ERDLYI MAGYAR TUDOMNYOS DIKKRI KONFERENCIA

SAPIENTIA EMTE - CSKSZEREDAI KAR

Terpis peptidek bioszintzisre alkalmas

rekombinns fzis rendszerek ipari
hasznostsa

Szerz:
Dsa lmos,
Sapientia Erdlyi Magyar Tudomnyegyetem, Cskszeredai Kar, Fenntarthat biotechnolgik
mesteri szak, I v. E-mail: almos91@live.com
Tmavezet:
Dr. Orbn Csongor, egyetemi adjunktus
Sapientia Erdlyi Magyar Tudomnyegyetem, Cskszeredai Kar, Biomrnki Tanszk.

-2016-

1
Tartalomjegyzk

Kivonat ................................................................................................................................................. 4

1. Bevezet ........................................................................................................................................... 5

1.1. Terpis peptidek szintzisnek lehetsgei ............................................................................. 6

1.1.1. A szilrdfzis peptidszintzis (SPPS) .............................................................................. 7

1.1.2. Peptidek heterolg expesszija Escherichia coli-ban ........................................................ 8

1.2. Rekombinns DNS ltrehozsa................................................................................................. 9

1.3. Expesszis vektor kivlasztsa ................................................................................................. 9

1.4. Expesszis trzs kivlasztsa s transzformlsa ................................................................... 11

1.5. Fzis rekombinns konstrukcik .......................................................................................... 11

1.6. Fehrjk tiszttsa.................................................................................................................... 12

1.6.1. Affinitsi kromatogrfia FPLC rendszeren ...................................................................... 13

1.6.2. Glszrs kromatogrfia FPLC rendszeren ..................................................................... 15

1.7. Rekombinns fehrjk ellltsra alkalmas bioreaktor ....................................................... 15

2. A kutatsi clok bemutatsa........................................................................................................... 17

2.1 Anyag s mdszer .................................................................................................................... 17

2.1.1. PGU Vektrokonstrukci ltrehozsa................................................................................ 18

2.1.2. Kmiai kompetens sejtek ksztse .................................................................................. 22

2.1.3. Kmiai kompetens E. coli BL21 DE3 Rosetta sejtek transzformlsa ............................ 23

2.1.4. Transzformlt sejtek tartstsa ....................................................................................... 24

2.1.5. Inokulum s tpleves elksztse ..................................................................................... 24

2.1.6. A bioreaktor elksztse ................................................................................................. 25

2.1.7. A bioreaktor beoltsa. ...................................................................................................... 26

2.1.8. A fermentcis folyamatok kvetse s mintafeldolgozs .............................................. 27

2.1.9. Szraz sejttmeg meghatrozsa ...................................................................................... 27

2
 2.1.10.Nedves sejttmeg meghatrozsa ................................................................................... 28

2.1.11. Optikai denzits mrse. ................................................................................................ 28

2.1.12. Glkz koncentrcijnak mrse. ................................................................................ 28

2.1.13. Ammnium klorid koncentrcijnak mrse. .............................................................. 28

2.1.14. Sejtek feltrsa ............................................................................................................... 29

2.1.15. Ultracentrifugls ........................................................................................................... 30

2.1.16. Affinits kromatogrfia FPLC rendszeren ..................................................................... 30

2.1.17. Dializls........................................................................................................................ 31

2.1.18. Gszrs ......................................................................................................................... 32

2.1.19. Fzis partner emsztse ............................................................................................... 32

2.1.20. Glelektroforzis 15%-os SDS-poliakrilamid-glben ................................................... 32

2.1.21. Fehrje mennyisgnek meghatrozsa ......................................................................... 33

3. Eredmnyek kirtkelse ............................................................................................................... 34

3.1. Els prbafermentci eredmnyei ......................................................................................... 34

3.2. GluA2-GST fermentci eredmnyei (PGG) ......................................................................... 37

3.3. GluA2-GST fzis komplex tisztts eredmnyei (PGG) ...................................................... 38

3.4. GluA2-Ubiqiutin fermentci eredmnyei ............................................................................. 40

3.5. GluA2-Ubiqiutin fzis komplex tiszttsnak eredmnyei (PGU) ....................................... 41

3.6. GluA2-Ubiqiutin msodik fermentci eredmnyei ............................................................... 44

3.7. GluA2-Ubiqiutin fzis komplex emsztse YUH enzimmel................................................ 47

4. Kvetkeztetsek ............................................................................................................................. 48

5. Hivatkozsok.................................................................................................................................. 49

3
Kivonat

Napjainkban a fehrjemrnksg s a biomrnki mveletek egyre nagyobb szerephez jutnak

a biotechnolgin bell, hiszen az orvostudomnyok s a gygyszerszet fejldsvel valamint a
fehrje-fehrje interakcik egyre jobb megrtsvel olyan peptid alap gygyszerek fejlesztse s
bioszintzise vlik elrhetv, amelyek magas fok specifitst tesznek lehetv. A medicnban
jelenleg tbb mint 60 szilrd fzis kmiai szintzissel (SPPS) ellltott terpis peptidet
alkalmaznak, ebbl a ht legnagyobb mennyisgben gyrtott peptid ves kereskedelmi forgalma elri
az 5,2 millrd dollrt (U.S. Food and drug Administration). A kmiai ton szintetizlt peptidek
gyrtsi folyamat meglehetsen lass s drga, tovbb a peptid hossznak nvekedsvel fordtottan
arnyos az eljrs s a kihozatal hatkonysga. A terpis peptidek irnti egyre nagyobb igny,
valamint a forgalomban lv ksztmnyek ellltsi s kereskedelmi rnak cskkentse rdekben
a nagy gygyszergyrak kutatrszlegei kiemelten foglalkoznak a terpis peptidek bioszintzisvel.
Egy expresszis rendszerben trtn peptidszintzis nagysgrendekkel olcsbb a kmiai szintzissel
szemben, feltve, ha megfelel fzis partnert s vektorkonstrukcit alkalmazunk a termels
maximalizlsa s a tisztts megknnytse rdekben.
A kutats f clja fzis partnerrel elltott peptidek nagy volumen expresszija Escherichia
coli BL21 DE3 Rosetta sejtvonalban, laborszint bioreaktor felhasznlsval. Tovbb a
peptidszintzisre legidelisabb vektorkonstrukci ltrehozsa, expresszis krlmnyek s tiszttsi
lpsek optimalizlsa. A kutatsunk sorn a GluA2 51 aminosavbl ll peptid expersszijt
vizsgltuk GST valamint ubiquitin fuzis partner alkalmazsval. A fermentcit Biostat A+
laborszint bioreaktorban vgeztk, mely sorn a legfbb clunk a minl nagyobb sejtszm elrse
s a nagyhozam peptidexpresszi optimalizlsa volt. A modellknt hasznlt GluA2 peptid
tisztitst FPLC rendszeren GST-affinits, s Ni+ affinits kromatogrfival vgeztk.
Az eredmnyeink alapjn az ubikvitin fzis partner alkalmazsa sokkal hatkonyabb a GST-
fzis partner alkalmazsval szemben, mivel a clpeptid tiszttsa egyszerbb s hatkonyabb. A
fermentci sorn sikerlt tlagon felli sejtszmot s j kihozatalt produklni, melynek
ksznheten arra a kvetkeztetsre jutottunk, hogy az ubikvitin fzis partnerrel trtn expresszi
kivlan alkalmas akr terpis peptidek olcs s nagyvolumen gyrtsra.

4
1. Bevezet

Napjainkban a fehrjemrnksg s a biomrnki mveletek egyre nagyobb szerephez jutnak

a biotechnolgin bell, hiszen az orvostudomnyok s a gygyszerszet fejldsvel valamint a
fehrje-fehrje interakcik egyre jobb megrtsvel olyan peptid alap gygyszerek fejlesztse s
bioszintzise vlik elrhetv, amelyek magas fok specifitst tesznek lehetv. A medicnban
jelenleg tbb mint 60 szilrd fzis kmiai szintzissel (SPPS) ellltott terpis peptidet
alkalmaznak, ebbl a ht legnagyobb mennyisgben gyrtott peptidcsald ves kereskedelmi
forgalma az Egyeslt llamokban elri az 5,2 millrd dollrt (U.S. Food and drug Administration).
Ezen peptidek globlis kereskedelmi forgalma 2013 vgn elrte a 19 millird dollrt, tovbb a piaci
elemzk szerint 2020-ig vente minimum 3%-os bvlsre lehet szmtani az ipargban.
(Transparency Market Research). Ha figyelembe vesszk a gazdasgilag feltrekv harmadik
vilgbeli orszgok egyre fejld egszsggyi elltst kijelenthet, hogy a terpis peptidek
piacbvlst nemcsak az j termkek megjelense s trnyerse tartja fent, hanem a mr meglv
ksztmnyek irnti egyre nagyobb igny [1] [2].
A kmiai ton szintetizlt peptidek gyrtsi folyamat meglehetsen lass s drga, tovbb a
peptid hossznak nvekedsvel fordtottan arnyos az eljrs s a kihozatal hatkonysga. A
legnagyobb mennyisgben szintetizlt peptidcsaldok a kvetkezek: vasopressinek, GNRH s
LHRH hormonok, calcitoninek, somatostatinok, vrlemez aggregldst gtl peptidek, immun
peptidek (Life Tein). Ezen felsorolt s sok ms terpis peptidet kizrlag kmiai szintzissel
lltanak el, ebbl kifolylag nagyon magas ron rhetek el tlagosan milligrammonknt 100 dollr
a kereskedelmi ruk (Mybiosource). Ennek kvetkeztben e hatanyagok a legtbb orszgban
kormnyzatilag tmogatottak a betegbiztostkon keresztl, gy kezelt betegsgek tpustl fggen
lehetnek ingyenesek, vagy a kereskedelmi ruk tredkbe kerlhetnek. Az Egyeslt llamokban
viszont a nem megfelel betegbiztostssal rendelkezk esetben egy komolyabb kezels akr
megfizethetetlen is lehet (U.S. Food and drug Administration).
A terpis peptidek irnti egyre nagyobb igny, valamint a forgalomban lv ksztmnyek
ellltsi s kereskedelmi rnak cskkentse rdekben a nagy gygyszergyrak kutatrszlegei
kiemelten foglalkoznak a terpis peptidek bioszintzisvel. Egy expresszis rendszerben trtn
peptidszintzis nagysgrendekkel olcsbb a kmiai szintzissel szemben, feltve, ha megfelel fzis
partnert s vektorkonstrukcit alkalmazunk a termels maximalizlsa s a tisztts megknnytse
rdekben. A hatkony nagy volumen peptidexpesszi a biomrnki mveletek krbe tartozik,

5
kivitelezshez laboratriumi vagy ipari szint bioreaktor szksges, fehrje tpustl vagy
konstrukcitl fggen. A bioreaktorokban trtn peptidszintzissel szembeni legjelentsebb
elvrs a termk kihozatalnak maximalizlsa valamint az ellltsi kltsgek minimalizlsa.
Teht fontos szempont a hatkony expersszis organizmus, vektor, valamint a clpeptid fzis
partnernek kivlasztsa, tovbb a minl olcsbb tpkzeg alkalmazsa, s az egsz termelsi (up
stream) valamint a tisztitsi rendszer (downstream) optimalizlsa a kritriumoknak s az
elvrsoknak megfelelen [4],[5].

