 mol/min = 6x107 IU

1 IU = 1 mol/min = 1/60 mol/s = 1/60 kat = 16,67 nkat

Ukoliko se kao supstrat na koji djeluje amilaza koristi krob koji ima molekulsku masu 55000, onda 1
WJ -amilaze iznosi 0,01 nkat.

Odreivanje aktivnosti katalaze

Princip odreivanja: Prema Bah-u i Oparin-u kvantitativno odreivanje katalaze zasnovano je na

osobini H2O2 koji zaostaje nakon razlonog djelovanja katalaze, da reaguje sa KMnO4 uz obrazovanje
slobodnog kisika. Jednaina ove reakcije je slijedea:

2KMnO4 + 5H2O2 + 4H2SO4 2MnSO4 + 2KHSO4 + 8 H2O + 5O2

Na osnovu razlike u mL rastvora KMnO4 utroenog za titraciju kontrolne probe i ogledne probe dolazi
se do koliine H2O2 koja je razloena od strane enzima.

Reagensi i pribor:

- Preparat katalaze: Odmjeriti na analitikoj vagi 2g brana ili drugog izmljevenog biljnog
materijala, staviti u balon od 100 mL, dodati vode i dobro promukati, zatim dodati 2-3 kapi
toluola, dopuniti balon destilovanom vodom do markice i ostaviti smjesu na sobnoj
temperaturi u toku 2 sata. Posle ekstrakcije, sadaj profilitrirati kroz naboran filter papir
(moe i centrifugirati) i filtrat koristiti kao ekstrakt katalaze. Za ekstrakciju enzima moe se
koristiti i krompir. 20g krompira isitniti i izmrviti, staviti u balon, dodati vode, promukati,
dopuniti vodom do 50 mL i profiltirrati. Za ispitivanje katalaze moe se koristiti i krv u
razblaenju 1:1000.
- 1% rastvor H2O2
- 10% H2SO4
- 0,1 M KMnO4
- 0,1 M NaOH

Tok odreivanja: U etiti tikvice nasuti pipetom po 20 mL filtrata, zatim u posljednje dvije (3 i 4) koje
slue kao kontrolne zagrijati da sadraj prokljua (kuhati 5 minuta) radi inaktivacije enzima, a onda
ohladiti.

Posle toga u sve tikvice dodati po 20 mL destilovane vode, po 5 mL 1% rastvora H2O2, koji je
prethodno neutraliziran rastvorom NaOH i ostaviti ih na sobnoj temperaturi u toku 30 minuta. Posle
tog roka dodati u probe po 5 mL 10% H2SO4 i smjesu titrirati rastvorom KMnO4. Aktivnost katalaze se
odreuje po koliini mg H2O2 koji se u toku 30 minuta razloi pomou katalaze koja sadri 1 g
ispitivanog materijala (1 mL 0,1 M KMnO4 ekvivalentan je 1, 7 mg H2O2).

() ,
A=

Gdje je:
a- broj mL 0,1 M KMnO4 utroenog za kontrolnu probu

b - broj mL 0,1 M KMnO4 utroenog za uzorak

g koliina ispitivanog uzorka u g