1.1. Terpis peptidek szintzisnek lehetsgei

Mint mr emltettk peptidek gyrtshoz alapveten ktfle eljrs ll rendelkezsre, a

kmiai szintzis s a bioszintzis. A kmiai szintzisen bell ugyanakkor kt eljrs ltezik, a
szilrdfzis peptidszintzis (SPPS) s a folyadkfzis peptidszintsis. A kt eljrs kztti lnyegi
klnbsget a hatkonysguk hatrozza meg, SPPS szintzis esetn relatv magasabb hozamot lehet
elrni mind a folyadkfzis hasznlatval, tovbb az SPPS sokkal kezelhetbb s kontrolllhatbb
eljrs [5]. Peptidek bioszintzise heterolg expresszival oldhat meg, egy megfelel
vektorkonstrukci s expresszis gazdaszervezet alkalmazsval, melyek leggyakrabban Escherichia
coli vagy Pichia pastoris.
Mivel a gygyszeripar mg napjainkban is a szilrdfzis peptidszintzis (SPPS) segtsgvel
lltja el a terpis peptideket, feltevdik a krds mirt nem terjedt mg el az expresszis
rendszereken alapul bioszintzis? A vlasz meglehetsen sszetett, els szempontot figyelembe
vve az SPPS-t Robert Bruce Merrifield fejlesztette ki 1963-ban, gy mire a rekombinns fehrjk
nagy volumen gyrtsa a 1980-as vek elejn elrhetv vlt, addigra mr a gygyszeriparban az
SPPS egy bevett gyrtstechnolgiv vlt. Tovbb a szilrd fzis szintzis lehetv teszi specilis
aminosavak beptst, mind pldul D optikai izomrival rendelkezket, melyek sok esetben
pozitvan befolysoljk a szintetizlt peptid terpis tulajdonsgait. Egy ilyen szint szerkezet
mdostott peptid bioszintzise nem megoldhat. A bioszintzis tovbbi elterjedst nagyban gtolja
termelsi s tiszttsi rendszerek nagy beruhzsignye, majd ezek hosszas optimalizlsa, nem
utols sorban pedig az ezen tudomnyterleten fellp szakemberhiny. Ennek ellenre rengeteg
peptid esetben megvalsthat lenne az ipari szint bioszintzis, s lnyegben sokkal olcsbban,
mint kmiai szintzis alkalmazsval. sszehasonltva a kt eljrs 1 gramm termkre vettett
termelsi kltsgeit a mrleg nyelve egyrtelmen az expresszis rendszer fele billen, hiszen 1g tiszta

6
rekombinns petid, vagy fehrje ellltsnak teljes anyag s energiakltsge 700-800 $/g [6],[7]
mg egy 20 aminosvbl ll peptid kmiai szintzise 2000 $/g. Mivel a kmiai szintzis hatkonysga
a mretnvekedssel egyre romlik egy 32 aminosavbl ll peptid gyrtsi kltsge akr 4000$/g is
lehet, a szakirodalomban tallhat adatok lapjn 100$ g/aminosav ellltsi kltsgekkel
tallkozhatunk [8]. Ezen fell kijelenthet, hogy az expressis rendszereken alapul bioszintzis
esetben lehetsg van mind az up stream, mind a downstream mveletek tovbbi optimalizlsra
ezltal nvelni lehet a kltsghatkonysgot, teht a rendszer rugalmas, mg az SPPS esetben egy
merev technolgiai eljrsrl beszlhetnk, melyben nincs sok lehetsg az optimalizlsra. Szilrd
fzis szintzis esetn a teljes gyrtsi kltsg a kvetkezkppen oszlik meg: 60%
nyersanyagszksgletre megy a maradk 40% pedig energiaszksglet s a tiszttsi lpsek
fedezsre. Ez az arny bioszintzis esetben pedig 10% nyersanyagszksglet 90% energia, meg
tiszttsi mveletek [9]. Ezen adatok jl mutatjk, mennyire klnbzik egymstl a kt eljrs
gazdasgi szempontok alapjn is.

1.1.1. A szilrdfzis peptidszintzis (SPPS)

Szilrdfzis peptidszintzissel leghatkonyabban kismret, de akr elgazsokat, ciklikus

szakaszokat is tartalmaz peptidek pthetek fel. Az eljrs legnagyobb elnye, hogy a hsz
termszetes aminosavon kvl, brmilyen mdostott - vagy izotpjellt aminosav is bepthet a
szekvenciba. Annak rdekben, hogy kt aminosavat in vitro krlmnyeken egy adott
szekvencinak megfelel sorrendben sszetudjunk kapcsolni, az egyiknek az amino, a msiknak a
karboxil-csoportjt specilis anyagokkal le kell vdeni. A peptidkts ltrejtte utn, az jabb
aminosav hozzadsa eltt az egyik vdcsoportot el kell tvoltani s gy tovbb. A
vdcsoportoknak az eljrs sorn fontos szerepk van, s az albbi kvetelmnyeknek kell,
megfeleljenek: knnyen felvihetnek kell lennie, a peptidkts kialtsa sorn vdelmet kell, hogy
biztostson, tovbb ezutn knnyen eltvolthatnak kell lennie, teht alapvet elvrs hogy jl
hidrolizlodon. Legelterjedtebb aminovdcsoportok: benziloxikarbonil (CBZ), terc butiloxikarbonil
(BOC), 9-fluorenilmetoxikarbonil (FMOC) [5].
A karboxilcsoport vdelme rdekben szterezst alkalmaznak benzil- vagy terc-butil-szter
formban. A csoportok vdelme mellett nagyon fontos az aktivls, hiszen e nlkl nem jn ltre a
peptid. Egy aminocsoport s egy karboxilcsoport kondenzcija nem spontn folyamat, ezrt a
reakci kivitelezshez kapcsolszerre van szksg. Egyik legelterjedtebb megolds az in situ aktv

7
szteres kapcsols, erre manapsg leggyakrabban a DIC/HOBt (N,N-diizopropilkarbodiimid)
hasznljk. Az SPPS kivitelezshez tulajdonkppen az aminosav Cterminlist egy oldhatatlan
vdcsoporttal kell elltni. Ez lnyegben egy olyan glmtrix, amely sztirol alap, 1-2% divinil-
benzolt tartalmaz kopolimerbl ll, lnyegben ez jelenti az eljrs nevben a szilrd fzist. Az
aroms gyzkhz klrmetil-csoportokat kell kapcsolni, majd ezekhez kthet lesz a szekvencia C
terminlis tagjnak karboxilcsoportja, gy az adott szekvencinak megfelel aminosavakat a gyantn
rgztett, kipl peptidlnchoz lehet kapcsolni. gy megllapthat hogy a szintzis irnya C
terminlis fell az Nterminlis irnyba valsul meg. A reakci 100%-os konverzijnak elrse
rdekben nagy reagens felesleget kell alkalmazni (5x-7x) gy az eljrs nagy pazarlssal jr. Mint
mr emltettk a kihozatal hatkonysga a szintetizlt peptid hosszval fordtottan arnyos. [10]

1.1.2. Peptidek heterolg expesszija Escherichia coli-ban

A rekombinns gntechnolgiai eljrsoknak ksznheten ma mr rutinszeren be lehet

juttatni a clfehrjt kdol DNS- szakaszt prokariota vagy eukarita expersszis sejtvonalakba,
amely segtsgvel megtermeltethet a kvnt clfehrje. A peptidek ellltsra tkletesen
megfelel a legelterjedtebb prokarita expresszis szervezet, az Escherichia coli. Napjainkban ez a
legjobban ismert s tanulmnyozott expesszis gazdaszervezet, npszersge a kutat krben
tretlen, annak ellenre, hogy az utbbi vek kihvsai nyilvnvalv tettk korltait. Az
Escherichia coli mint expesszis gazdaszervezet ugyanis nem felttlenl alkalma eukarita
genombl szrmaz komplex fehrjk expesszlsra, ugyanis intracellulris rendszerei nem
kpesek a komplex fehrjk mkdshez szksges posztranszlcis mdostsok elvgzsre,
mint pldul a glikolizci, prolin cisz-transz izomerizci, valamint foszft, szulft s lipid
csoportok addicija [11].
Nyilvnval htrnyai ellenre mgis ez a legelterjedtebb prokarita expresszis
organizmus, ugyanis rendkvl egyszer, olcs, miniml tplevesen is gyorsan osztd, hiszen a
sejttmeg 20-30 perc alatt megduplzdik, aminek ksznheten a megfelel expesszis rendszer
optimalizlsa utn jelents fehrjemennyisget llthatunk el. A legtbb funkcival s harmadlagos
szerkezettel rendelkez pepid expesszija a megfelel fzis partner alkalmazsa esetn megoldhat,
hiszen a petitek tlnyom tbbsge kpes fiziolgis krlmnyeken a trszerkezet kialaktsra
dajkafehrjk kzremkdse nlkl is.

8
 Peptidek expesszijnak els lpse hogy a fehrjt kdol aminosav szekvencit homolg
rekombincival egy hordoz gynevezett expesszis vektorba kell integrlni, amely sajt
replikcis origval, multiklonoz rgival, antibiotikum rezisztencia gnnel valamint a hatkony
expresszi szempontjbl nlklzhetetlen induklhat promoterrel kell, hogy rendelkezzen [12].

1.2. Rekombinns DNS ltrehozsa

A rekombinns DNS ltrehozsa irnytott klnozssal trtnik, kivitelezshez

elengedhetetlen a restrikcis endonuklezok felhasznlsa s ismerete. A restrikcis
endonuklezok foszfodiszter ktseket hidrolizl enzimek, amelyet baktriumokban fedeztk
fel, ahol az idegen DNS- szekvencik ellen biztostanak vdelmet. Rengeteg vltozata ismert s
mivel az enzim felismeri a szimmetrikus palindrom szekvencikat s ezeket specifikusan hastja a
gnsebszeti eljrsok s a molekulris rekombinci nlklzhetetlen eszkznek minsl [13].
A restrikcis endonuklezok ktfelekppen vghatjk a DNS-t, ha a hasts az egymssal
szemkzti foszfodiszter ktseknl trtnik gynevezett tompa vget kapunk, ha viszont nhny
bzissal elcsszva a felismer hely szimmetriatengelytl, akkor a hasts ragads vgeket
eredmnyez. Ha pldul a plazmid vektort s a templt beltetni kvnt DNS-t is hasonl restrikcis
endonuklezokkal hastjuk, akkor homolg vgekkel rendelkez DNS-darabokat s plazmidot
kapunk, amelyet ligz enzim segtsgvel sszekapcsolhatunk gy ltrehozva hibrid, rekombinns-
DNS molekult, amely tartalmazza a clfehrjnk szekvencijt. Az eljrst liglsnak is nevezik
[14].

1.3. Expesszis vektor kivlasztsa

A mr bemutatott rekombinns DNS ltrehozshoz szksgnk van egy olyan hordoz

DNS vzra, vektorra, amelybe bepthetjk a clfehrjt kdol szekvencit. A vektorok olyan
cirkulris DNS molekulk, amelyek legfbb tulajdonsga, hogy kpesek nllan repliksodni a
kromoszmtl fggetlenl a bejuttatott gazdaszervezetbe. A replikcihoz szksg van egy
replikcis origra s a replikcit szablyoz szekvencikra. A vektorok eredetket tekintve
lehetnek plazmidok, fgok, vrusok, transzpozonok s kromoszmk, amelyeket gntechnolgiai
eljrsokkal alaktanak ki [15].

9
 A peptideket kis mretk miatt olyan expresszis vektorba kell integrlni, amely megfelel
kpiaszmot kpes elrni a gazdasejtben, emellett pedig kpes a fehrje gyors tltermelsre a
megfelel mennyisg elrse rdekben. Erre a clra a legalkalmasabb a pET expesszis vektor,
amely a T7 bakteriofg promterrel rendelkezik.
A T7 es promoter egy mindssze 20 aminosvbl felpl szekvencia, a legersebb
promterek kz tartozik, amelyen a T7 RNS-polimerz kpes csak elvgezni a transzlcit,
amelyet 5 szr gyorsabban hajt vgre, mint az E. coli sajt expesszis rendszer, ezltal tkletesen
alkalmas fehrjk tltermeltetsre [16].

1.1 bra: A pET induklhat E.coli expresszis rendszer sematikus rajza [35].

Mivel az E. coli RNS polimerza csak a sajt gnjei expresszlsra alkalmasak ezrt olyan trzset
kell alkalmazni melybe fg fertzssel bejutattk a T7 es fg RNS polimerzt, hiszen ez csak a
fg gnek promtereihez kpez ktdni, ennek hinyban a T7 es promoterhez kapcsolt fehrje
expresszija nem kvetkezik be. A fgfertzssel az E. coli genomba integrlt T7 RNS polimerzt
kdol szekvencia el egy lacUV5 promtert ptettek be hogy a laktzanalg IPTG hatsra
beinduljon a T7 RNS-polimerz termels, amely felismeri a vektorban tallhat T7 es promtert
s elkezdi trni a promter utn kvetkez insertet 5-szor gyorsabban, mint ahogy azt az E. coli
egy hagyomnyos lac promoterel elltott vektor esetben tenn [17]. Ilyen promoter tallhat a
pET vektorokban, amely konstrukcijt a 90-vek elejn Studier [18] s trsai fejlesztettk ki, s

10
amely a Novagen biotechnolgiai cg termke lett [19]. A pET vektorok a T7 es promter mellett
tartalmaznak egy colE1 replikcis origt, restrikcis hast helyeket valamint leggyakrabban
ampicilin vagy kanamicin rezisztencit hordoz gneket hogy szelektivitsra val lehetsget
biztostsanak a vektort tartalmaz sejtek szmra [20].

1.4. Expesszis trzs kivlasztsa s transzformlsa

Mivel pET expresszis vektort alkalmazunk peptidek gyrtsra, olyan E. coli expresszis
trzset kell vlasztanunk, amely genomjban integrlva van a T7 fg DNS polimerz kdol
gnszakasz, hiszen a pET vektor csak ilyen E. coli trzsekben mkdkpesek. A pET expesszis
rendszer mkdtetsre alkalmas legelterjedtebb trzseket a kvetkezek: BL21pLysS,
BL21pLysE, Rosetta, BL21Star. [14],[21].

1.5. Fzis rekombinns konstrukcik

A heterolg expesszi hatkonysga s a termelt fehrje hozama egyenesen arnyos

az expersszland fehrje mretvel, gy a peptidek ellltsa komoly akadlyokba tkzik,
hiszen a 20-50 aminosavbl ll fehrjk riboszomlis szintzisnl elfordulhat, hogy nem
vesznek fel megfelel konformcit, valamint kevss ellenllak a protezokkal szemben gy
degradldhatnak vagy tejesen megsemmislhetnek. A problma megoldsra Khono s trsai
1998-ban publiklt cikkkben knlnak megoldst, melyben fzis partner alkalmazst
javasoljk a nagyobb kihozatal, valamint a kismret clfehrje stabilitsnak megvsa
rdekben. [22] A mdszer lnyege, hogy a clfehrjnket egy fzis partnerrel expesszltassuk,
majd tiszttskor a fzis partnert leemsztve megkapjuk a tiszta clfehrjnket. Khono s trsai
erre a clra az ubiquitint hasznltak, amely egy 76 aminosavbl ll 8,5 kDa tmeg fehrje. Az
ubiquitin fontos tulajdonsga hogy szelektven lehasthat a clfehrjnkrl a YUH (Yeast
Ubiquitin Hidrolas) enzim segtsgvel [23]. Az gy kialaktott fzis konstrukci mr elg nagy
hogy sikeresen expresszlhat legyen.

11
 1.2 bra: TC5b minifehrje s az ubiquitin fzis konstrukcija.

A fzis komplexet s ms expresszland fehrjket clszer mg egy fzis partnerrel

elltni, hogy megknnytsk a fehrje elvlasztst s tiszttst. Erre a clra esetnkben a
plihisztidin-cmke a legalkalmasabb, amely konstrukcitl fggen egy hat, nyolc, legfeljebb tz
hisztidin aminosavat tartalmaz peptid szakasz. Segtsgvel az expesszland fehrjn Ni2+
affinits kromatogrfival tisztthat. Konstrukcitl s fehrjtl fggen ms fzis cmkk is
alkalmazhatak, a polihisztidin cmke mellette alkalmazzk meg a GST (glutation-S-transzferz),
valamint az MPB (maltz-kt fehrje) cmkket melyek segtsgvel hatkonyan szeparlhatv
vlik a clfehrjnk. A fzis cmkk eltvoltsa protezok alkalmazsval megoldhat, kismret
cmkk el lehet tvoltani dialzissel vagy glszrssel, vagy a gyantra felkttt fehrje esetben
a mosssal tiszttott fehrjrl az oszlopon hastjuk le a fzis cmkt. Az eljrs sorn vigyzni
kell, hogy a fehrjknek s a protezoknak is megfelel puffert alkalmazzunk [14]. Aktv
funkcival rendez peptidek fzis partnernek megvlasztsnl mindenkpp figyelembe kell
venni, hogy a tiszttsi lpseket kveten a fzis partner leemsztse tkletesen megvalsuljon.
A gyakorlatban ez azt jelenti, hogy az emszts sorn a fzis partner eltvoltsval ne srljn a
clpepid, valamint ne maradjanak rajta felesleges aminosavak, gy a legclszerbb olyan fzis
partnert s emsztenzimet vlasztani, mely a clpepid elemsztse sorn tompa vget hoz ltre,
tkletes hastst eredmnyezve.

1.6. Fehrjk tiszttsa

Az expesszi sorn megtermelt peptideket annak fggvnyben, hogy milyen clt

szolglnak, szinte minden esetben izollni s tiszttani kell. Mivel a fehrje alap expesszis
termkek legtbb esetben intracellulrisak gy a fehrjk tiszttsnak s szeparlsnak els lepse
a sejtek feltrsa [24]. A mikrobasejtek feltrsnl leggyakrabban mechanikai mdszereket

12
vlasztanak, ezek alkalmazsval nagy mennyisg sejtet is gyorsan fel lehet trni. Mivel ezek az
eljrsok klnbz nyrerk ellltst jelentik, jelents mennyisg h szabadul fel, ami krt
okozhat a mintkban, gy hts alkalmazsa szksges [25]. A leggyakrabban alkalmazott
mechanikai eljrs a szonikls, ahol ultrahang ltal gerjesztett kavitcis nyrfeszltsg roncsolja
szt a sejteket. Msik eljrs, amikor hatalmas nyomssal egy tszelepen prselik t a
sejtszuszpenzit, amelyben a fellp nyrerk vgzik a roncsolst. A roncsolt sejtszuszpenzit
centrifuglis ertrben leleptjk, gy a vzoldhat peptidek s fehrjk a felluszben lesznek. A
sejtfeltrst olyan pufferben kell vgezni amely, biztostja a clpeptid maximlis oldhatsgt. A
clpeptid tovbbi tiszttsa s ms oldotott llapotban lv fehrjktl trtn elvlasztst affinits
kromatogrfival, FPLC rendszeren lehet elvgezni. [26].
Napjainkba a legelterjedtebb s legmegbzhatbb FPLC (Fast Protein Liquid
Chromatography) rendszereket a General Electric (GE) kszti, KTA Protein Purification
Systems (KTA FPLC) nven. Ezen rendszerek mind laborszinttl mind ipari kivitelben
elrhetek. A GE e rendszerekhez kereskedelmi forgalomban kaphat kszen tlttt
kromatogrfis oszlopokat rust, melyek lehetnek affinits, glszr, ioncsers oszlopok. A
kereskedelmi forgalomban tovbb kaphatak klnbz tpus fehrje elvlasztsra alkalmas
tltetek, s klnbz mret oszlopok. Ennek ksznheten kis szaktudssal a legidelisabb s a
fehrjetisztts volumenhez optimalizlt mret s kialakts oszlopot kszthetjk el az FPLC
rendszer szmra [27].

1.6.1. Affinitsi kromatogrfia FPLC rendszeren

Az affinits kromatogrfia, mint elvlasztsi technika a fehrjk valamilyen specilis

biolgiai funkcijn alapszik, lnyege hogy kovalens ktssel szilrd fzis hordzhoz ktik az
izollni kvnt fehrjt, amely szerkezete vagy kialaktsa rvn specifikusan kpes kapcsoldin a
hordz fzishoz. Ilyen sepcifits lehet pldul enzim esetn a szubsztrt vagy kompetitv inhibitr,
receptor esetn pedig egy effektor. A rekombinns fehrjk elvlasztsra kivlan alkalmas a Ni2+
affinits kromatogrfia, amely az expesszlt fehrjhez ktd polihisztidin cmke (his-tag) megltn
alapszik, gy biztostva egy mestersges specifitst a clfehrjnknek. Ez a legolcsbb eljrs, az
iparban is ezt alkalmazzk a leggyakrabban. A his-tag 6-10 aminosavbl ll cmke, amelyet
tervezhetnk a fehrje N-, vagy C- terminlis vgre, nagy affinitssal ktdik, Ni-gyanthoz. A
ktds azon alapul, hogy a gyantra kttt Ni2+-ionnok koordincis szfrjnak csak a felt

13
foglaljk el a gyanta funkcis csoportjai, gy a hisztidin imidazol gyrjnek N-atomja kpes ktst
kialaktani a Ni2+ -ionnal. A gyanta agarz alap s nitrilotriecetsavat tartalmaz, amelyhez kpesek
ktdni a fmionok [28]. A ltrejv kts elg ers a clfehrjnk stabil megtartsra, gy az
oszloprl fokozatosan lemoshatjuk a tbbi nemkvnatos komponenst s fehrjt. A fehrje gyantrl
val ellsa imidazl oldattal trtnhet, vagy a pH cskkentsvel fokozatos elci rhet el, hiszen
a hisztidin nem kt elektronprral rendelkez N-atomja fokozatosan protonldik, ezrt nem tud
koordinldni a Ni2+ -hoz. Mivel nemcsak Ni2+ hanem ms Co2+, Cu2+, Zn2+ ionokat is lehet az agarz
gyanthoz hozzkapcsolni, ezrt a tiszttsi eljrst fm-affinits kromatogrfinak nevezik [29].
Az eljrs FPLC rendszeren automatizlhat a megfelel oszlop alkalmazsval nagy
mennyisg mintt rvid id alatt fel lehet dolgozni [30]. FPLC rendszereknl Ni2+ kelt elre
gyrtott oszlopokat alkalmaznak, tovbb a piacon elrhet IIMAC gyantkkal tetszleges mret
oszlopokat tlthetnk. Hasznlat utn az oszlopot az indt pufferrel regenerlhatjuk, s jra
felhasznlhatjuk. Hosszabb trols esetn az oszlopot 20%-os etanolban troljuk, hogy
megakadlyozzuk a befertzdst. Hasznlat eltt az etanolt midig 5-10 oszloptrfogat ultraszrt
ioncserlt vzzel mossuk, ezt kveten a tiszttand fehrjnek idelis pufferrel kondicionljuk, majd
felvisszk az oszlopra a clfehrjt tartalmaz oldatot. (FPLC dok) A clfehrje oszlopra val
felvitele utn az oszlopot 5-10 CV (column volum) kondicionl pufferrel mossuk, amely 20-40 mM
imidazolt is tartalmaz, hogy eltvoltsuk a szennyezdseket s a nem ktd fehrjket. Ezt
kveten az oszlop kszen ll az elulsra. Az eluls trtnhet lineris gradienssel, vagy lpcss
gradienssel. A legclszerbb megolds ltalban a lpcss gradiens, ebben az esetben az FPLC
kszlk vezrlprogramjt gy lltjuk be, hogy figyelembe vve az elul puffer imidazol
koncentrcijt, az elutlst 200 mM-os imidazol koncentrcival kezdje. A legtbb esetben ez a
koncentrci elegend az oszlopra kttt fehrjk levlasztsra. Az elcit az FPLC rendszer
automatikus mintaszedvel elre belltott trfogategysgekre osztva 5-50 ml mintaszed ednyekbe
gyjti. Az ells sorn az FPLC rendszer a konduktivits, s abszorbancia mrsvel figyeli az
oszloprl lefoly elcit. A fehrjk oszloprl val lemossa sorn a konduktivts cskken
tendencit kell, mutasson, mg az abszorbanci nvekvt, hiszen a fehrjknek 260 nm
hullmhosszon van fnyelnyelsk, gy az eluls sorn FPLC rendszerben kapunk egy
kromatogramot.
Ha ismerjk az elvlasztott fehrje tulajdonsgait, s az alkalmazott oszlop paramtereit,
akkor az FPLC vezrlprogramnak segtsgvel kiszmthatjuk az elulodott fehrjnk
koncentrcijt [31]. Az oszlopok idvel elhasznldnak, egyre cskken a fehrjemegkt

14
kapacitsuk, az oszlopon esetleg kicsapdott fehrjk s fennakadt lipidek miatt, ezrt tfog tiszttst
ignyelnek, amely 70%-os etanollal, vagy 1 M os ntrium hidroxiddal trtnik. Az ilyen tisztts
gyakran tejesen tnkreteszi az oszlop fehrjemegkt kapacitst. Ezt orvosoland az oszlopot jra
lehet tlteni fmionokkal. Leggyakrabban Ni2+ ionokat tartalmaz oldattal kell kezelni, betartva a
protokoll szerint leirt pufferek alkalmazst megfelel sorrendbe. Ennek ksznheten egy oszlop
nagyon hossz ideig alkalmazhat, feltve, ha betartjuk az zemeltetsre vonatkoz paramtereket,
hiszen a tl nagy folyadkram alkalmazsa nagy nyomst eredmnyez, s a megengedettnl nagyobb
oszlopnyoms tnkreteszi a dextrn gyngyk szerkezett, gy vgleges funkcivesztst okozhat.
[32]

1.6.2. Glszrs kromatogrfia FPLC rendszeren

Az affinitskromatogrfival trtn tisztts utn az elci tartalmazhat mg az oszlopra nem

specifikusan felktdtt fehrjket, ezrt a clfehrje minl nagyobb fok tisztasgnak elrse
rdekben a lellult mintt glszr oszlopon kell futtatni. Mivel ismerjk a clfehrjn tmegt,
ezrt a mefelel standardokkal val oszlop kalibrci utn tudni fogjuk ennyi id alatt r t a
clfehrjn, az oszlopon, gy az FPLC frakciszedje segtsgvel felfoghatjuk a clfehrjt
tartalmaz mintt. A glszr oszlopok ltalban hosszak, alacsony trfogatramon zemelnek, a
minl hatkonyabb elvlaszts rdekben. A kereskedelmi forgalomban tbbfele mret s tltet
oszlop kaphat a legnagyobb gyrt szintn a GE. A glkromatogrfis oszlopok kismret, porzus
glszemcskbl llnak. A mtrixgyngyk kszlhetnek agarzbl, poliakrilamidbl, dextrnbl,
ezek az anyagok trhlt alkotnak, meghatrozott mret prusokat hoznak ltre. Az oszlopra felvitt
minta nagy molekuli kizrdnak a glszemcsk prusaibl s a szemcsk kztt gyorsan thaladnak
az oszlopon; a kis molekulk viszont behatolnak a szemcsk belsejbe is, nagyobb folyadktrben
oszlanak meg s ezrt ksve jelennek meg a kromatogrfis frakcikban. A glek klnbz
prusnagysg szemcskkel kszthetk, gy a glszrs szles molekulasly-tartomnyban alkalmas
fehrjk s peptidek mret szerinti frakcionlsra. [33]

1.7. Rekombinns fehrjk ellltsra alkalmas bioreaktor

A biotechnolgiai ton trtn hatanyagok s termkek hatkony nagy mennyisgben

trtn ellltsa, akr kereskedelmi akr kutatsi clokat szolgl, specilis technikai s

15
krnyezeti feltteleket ignyel melyek kiszolglsra gynevezett bioreaktorokat alkalmaznak. A
bioreaktor teht egy olyan mechanikus tartly, amelyben biolgiai talakuls zajlik, prokarita
vagy eukarita sejtenyszet felhasznlsval, amely vgl egy vagy tbb hasznostani kvnt
termket eredmnyez. Kivitelezsket s felptsket tekintve nagyban hasonltanak a
vegyiparban alkalmazott kmiai reaktorokhoz.[34]
A bioreaktorok legfbb sajtossga a magas fok kontrolllhatsgban nyilvnul meg,
hiszen a mikroorganizmusokat s klnbz sejttenyszeteket csak stabil jl kontrolllhat
krlmnyeken lehet idelisan tenyszteni. A nagyfok szablyozs megvalstsnak els
felttele a biorekatorban lv krnyezeti felttelek s a sejtenyszet folyamatos monitorizlsa
szenzorok segtsgvel, mint pldul hmrsklet, oldott oxign, pH, optikai denzits mrsre
alkalmas szenzorok. A szenzorokbl nyert informcik segtsgvel knnyedn fenntarthatak az
idelis sejttenysztshez szksges felttelek. Napjainkban erre a clra fejlett, szmtgppel s
megfelel szoftverrel elltott vezrlegysgeket alkalmaznak, amelyek szenzorokbl nyert adatok
segtsgvel automatikusan szablyozzk s szinten tartjk a sejtszaporulat szempontjbl idelis
krlmnyeket [35]. A bioreaktorokat mretktl s rendeletis cljaiktl fggen klnbz
kiegszt rendszerekkel ltjk el, ide tartozik a kevertets, a levegellts, a fts s htst,
valamint a tpleves elksztsre s sterilezsre alkalmas puffer tartly. Tovbb sav illetve bzis,
esetenknt habzsgtl adagolsra alkalmas perisztaltikus pumpk meglt. Ezeket a kiegszt
rendszereket szintn a vezrlegysg szablyozza a szenzorokbl rkez informcik alapjn,
melyek megfelel ki s bekapcsolsval kpes fenntartani az llandsult s a kezel ltal belltott
krlmnyeket.

16
2. A kutatsi clok bemutatsa

A kutats f clja fzis partnerrel elltott peptidek nagy volumen expresszija Escherichia
coli BL21 DE3 Rosetta sejtvonalban, laborszint bioreaktor felhasznlsval. Tovbb a
peptidszintzisre legidelisabb vektorkonstrukci ltrehozsa, expresszis krlmnyek s tiszttsi
lpsek optimalizlsa. A kutatsunk sorn a GluA2 51 aminosavbl ll peptid expersszijt
vizsgltuk GST valamint ubikvitin fuzis partner alkalmazsval. A fermentcit Biostat A+
laborszint bioreaktorban vgeztk, mely sorn a legfbb clunk a minl nagyobb sejtszm elrse
s a nagyhozam peptidexpresszi optimalizlsa volt. A modellknt hasznlt GluA2 peptid
tisztitst FPLC rendszeren GST-affinits, s Ni+ affinits kromatogrfival vgeztk. Kutatsunk
sorn sszehasonltottuk a kt vektorkonstrukci termelkenysgt valamint tiszttsi paramterit egy
olyan optimalizlt eljrs kifejlesztse rdekben mely akr ipari szinten is alkalmazhat s
versenykpes, tovbb univerzliss tehet 10 s 50 aminosav hosszsg peptidek termelsnek
esetben. A modellknt alkalmazott GluA2 peptid az idegsejtekben megtallhat glutamt receptor
sejtmembrn belli receptor rsze. A GluA2 esetnkben tkletes modell peptid hiszen rendelkezik
harmadlagos szerkezettel s funkcival, tovbb ellltsa neurolgiai kutatsok trgyt kpezi,
jeltviteli tvonalak feldertse rdekben (STEP mechanizmus) [36].

2.1 Anyag s mdszer

A kutatsunkhoz szksges kt vektorkonstrukci kzl a GluA2-GST fzis partnerrel

elltott vektort a Romn Tudomnyos Akadmia Biokmia Kutatintzete bocsjtotta
rendelkezsnkre, mg a msik GluA2-Ubiquitin fzis partnerrel rendelkez vektorkonstrukcit mi
magunk lltottuk el, egy Etvs Lornd Tudomnyegyetem (ELTE) Szerves Kmia Tanszkrl
kapott ubiquitines pEt 19b alap vektor felhasznlsval (PUBK vektor). Irodalmi ttekintsnk
alapjn egyrtelmen nagyobb remnyeket fztnk az ubiquitin fzis partner alkalmazsval
kapcsolatban, hiszen az ez a fzis partner kivlan oldhatsgi tulajdonsgokat mutat, ezen fell az
olcsbb nikkel affinits kromatogrfival tisztthat, s YUH (Yeast Ubiquitin Hydrolase) enzim
segtsgvel a clpeptidrl nagyon pontosan leemszthet a fzis partnere a specilis proteoltikus
hast helynek ksznheten.

17
 Miutn mr rendelkezsnkre llt mind a kt vektorkonstrukci transzformltuk ket
Escherichia coli BL21 DE3 Rosetta sejtvonalba. A fermentcis ksrleteket laboratriumi szint
Sartorius Biostat A plus bioreaktorban vgeztk. A fermentcik sorn mrtk a sejtszmot (OD 600
nm), s a szraz sejttmeget. Az rdemi fermentcis ksrletek eltt a biorekatort gymond
kalibrltuk az Escherichia coli BL21 DE3 Rosetta sejtvonalra, mely lnyege hogy megllaptsuk,
milyen dinamikt mutat a sejtek nvekedse valamint az ltalunk alkalmazott M9 miniml tplevese
egyek komponensei milyen temben hasznosulnak s merlnek ki. Ennek rdekben a
mintavtelezsek sorn kapott mintkbl meghatroztuk a szubsztrt illetve a nitrognforrs
fogysnak mrtkt a fermentci elrehaladtval. Ezen adatokra azrt van szksg, hogy
kialaktsunk egy megfelel rtpllsi stratgit a kimerlben lv tptalajkomponensek ptlsra,
hogy ezltal biztostani tudjuk a folyamatos sejtosztdst a minl nagyobb sejtszm elrse
rdekben.
A fermentcis ksrletek befejezsvel optimalizltuk a GluA2 tiszttsi folyamatait, majd
a klnbz tiszttsi protokollok alapjn kapott elcik fehrjetartalmt fluorimetris mdszerrel
meghatroztuk s sszehasonltottuk. A tiszttsi lpsek sorn folyamatosan mintavteleztnk s
SDS-PAGE segtsgvel ellenriztk, hogy helyes irnyba haladunk. A kvetkez fejezetekben
rszletesen bemutatjuk a kutats sorn elvgzett munkt az alkalmazott sszes mdszert s mrsi
technikt. A kutatsainkat a Biomrnki Tanszk fermentcis kutatlaboratriumban vgeztk.

2.1.1. PGU Vektrokonstrukci ltrehozsa

Kutatsi munknk els lpseknt el kellett ksztennk egy olyan vektorkonstrukcit,

amelyben megtallhat a GluA2 kdol szekvencia, az ehhez szorosan illeszked Ubiquitin fzis
partner s az ezutn lv polihisztidin cmke az affinits kromatogrfia kivitelezse rdekben. Mivel
rendelkeztk mr egy olyan vektorral, amely tartalmazta az Escherichia coli-ra optimalizlt GluA2-
GST fzis partnerrel elltott szekvencit (PGG vektor). Mivel rendelkeznk egy ubiquitin fuzis
konstrukcit tartalmaz vektorral (PUBK), ezrt hogy ltrehozzuk az ltalunk kvnt konstrukcit a
PGG vektorbl ki kellett emsztennk a GluA2 szekvencijt, s bele kell raknunk a PUBK vektorba
gy, hogy pontosan illeszkedjen az ubiquitin fzis partner szekvencijhoz. Mivel elzetesen
megszevenltattuk PGG s a PUBK vektorokat megtudtuk tervezni a primereket (oligonukleotidok)
hogy a PGG vektorbl kiemsztett GluA2 templt szekvencit PCR lncreakcival fel tudjuk
szaportani s az szintn emsztett PUBK vektorba tudjuk liglni.

18
 Megterveztk a GluA2 szekvencira a primereket a SnapGene 3.1 program segtsgvel, majd
legyrtattuk a kvetkez primereket:
2.1 tblzat: Primerek
FWD primer:
5 GTCCGCGGTGGAGGCTTTGAATTCTGCTATAAAAGTC 3
SacII: CCGCGG
REV primer
5 GCGGATCCTTAGATTTTCACTGATTCGATGCC 3
BamHI: GGATCC

A GluA2 PGG vektorbl trtn kiemsztshez a BamHI* s EcoRI restrikcis

endunuklezokat hasznltuk. Az emszts utn a primerek felhasznlsval a templtot PCR rekaci
segtsgvel (ProFlex PCR System) felszaportottuk a kvetkez PCR program szerint:

2.2 tblzat: PCR progra.

Ciklusszm Hmrsklet Id Reakci sszettel

1x 95C 2 perc 10x PFU puffer 5L

95C 0,5 perc 10mM dNTP mix 1L

30x 52C 0,5 perc 100mM FW-SacII GluA2 primer 0,5L

72C 1 perc 100mM Rev-BamHI- GluA2 primer 0,5L

1x 72C 7 perc Templt DNS 1L

Ultra tiszta H2O 42L

sszesen 50L

A PCR termket Thermo Scientific GeneJET PCR Prification Kit-tel tiszttottuk, majd ellenriztk
2%-os agarz glen.

19
 2.1. bra: T1-T2-T3 zsebekben a PCR termk (templt) ellenrz gl kpe.

A templtot ezutn emsztettk BamHI* s SacII endonuklezzal hogy ragadds vg vgeket

kapjunk. Az emsztst Tango pufferben 2 rn keresztl 37C-o majd Thermo-Shaker TS-100C
segtsgvel inaktivltuk a restrikcis enzimeket 80C-on 20 percig. Ugyanezen krlmnyeket s
restrikcis enzimeket felhasznlva a PUBK vektort is emsztettk (nagy fragment), hogy a kvetkez
lpsben sszeligzhassuk a templttal. A ligzshoz 4.5 L emsztett PUBK plazmidot, s 17 L
emsztett templtot mrtnk ssze, hozzadtunk 1 L T4 DNS ligz enzimet, 2.5 L ligz puffert,
majd az elegyet 12 rn keresztl inkubltuk 16 C-on. Ezt kveten a keletkezett termket a PGU
vektort 2% glelektroforzisen ellenriztk.

20
 2.2. bra: 1-5-ig lv zsebekben a liglsi termkek (PGU vektor) lthatak, az utols kt zsebben
nem a kutatshoz tartoz mintk vannak.

Ezt kveten a feni bra tdik zsebnek tartalmt Thermo Scientific GeneJET Gel Extraction Kit-
tel izolltuk, majd egy rszt az izollt s tiszta PGU vektornak elkldtk szekvenlni, msik rszt
meg eltettk -20 C-ra ksbbi transzformls cljbl.
A szekvenlsi eredmny aminosav szekvencijt lefordtottuk fehrjeszekvencira, amelyen
egyrtelmen ltszik, hogy sikerlt a GluA2 szekvencijt hozzkapcsolni az Ubiquitin fzis partner
szekvencijhoz:
Transzlci eremnye:

XRAXXR-QPEHXGIRAXDCXLCPVIXE-PLHPSGRRXCVQSILFNHAKRXSXCLLIRS-S
XAPSDPXRQESHPVYFEGLPNLTRGRPSWQFRFA-CDVPGEFKXRSRSREINTTHYRETT
TVSL-K-FCLTLRRRYTMGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMQIFVKTLTGKTITLEVESS
DTIDNVKSKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKEFTLHLVLRLRGGGFEF
CYKSRAEAKRMKVAKNAQNINPSSSQNSQNFGTYKEGYNVYGIESVKI-GSSC-QSPKGS
-VGCCHR-TITSITQIRLLTKPERKLSWLLPPLSNN-HNPDPAANKARKEAELAAATAEQ
-LA-PLGASKRVLRGFLLKGGTISGYPVPGCINESANARGEAVCVLGALPLPRSLTRCAR

MGHH..RGG Ubiquitin + His-tag

GFEF..VKI Glua2

21
Az eredmnyekre alapozva SnapGene 3.1 program segtsgvel elksztettk az ltalunk ltrehozott
vektorkonstrukci restrikcis trkpt.

2.3. bra: PGU vektor restrikcis trkpe.

2.1.2. Kmiai kompetens sejtek ksztse

A transzformci az els olyan felfedezett folyamat (Avery ksrletei), amely a genetikai

informci sejtek kztti tvitelre hozott bizonytkot. A kmiai kompetencia alapja, hogy nhny
baktriumfaj esetben, kztk az E. coli-ban is, a ktrtk kationok alacsony hmrskleten segtik
a plazmid DNS felvtelt (a lineris DNS-t is kpesek felvenni, ezt azonban a citoplazma DNS bont
enzimei (DNzok) gyorsan feldaraboljk). Kmiailag kompetens sejteket a log nvekedsi szakasz
kezdeti fzisban meglltott sejtkultrbl lehet ltrehozni, a sejtek ktrtk kationok oldatval val
tbbszri mossa ltal. A ktrtk kationok hidakat kpeznek a DNS s a sejt felleti
makromolekuli kztt, gy megn a valsznsge a DNS molekulk bejutsnak [37].

22
 Az Escherichia coli BL21 DE3 Rosetta trzset tettk ilyen mdon kompetens. 3 ml Luria
Bertani (LB: 1000 ml-re: 10 g tripton, 5 g leszt kivonat, 5 g NaCl, pH 7.5) oldatba jszakn t
inkublt kultrt indtottunk el 1 teleprl. Az jszakn t inkublt sejtkultrbl 1:100 arnyban
oltottunk t 50 ml LB tplevesbe, s 37 C-on inkubltuk a logaritmikus szaporodsi szakasz elrsig
150 rpm-el, amg a baktriumkultrt tartalmaz tpoldat optikai denzitsa 600 nm-en elrte a 0,4-
0,5 kztti rtket (OD600nm = 0,4 - 0,5). A sejtsrsg kvetst GeneQvant spektrofotomterrel
vgeztk. Ezt kveten a sejtkultrt 10 percig jgen inkubltuk, s 5 percig centrifugltuk 5000 rpm-
en 40C -on. A fellsz lentse utn, a sejteket centrifuglssal leptettk, s 12,5 ml jghideg,
steril 100 mM-os MgCl2-oldatban vatosan felszuszpendltuk, majd 20 percig jgen inkubltuk. A
jgen val inkublst kveten a sejteket ismt centrifuglssal leptettk (5 perc, 5000 rpm, 4C ),
s a fellszt elntttk. A centrifugls sorn nyert pelletet 1,25 ml jghideg, 100 mM-os CaCl2-
oldatban vatosan felszuszpendltuk, s egy rn keresztl jgen inkubltuk. Hosszabb ideig tart
trols rdekben a kompetens sejtekhez 200 L 80%-os steril glicerint adtunk, s 100 l-knt 1,5
ml-es Eppendorfokba sztosztottuk, majd -80C -on troltuk a felhasznlsig.

2.1.3. Kmiai kompetens E. coli BL21 DE3 Rosetta sejtek transzformlsa

A pazmidokat az elksztett kmiai kompetens sejtekbe hsokk segtsgvel juttattuk be. A

plazmid DNS bejutst a sejtbe a membrn fluiditsnak nvelsvel lehet megvalstani mivel a
membrnt felpt lipidek sznhidrogn lncait fluidd lehet tenni a hmrsklet nvelsvel, s
emiatt teresztv vlik.
A transzformlshoz 100 l kmiai kompetens E. coli sejthez hozzadtunk 1 l plazmidot. A
transzformcis keverket 20 percen t jgen tartottuk, majd 1 percre 42C-ra helyeztk, ezutn ismt
jgre tettk. Az optimlis 37C-rl 42C-ra emeltk a hmrskletet, mely id alatt felletre tapadt
plazmidok a fluid membrnon nagyobb valsznsggel lpnek, s kerlnek a sejt belsejbe. Ezt
kveten hozzadtunk 900 l LB tpoldatot, amellyel egy rt inkubltuk 30C-on rzatva. Vgl a
transzformlsi mixbl 25 l-ert kanamycin tartalm LB tptalajra szlesztettnk s 37C-on
inkubltuk egy jszakn keresztl. Msnap a tptalajra szlesztett sejtek kis kr alak telepeket
kpeztek [37].

23
 2.1.4. Transzformlt sejtek tartstsa

Amennyiben terveink szerint mg tbbszr is szksgnk lesz az adott fehrje expresszlsra

vagy az egyes vektorkonstrukcik jbli sszehasonltsra, akkor rdemes a kultrkbl stock-ot
kszteni. Steril flke alatt 2-3 telepet steril pipetta heggyel vagy fogpiszkl segtsgvel felvesznk
a tptalajrl, s 5 ml friss LB tpoldatba helyeznk. A kis kultrt 4-6 rn keresztl rzatjuk
inkubtorban 250 rpm en s 37C on. A folyadkkultrbl ezutn glicerines stock-ot ksztnk,
amelyet -80C trolunk. A stock-ot 1.5 ml centrifuga tubusokba mrjk ssze 800 l kultrhoz 200
l 100% tisztasg glicerint adunk majd sszevortexeljk s -80C troljuk, a fermentcik sorn
ezekbl a trzsoldatbl indtunk majd folyadkkultrt.

2.1.5. Inokulum s tpleves elksztse

A bioreaktorban trtn fermentci kivitelezsnek els lpsben megfelel mennyisg

s minsg inokulum elksztse, amellyel beoltjuk a bioreaktorban lv steril tplevest. A -80C-
on trolt stock kultrt felolvasztjuk, majd steril flke alatt beoltunk vele 5-5 ml LB tplevest
tartalmaz steril falkont. A beoltshoz 50-50 l stock kultrt hasznlunk fel. A beoltst kveten
a starterkultrnkat 2-3 rn keresztl inkubtorban 250 rpm en s 37C rzatjuk. Ezt kveten
elksztnk kt 1L lombikot, tovbb 200 ml M9 miniml tplevest, az inokulum toltsnak
rdekben. Miutn a kis folyadkkultrk inkubcis ideje lejrt a falkonokat lecentrifugljuk 4700
rpm, majd steril flke alatt elntjk a fellszt s a lelepedett sejteket felszuszpendljuk 5-5 ml
friss M9 miniml tptalajon. A szuszpendlst kveten a falkonok tartalmt a flke alatt
belentjk az elksztett s lesterilezett 1L lombikokba, melyeket ezt kveten inkubtorba
helyeznk s 250 rpm s 37C-on rzatunk 8-10 rn keresztl. Mind ipari mind laboratriumi
szinten a sejttenyszeteket ilyen lpcszetes mdn szaportjk egyre nagyobb trfogatokban,
mindaddig, mg elrik a rektor beoltshoz szksges sejtmennyisget. A folyamatot ltalnosan
elnevelsnek vagy scaleup- nak szoktk nevezni [38]. Az elnevels s a fermentci sorn M9
miniml tptalajt alkalmaztunk annak rdekben, hogy knnyedn kontrolllni tudjuk a szn s
nitrognforrs mennyisgt rdekben.

24
 2.3. tblzat: Mdostott M9 miniml tptalaj.

M9 miniml tpleves TRECE ELEMENT 1000X

sszetevk 1 L leveshez sszetevk 100 ml oldathoz

Na2HPO4 3,54g/L FeCl3 6H2O 1,35g

NaCl 0,50g/L CaCl2 0,22g

KH2PO4 3,40g/L MnCl2 4H2O 0,19g

NH4Cl 2,00g/L ZnSO4 7H2O 0,41g

C6H12O6 2,00g/L CoCl2 0,04g

MgSO4 2,00mM CuCl2 2H2O 0,03g

CaCl2 0,02mM NiCl2 6H2O 0,04g

Kanamycin 80g/L Na2MoO42H2O 0,04g

TRACE 1 ml 1X Na2SeO3 5H2O 0,05g

H3BO3 5H2O 0,03g

2.1.6. A bioreaktor elksztse

A fermentcik sorn alkalmazott bioreaktor egy Sartorius Biostat A plus volt. A bioreaktor
ll egy vezrlegysgbl s egy reakciednybl melynek hasznos trfogata 1 L. A reaktor tovbb
el van ltva egy kevervel, oldott oxign mrvel pH elektrddal s hmrvel. A reaktorban
trtn folyamatok nyomon kvetst, s a szenzorok ltal mrt adatokat a vezrlegysgen
keresztl egy szmtgpre teleptett vezrlszoftver segtsgvel tudtuk ellenrizni s rgzteni.
A pH stabilan tartst, a leveg trfogat ramt s a hmrskletet a vezrl berendezs
szablyozta. Az oldott oxign mennyisgnek a szablyozst csak a kevers mrtknek a
nvelsvel lehetett elrni, mert nem csatoltunk a rendszerhez kln oxign forrst [39]. A
bioreaktorok felptst s technikai megoldsait az elmleti bevezetben rszletesen trgyaltuk.
A bioreaktor sterilezse autoklvban trtnik, a sterilezs eltt elksztjk az M9 miniml tptalajt,
amelyet beletltnk a reaktorba. Sok esetben nem a teljesen sszemrt tptalajt autoklvoztuk.

25
A hinyz tptalaj komponenseket a sterilezst kveten 0,2 m szrn keresztl jutattuk a
bioreaktorba az erre a clra ksztett trzsoldatokat felhasznlva. A sterilezs eltt a reaktorra
rhelyezzk a reaktorfedelet, belehelyezzk a fedlben kialaktott lyukakon keresztl a
szenzorokat, felhelyezzk a mintavtelez kszlket, a leveg kimeneti nylsra a kondenzlt,
tovbb egy htujjat, s a rushton keverk fl a tengelyre
egy mechanikus habtrt, a habzsgtls rdekben.
A kondenzl tetejre egy rvid szilikon csvel egy
specilis, vattval tlttt csszer ednyt helyeztnk, amely
egyfajta szrknt funkcionl, s ezen a nylson
egyenltdik ki a reaktorban a nyoms az autoklvozs
sorn. A reaktorba vezet levegszrt s tovbbi
nylsokat gondosan lezrjuk. Ezt kveten a reaktort
behelyezzk az autoklvba, s 120C-on s 20 percen
keresztl sterilezzk. Az autoklv utn a reaktort kivesszk
s rktjk a levegelltst, hogy nyoms legyen a
rendszerben, ezltal minimalizljuk a befertzds eslyt.
A tovbbiakban csatlakoztatjuk a reaktor sszes rendszert
a vezrlegysgre, s belltjuk a hmrskletet 37 C-ra s
a htujj segtsgvel 20 perc alatt bell a reaktr
hmrsklete. A fermentcik sorn a pH (6.8), kevers 2.4. bra: A bioreaktr felksztse
az autoklvozsra.
(350 rpm) s a hmrsklet (37C) lland rtkre voltak
lltva. A leveg trfogat rama lland, 1.5 L/perc. A fermentci elrehaladtval a keverst
autmatikusra lltottuk, hogy lland 30% -os szinten tartsuk az oldott oxign koncentrcijt.

2.1.7. A bioreaktor beoltsa.

Az elnevels sorn kapott kultrt steril flke alatt 50 ml falkonokba tltttk, majd 4700
rpm-en lecentrifugltuk. A centrifugls utn a fellszt elntttk, majd a sejteket 5 ml friss
tpoldatban felszuszpendltuk. Az 5 ml sejtszuszpenzit steril orvosi fecskendvel felszvtuk s a
rektor fedeln lv szeptumon keresztl beoltottuk.

26
 2.1.8. A fermentcis folyamatok kvetse s mintafeldolgozs

A fermentcik sorn a biorekatorban folyamatosan nyomon kvettk a trtnseket, egy

a vezrlszoftverhez illeszked programmal rgztettk a szenzorok ltal mrt adatokat tovbbi
kirtkels cljbl. A rgztet adatokbl utlag is kpet kapunk az oldott oxignszint alakulsrl,
a kevertets intenzitsnak vltozsrl, valamint a felhasznlt sav/bzis mennyisgrl. A
fermentcik sorn a mintavtelezn keresztl 1 vagy 2 rnknt mintt vettnk, tovbbi mrsek
kivitelezse cljbl. Egy mintavtelezsnl tlagosan 4-5 ml mintt vettnk, amely
felhasznlsval optikai denzitst mrtnk. A szraz sejttmeg meghatrozsa rdekben a
fennmarad mintbl 1 ml-et centrifugatubusokba pipettztunk s lecentrifugltuk 1200 rpm-en.
A fellszt eltettk -80 C-ra, hogy majd meghatrozzuk bellk a glkz s az ammnium klorid
fogysnak mrtkt a fermentci elrehaladtval.

2.5. bra: Bioreaktorok mkds kzben (prhuzamos fermentcik PGU s PGG

konstrukcikkal)
2.1.9. Szraz sejttmeg meghatrozsa

A lecentrifuglt sejteket tartalmaz mikrocentrifuga tubusokat 60C fokos

szrtszekrnyben szrtottuk 10 rn keresztl, hogy meghatrozzuk a szraz sejttmeg
alakulst a fermentci elrehaladtval. A szraz sejttmeg meghatrozshoz

27
centrifugatubusokat elzetesen analitikai mrlegen lemrtk, majd a mrseket ismt levgeztk a
60C-on val szrts utn. A kt mrs klnbsge adja meg mennyi szraz sejttmeget tartalmaz
a centrifugatubus 1 ml vgtrfogatban.

2.1.10.Nedves sejttmeg meghatrozsa

A nedves sejttmeg meghatrozsra 1 ml mintt elre lemrt mikrocentrifuga tubusba

pipettzunk, majd lecentrifugljuk 1300 rpm en 8 percet majd a fellszt elntve ismt lemrjk.

2.1.11. Optikai denzits mrse.

Az optikai denzits mrsre GeneQuant pro spektrofotomtert hasznltunk, a frissen

lefejtett mintbl 1 ml-t manyag kvettba pipettztunk, majd a kvettt a spektrofotomterbe
helyezve lemrtk az optikai denzitst 600 nm-en (OD600). A kszlket M9 miniml tplevessel
nullztuk le. A fermentci elrehaladtval a mintkat a pontos mrsek rdekben 0,6 OD al
kell hgtani. A kapott adatokat Microsoft Excel segtsgvel brzoltuk, gy kpet kaptunk a
sejktenyszet szaporodsrol.

2.1.12. Glkz koncentrcijnak mrse.

A glkz koncentrci mrsre, az erre a clra -20C lefagyasztott fellsz mintk egy
rszt hasznltuk fel. A mrsek kivitelezsre egy a kereskedelmi forgalomban is kaphat Accu-
Chek vrcukorszintmrt hasznltunk. A kszlkhez hasznlhat tesztcskokra 10 l mintt
pipettztunk, majd a tesztcskot a kszlkbe helyeztk. A kszlk az adatokat mg/dl rtkben
adta meg. A kszlk meglepen pontos mrsekre kpes, az ltalunk elvrt adatok megszerzsre
tkletesen alkalmas.

2.1.13. Ammnium klorid koncentrcijnak mrse.

A mrs kivitelezsre Hanna Instruments Hi 83224 kszlket hasznltunk. A mrsek

elvgzshez Ammnia HR puffer oldatra volt szksg, melyeket kis elre gyrtott a kszlkbe
specilisan illeszked kmcsvekben lehet megvsrolni. A kszlken belltottuk az Ammonia
HR programot, majd elksztettk a mintt. A kmcsben tallhat puffer oldathoz 10 szeres

28
hgtst alkalmazva 1 ml mintt pipettzunk, ezutn a kszlkbe helyezzk a mintt, s
lenullzzuk. Ezt kveten a kmcs tartalmhoz 4 csepp Nessler reagenst csepegtetnk, majd 3
perc elteltvel a kszlk lemri a mintt. Az rtkeket mg/l-ben kifejezve kirja a kszlk, majd
a hgtsi faktorral korriglt rtkeket brzolhatjuk.

2.1.14. Sejtek feltrsa

A fermentcik befejeztvel a bioreaktort sztszereltk s megtiszttottuk, a fermentlevet pedig

250 ml-es centrifugatubusba sztosztottuk s az ultracentrifuga segtsgvel 10000 rpm-en 10
percet cntrifugltuk. A centrifugls utn a fellszt elntttk, a lelepedett sejteket pedig
troltuk -80 C fokon tovbbi feldolgozsig.
Ezt kveten mechanikus sejtfeltrst alkalmaztunk, a lecentrifuglt sejteket a termelt
peptid konstrukcinak megfelel lizispufferben felszuszpendltuk. A PGU vektorkonstrukcit
tartalmaz sejteket hrom klnbz szakirodalom s tapasztalatok alapjn elksztett
lizispufferben trtuk fel. A PGG konstrukci s a YUH enzim konstrukcijra mr rendeletnk
msok ltal kidolgozott protokollokkal.
2.4. tblzat: Vektorkonstrukciknl alkalmazott klnbz lizis pufferek

PGU (His-tag) PGG (GST) YUH (His-tag)

pH 7.5 pH 8.5 pH 8.5 pH 7.4 pH 7.5

1X PBS 100 mM HEPES 100 mM TRIS 1X PBS 1X PBS

1 mM DTT 2 mM DTT 2 mM DTT 2 mM DTT 1 mM DTT

1 mM PMSF 1 mM PMSF 1 mM PMSF 1 mM PMSF 1 mM PMSF

0.1 % MP40 5% Glicerin 5% Glicerin 0,1% NP40 5% Glicerin

1X protez 1X Triton X-100 1% Triton X-100 1 mM EDTA 1X protez

inhibotor inhibotor

50 mM NaCl 50 mM NaCl 1X protez

inhibotor

1X protez 1X protez
inhibotor inhibotor

29
 A sejtfeltrshoz egy pneumatikus LM 10 Microfluidizert hasznltunk, amelyen keresztl
a felszuszpendlt sejteket ktszer tvezettk. A kszlket 18000 PSI nyomson zemeltettk a
hatkony sejtroncsols rdekben. Minden peptidtermel fermentci esetben 5 gramm sejtet
rtunk fel, 50 ml konstrukcinak megfelel lizis pufferben, hogy a kapott eredmnyeket knyebben
sszelehessen majd hasonltani. A YUH enzim expresszija sorn megtermelt teljes biomassza
tmeget feldolgoztuk s tiszttottuk.

2.1.15. Ultracentrifugls

A feltrt sejteket ezutn le kell centrifuglnunk, hogy, megszabaduljunk a sejttrmelkektl

s a lizispufferben oldhatatlan anyagoktl. Mivel a clpeptidnk a fzis partnerrel egytt
vzoldhat, ezrt a centrifuglst kveten a fellszban lesz a termknk. A centrifuglst egy
Thermo Scientific lynx 6000 ultracentrifugval vgeztk 1 orn kereszl 60000 g-s centrifuglis
ertrben.

2.1.16. Affinits kromatogrfia FPLC rendszeren

Az ultracentrifugls utn a kapott fellszt egy perisztaltikus pumpa segtsgvel egy

elre gyrtott 5 ml trfogat HisTrap HP Ni+ ion oszlopra visszk fel, vagy egy 5 ml trfogat
GSTrap FF glutation spharose oszlopra visszk fel konstrukcitl fggen. A mvelet eltt a
kromatogrfis oszlopokat kalibrlni kell gynevezett wash pufferrel, amely megegyezik a lizis
pufferekkel, kivve hogy His-tag oszlop esetben tartalmaz 30 mM imidazlt az oldat.
Az FPLC rendszeren az UNICORN 5.1 vezrlprogram segtsgvel elvgezhet miden
oszlopot rint mvelet. Az oszlopok kalibrlsa 5-10 CV (oszloptrfogat) wash pufferrel trtnik,
ha az oszlop hossz ideig trolva volt 20%-os etanolban akkor kalibrls eltt ultra tiszta vzzel
kell mosni 5 CV-t.
HisTrap oszlop esetben a clfehrje oszlopra val felvitele utn az oszlopot 5-10 CV
(column volum) kondicionl pufferrel mossuk, amely 20-40 mM imidazolt is tartalmaz, hogy
eltvoltsuk a szennyezdseket s a nem ktd fehrjket. Az elutls lpcss gradienssel
trtnik, esetnkben legclszerbb megolds ltalban a lpcss gradiens, ebben az esetben az
FPLC kszlk vezrlprogramjt gy lltjuk be, hogy figyelembe vve az elul puffer imidazol

30
koncentrcijt, az elutlst 200 mM-os imidazol koncentrcival kezdje A legtbb esetben ez a
koncentrci elegend az oszlopra kttt fehrjk levlasztsra.
GST oszlop esetben a kondicionl wash puffer teljesen megegyezik a lizis pufferrel,
mintafelvitel utn szintn mossuk az oszlopot, majd elulunk, viszont az elcis pufferben 20 mM
reduklt glutation van. Az FPLC programban a GST oszloprl trtn eluls sorn 1 lpcst
hasznlunk, 100%-ban az elcis pufferrel.
Mindkt oszlop s eljrs sorn az FPLC rendszer a konduktivits, s abszorbancia
mrsvel figyeli az oszloprl lefoly elcit. A
fehrjk oszloprl val lemossa sorn a
konduktivts cskken tendencit kell, mutasson,
mg az abszorbanci nvekvt, hiszen a
fehrjknek 260 nm hullmhosszon van
fnyelnyelsk, gy az eluls sorn FPLC
rendszerben kapunk egy kromatogramot. Ha
ismerjk az elvlasztott fehrje tulajdonsgait, s
az alkalmazott oszlop paramtereit, akkor az
FPLC vezrlprogramnak segtsgvel
kiszmthatjuk az elulodott fehrjnk 2.6. bra Az ltalunk hasznlt AKTA FPLC
rendszer egy glszr oszloppal mkds
koncentrcijt. Az elcit az FPLC rendszer kzben.
automatikus mintaszedvel elre belltott
trfogategysgekre osztva 5-50 ml mintaszed ednyekbe gyjti. Hasznlat utn kimostuk az
oszlopokat, 5-10 CV wash pufferrel, majd 20%-os etanolt nyomunk r, felksztve a trolsra, s
a befertzds elkerlsre. Gyri 5 ml-es oszlopok hasznlata esetn a tisztts sorn 5 ml/perc-
es trfogatramot hasznltunk miden lps sorn

2.1.17. Dializls

A dialzisre azrt van szksg, hogy megszabaduljunk az elulszertl, esetnkben az imidazoltl

s a reduklt glutationtl. A dializl puffer sok esetben megegyezik a lizis pufferrel. A tiszttott,
imidazolt tartalmaz fehrje oldatot egy 12.4 kDa tmrj dialzis membrnba helyezzk, mely a
prusain keresztl a 12.4 kDa-nl kisebb mret molekulkat engedi tdiffundlni a koncentrci

31
gradiensnek megfelelen. A dializis 4 oC hmrskleten egy mgneses kevervel kevertetett
mrhengerben vgeztk.

2.1.18. Gszrs

A az affinits kromatogrfit s a dialzist kveten szksg van a tovbbi tiszttsra, mivel

a mintk mg tartalmazhatnak szennyezdseket. A glszrs FPLC rendszeren trtnt egy
Superdex HiLoad 16/600 75pg oszlopon. Az oszlopot 2 CV wash pufferrel kondicionltuk, a
megengedett maximlis 1 ml/perc trfogatramon, majd felvittk a dializlt mintt. A clpeptid s
a szennyezdsek molekulatmegk szerint elvlnak az oszlopon, s a kapott kromatogram alapjn
megllaptottuk melyik frakciban kell keresni a tiszta termket. Az affinits kromatogrfik s a
glszrsek sorn kapott mintkat SDS-PAGE en folyamatosan ellenriztk.

2.1.19. Fzis partner emsztse

Utols lpsknt a GluA2 clpeptidet leemsztjk a fzis partnerrl. A GluA2-GST

konstrukcit thombin enzimmel kell emszteni. Az emszts PBS pufferben 1 ml vgtrfogatban
32o C -on, pH 7.5 s 3 orn keresztl zajlott. A GluA2-Ubiquitin konstrukcit pedig az ltalunk
megtermelt s tiszttott YUH enzimmel emsztettk, 1 ml vgtrfogatban a puffer tartalma: 20 mM
Trisz, 1 mM DTT, 0.5 mM EDTA. Ebben a pufferben 27o C-on, pH 8.5-n, 4 orn keresztl
emsztnk. Az emsztseket gyri SDS-PAGE gleken ellenriztk (Novex NuPAGE). Mindkt
emszts sorn 900 l szubszrtot s 100 l enzimet hasznltunk [40],[41].

2.1.20. Glelektroforzis 15%-os SDS-poliakrilamid-glben

Az expresszlt peptid-fuzispartner termkeket a tiszttsi lpsek sorn SDS-PAGE-el

ellenrizzk, lnyegben sztvlasztjuk molekulatmegk alapjn. A gl tartalmaz SDS-t (Na
dodecil szulftot), mely biztostja a fehrjnek a negatv tltst, gy feszltsg al helyezve a
fehrjk a pozitv prus fele kezdenek vndorolni a trhls szerkezet glmtrixban.
A gl kt rszbl ll: az als (futtat)- s a fels (koncentrl) gl. A fels glen
koncentrldnak a fehrjk, hogy megnvelve a feszltsget egyszerre induljon a molekulatmeg
szerinti elvlaszts, az als glen pedig sztvlnak a fehrje molekulk molekulatmegk alapjn,

32
 A mintkat 5 percig fzzk 95o C-on -merkaptoetanol-glicerin oldatban, gy a fehrjk
denaturldnak. Ezutn 5-10 l-t flvisznk a glre, 150V-on 80 percig.
Futtats utn az als glt kivesszk a kt veglap kzl s megfestjk Comassie Brilliant
Blue festket is tartalmaz oldattal. A felesleges festket kimossuk szntelent oldattal, majd
desztilllt vzben troljuk. Ezek utn elklnthetek lesznek a klnbz mret fehrjemolekulk
a molekulasly-markerhez viszonytva, melyet mr le lehet fnykpezni. Az egyese tiszttsi
lpsek sorn begyjttt mintkbl s azok SDS-PAG en val lefuttatsbl rengeteg informcit
gyjthetnk, a tiszttsi lpsek optimalizlhatsgt illeten, tovbb midig meggyzdhetnk,
hogy helyes irnyban haladunk vagy sem.

2.1.21. Fehrje mennyisgnek meghatrozsa

A peptidnk mennyisgnek meghatrozst fluorimetris mdszerrel vgeztk, melyez

Qubit 2.0 Fluorometer kszlket hasznltunk. A fehrjetisztts vgeredmnynl kapott elcikat
sszetltttk, s ezutn sszevortexeltk. A mrs kivitelezse rdekben az albbi protokollt
kvettk:
1. Az els lpsben elksztjk a reagl oldatot, amelyet mikrocentrifuga tubusban
mrnk ssze pipetta segtsgvel. A reagensoldat sszettele 199 l Qubit Protein puffer,
melyhez hozzadunk 1 l Qubit Reagent festket.
2. A kvetkez lpsben az elksztett reagensbl tpipettzunk 199 l-et 0,5 ml-es a
kszlkbe helyezhet mikrocentrifuga tubusba.
3. Az mikrocentrifuga tubus tartalmhoz ezutn hozzadunk 1 l mintt az elre sszekevert
a clfehrjnket tartalmaz elcibl.
4. Ezt kveten 1-2 percet vortexeljk a mintt, majd szobahmrskleten 15 percig
inkubljuk.
5. Az inkubcis id lejrta utn a mintt tartalmaz 0,5 ml-es mikrocentrifuga tubust
belehelyezzk a kszlkbe s lemrjk a fehrje koncentrcijt.
A kszlken be kell lltanunk az ltalunk hasznlt protokoll paramtereit, melynek ksznheten
a kszlk megtudja hatrozni a hgtsi faktorokat, s kitudja szmolni a trzsoldatok
fehrjekoncentrcijt. A kszlk mg/ml rtkben hatrozza meg a fehrjekoncentrcit.

33
3. Eredmnyek kirtkelse
A kutatsunk sorn ngy sikeres termel fermentcit s egy prba fermentcit vgeztk
l a biorektor gynevezett kalibrlsa rdekben. Az els kt termel fermentcit, kt Sartorius
Biostat A plus bioreaktorban prhuzamosan vgeztk, egyikben a PGG (GluA2-GST), mg a
msikban PGU (GluA2-Ubiquitin) konstrukcikat termeltettk meg. A kt sikeres fermentci
utn a sejtfeltrs lpeseit kvetve a PGG konstrukci termkt GST-affinits kromatogrfin
tiszttottuk, mg a PGU konstrukci esetben, Ni+ affinits kromatogrfit hasznltunk, mindkettt
FPLC rendszeren. A PGG konstrukci esetben rendelkeztnk elre kidolgozott tiszttsi
protokollal (Romn Tudomnyos Akadmi), addig az ltalunk ltrehozott PGU konstrukcira ki
kellett dolgozzuk a tiszttsi metdust (pufferek). Az affinits kromatogrfis tiszttsok utn a
kapott elcikat glszr oszlopon (FPLC) tovbb tiszttottuk s vgl a kt klnbz konstrukci
termkhozamt sszehasonltottuk. Mivel a PGU konstrukci bizonyult hatkonyabbnak
vgrehajtottunk egy sokkal magasabb biomassza hozamot produkl fermentcit, s jra
elvgeztk a termktiszttsi mveleteket, hogy megbizonyosodjunk az elz PGU fermentci
eredmnyeinek hitelessgrl. Vgs lpsknt a negyedik fermentcival megtermeltk a YUH
(Yeast Ubiquitin Hydrolase) enzimet, amelynek vektor konstrukcijval mr rendelkeztnk. A
YUH enzimet szintn, Ni+ affinits kromatogrfival tiszttottuk, glszrtk, mr meglv
protokollok alapjn, majd a tiszttott enzimmel lehastottuk az a Glua2 clpeptidnket az ubiquitin
fzis partnerrl. A hasts eredmnyessgt SDS-PAGE segtsgvel ellenriztk. Az
albbiakban rszletesen ismertetjk a kapott eredmnyeket.

3.1. Els prbafermentci eredmnyei

Az els fermentci sorn arra trekedtnk, hogy meghatrozzuk a sznforrsknt hasznlt

glkz valamint a nitrognforrsknt hasznlt ammnium-klorid fogysnak mrtkt, tovbb az
optikai denzits s a szraz sejttmeg alakulsa kztti sszefggst annak rdekben, hogy kpet
kapjunk a baktriumpopulci viselkedsrl s az egyes tpanyagkomponensek alaplevesbl
trtn hasznosulsrl. Ezen informcikra azrt van szksgnk, hogy egy megfelel rtpllsi
(Fed Batch) stratgit tudjunk kialaktani a minl nagyobb sejtszm elrse rdekben. Hiszen egy
magas sejtsrsget elr fermentci adott trfogatban tbb intracellulris termket jelent, egy
alacsony sejtsrsg fermentcihoz kpest.

34
 A fermentcis id 14 ra volt a rendszert 37C-on s pH 6.8 on tartottuk, az oldott
oxignszintet 30%-minimumra lltottuk, melyet a kevertets intenzitsnak nvekedse tartott
lland rtken, a leveg trfogatram 1.5 L/per. Az inokulummal trtn beolts utn a reaktorban
a sejtenyszet optikai denzitsa OD600= 0.342. A tpleves a beolts pillanatban 2 g/l glkzt s 2
g/l ammnium-kloridot tartalmazott ez a mrseink szerint 790 mg/l szabad NH3 koncentrcinak
felel meg.

Prbafermentci
16. 0.9
15.
14. 0.8
13.
12. 0.7
11. 0.6
10.
OD 600

9. 0.5
8.
7. 0.4

g/ml
6.
5. 0.3
4. 0.2
3.
2. 0.1
1.
0. 0.0
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00
id (h)
OD600 (GeneQuant) Glkz koncentrci(g/l) NH3 g/L

3.1. bra: Az els fermentci lefutsnak kpe

A fermentci sikeresen zajlott, sikerlt elvgeznnk a szksges mrseket, amelyek eredmnyeit
a fenti diagramon sszestettk. Az brn jl lthat, hogy a fermentci elrehaladtval az optikai
denzitsa, a sejtnvekedsre jellemz ltalnos modell szerint alakul, jl elklnthetek az egyes
nvekedsi szakaszok, az adaptcis szakasz, a gyorsul nvekedsi szakasz, az exponencilis
szakasz, valamint a hanyatl szakasz kezdete. A diagramon megfigyelhet, hogy a
szubsztrtfogys amely az adaptcis s a gyorsul nvekedsi szakasz sorn cskken tendencit
matat, mgnem tejesen elfogy. A glkz elfogyasztsnak idpontjt az oldott oxignszintben
bekvetkezett vltozsozsbl lehet megllaptani, hiszen ha a sejtenyszetnek nem ll
rendelkezsre sznforrs, teljesen lelassulnak a metabolikus folyamatok s lell a sejtlgzs. A
sejtlgzs lellst abbl ltjuk, hogy a tplevesben hirtelen megemelkedik az oldott oxign szintje.
Ennek szlelse utn a reaktorba steril szrn keresztl 4 ml (0.5g/ml) koncentrlt glkz oldatot
adunk. A glkzszint alakulst kvet brn megfigyelhet hogy a sejtenyszet az exponencilis
szakaszban 40 perc alatt kpes elfogyasztani 2 g glkzt. A fermentci sorn idkznknt

35
rtpllst alkalmaztunk. Fontos megjegyezni, hogy viszonylag alacsony glkz koncentrcival
(2g/l) dolgoztunk, hogy minl pontosabb kpet kapjunk a szubsztrt fogysnak s a sejtszm
nvekeds sszefggsrl.
A fermentci indtsakor, mint a fenti brn lthat az ammnia koncentrcija 790 mg/l
rtkrl indul, s a lefutsa a sejtszm (OD600) alakulshoz viszonytva fordtottan arnyos. Az
ammnia fogyst mutat grbn a diagram msodlagos tengelyn brzoltuk. A
sejtszmnvekeds s az ammniafogys profiljbl egyrtelmen kiderl, hogy hogy a
sejtszmnvekeds limitl tnyezje ebben az esetben a nitrognforrs kimerlse. Teht ha
rtpllssal biztostunk a sejttenyszet szmra tovbbi nitrognforrst, akkor a sejtnvekeds
exponencilis szakasza tovbb folytatdna. A sejtszmnvekeds s a nitrognforrs fogysa
kztti sszefggsbl tovbb az is kiderl, hogy a sejtenyszet fennmaradsa szempontjbl nem
egy drasztikus esemny a nitrognforrs elfogysa, hiszen megfigyelhet hogy nitrogn hinyban
egy stacioner (llandsult) llapot alakul ki, melyben nem figyelhet meg sejtszmnvekeds.
Ennek oka, hogy a sejtszaporulat sebessge megegyezik a sejtpusztuls sebessgvel, teht annyi
j sejt keletkezik, ahny elpusztul. Az j sejtek kpzsrt felels katabolikus folyamatok
mkdshez szksges nitrognforrst az elpusztult sejtek jrahasznostsbl fedezik a
baktriumok. A tovbbiakban szemlltetjk a fermentci sorn mrt szraz sejttmeg s az optikai
denzitsa kztti kapcsolatot

Fermentci I
16. 6.0
15.
14.
13. 5.0
12.
11. 4.0
10.
9.
OD 600

g/L

8. 3.0
7.
6.
5. 2.0
4.
3. 1.0
2.
1.
0. 0.0
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00
id (h)
OD600 (GeneQuant) DCW g/L

3.2. bra: Szraz sejttmeg s az optikai denzitsa alakulsa a prba fermentci sorn.

36
 Mint ahogy a fenti bra mutatja, az optikai denzitsa s a szraz sejttmeg (DCW)
grbje szorosan kveti egymst, ebbl arra lehet kvetkeztetni, hogy az OD600-on mrt
eredmnyek pontosak, a mrsre hasznlt mszer (GeneQvant) pedig a valsgnak megfelel
rtkeket ad. A fermentci sorn a legmagasabb OD600=15, amely tszmolva sejtszmra
600 15 = 1.2 1010 / (600 1 = 8 108 /). Ezen adatok ismeretben

3.2. GluA2-GST fermentci eredmnyei (PGG)

A fermentci clja megtermelni a GluA2-GST fzis fehrjt, majd a sejtfeltrs utn a

megfelel puffereket alkalmazva GST-oszlopon tiszttani, a kapott elcit dializlni, majd
glszrni. Vgl a GluA2 peptidet leemszteni a GST fzis partnerrl.
A fermentci paramtrerei a kzvetkezek voltak: 37C, pH 6.8, leveg trfogatrama 1.5
L/ perc. A magas sejtszm elrse rdekben a fermentci sorn glkz s ammnium klorid
trzsoldattal rtpllst vgeztnk. A fermentci alatt rnknt mintavteleztnk s
meghatroztuk az optikai denzitsa s a szraz sejttmeg alakulst, amely az 5. brn lthat.

GluA2-GST fermentci
40 16

35 14

30 12

25 10
OD 600

g/L

20 8

15 6

10 4

5 2

0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Id (h)
OD 600 IPTG DCW

3.4. bra: Szraz sejttmeg s az optikai denzitsa alakulsa a GluA2-GST fermentci sorn.

37
 A termel fermentcik sorn alkalmazott pontos rtpllsi mennyisgeket s az erre
kidolgozott stratgit jelen dolgozatban nem ismertetjk.
A bioreaktor beoltsnak pillanatban OD600= 0.6, ez rtk alapjn az inokulum megfelel
erssg lett, tudniillik ha egy fermentci indtsakor OD600= 0.3 sejtszmnl kisebb rtkrl
indulunk az expressis kultra sosem fog nvekedsi tendencit mutatni. Minta, ahogy a fenti bra
muataja a fermentci 15 rt vett ignybe. A termel kultrt OD600= 28 rtken, exponencilis
szakaszban indukltuk 1 ml 1M-os IPTG-vel. Az indukls utn nagyon jl megfigyelhet, hogy
az expresszi beindtsval megtrik a sejtosztds teme, s az E. coli sejtek a termkkpzsre
fordtjk az energit. Az indukls kveten a fermentort mg 4 orn keresztl zemeltettk, majd
a sejtenyszett feldolgoztuk. Ezen fermentcis krlmnyeken 4 ra indukls maximlisan elg
kell, legyen a magas hozam termkkpzshez.
A fermentci vgn elrtk az 600 36.2 = 2.9 1010 / sejtszmot, s 13.8 g/L
szraz sejktmeget. A nedves sejttmeg a fermentci vgn pedig 39.5 g/L volt.

3.3. GluA2-GST fzis komplex tisztts eredmnyei (PGG)

A fermentci utn 5 gramm nedves sejttmeget trtunk fel s 50 ml fellszt tiszttottunk

meg FPLC rendszeren GST oszlop segtsgvel. A GST oszloprl (5ml GSTrap) 8 ml elcit
gyjtttnk be, amely tartalmazza a GluA2-GST fzis fehrjt.

3.5. bra: 1,2,3,4,5 zsebek GST oszlop elcik.

38
 Mint ahogy a fenti glkpen ltszik a GST oszloprl leelult mintk meglehetsen kevs
szennyezdst tartalmaznak, ez azt jelenti, hogy a tiszttshoz hasznlt pufferek jl mkdtek. A
GluA2-GST fzis komplex 31.2 kDa tmeg, ebbl a GST 25 kDa mg a GluA2 6.2 kDa. A
glkpen jl lthat hagy a mintk a molekulaslyuknak megfelel magassgban vannak. A gl 15%
volt, viszont kiss tlfutott, ebbl tanulva az kvetkezend SDS-PAGE gleknl a futsi frontot midig
a gl vge eltt 1-2 cm-rel meglltottuk. A fenti glkpen a 6-7 es zsebben lthat mintk nem a
kutatsunkhoz tartoztak. Ezt kveten az elcibl 2 ml mintt glszrtnk Superdex HiLoad 16/600
75pg oszlopon, mely sorn 6 ml GluA2-GST fzis komplexet tartalmaz elcit kaptunk. A kapott
elci koncentrcijt Qubit 2.0 fluorimterrel mrtk meg, a 6 ml glszrt elciban 0.41 mg/ml
rtket mrtnk, amely megfelel 2.46 mg/6 ml rtknek. Ebbl az rtkbl visszaszmolva
megllapthat, hogy az 5 ml feltrt nedves sejttmegben 9.84 mg GluA2-GST fzis termk
nyerhet ki. Ha a teljes fermentci sorn kapott kzel 40 g nedves biomassza tmeg termktartalmt
nzzk, akkor megllapthatjuk, hogy 78.73 mg/l termket lehet kinyerni az ltalunk vgezett
fermentcibl. A kapott tk megfelel az tlagos GST fzis rendszer termelkenysgnek. Mivel a
GST fzis partner ipari hasznostsa a szakirodalom s az ltalunk kapott eredmnyek tkrben sem
elg produktv, gy ezzel a fzis konstrukcival nem fojtattunk tbb fermentcit s tiszttsi
ksrletet. Utols lpsknt lehastottuk a GluA2 clpeptidet a GST fzis partnerrl, thrombin
(termo) enzim felhasznlsval.

3.6. bra: Glszrt GluA2-GST emsztse thrombinnal.

39
 A fenti glkpen jl lthat, hogy az emszts vgbement, igaz nem tkletesen, viszont mint
az els s az utols zsebben is lthat 6.2 kDa krnyken megjelenik a leemsztett GluA2 clpeptid.
Tekintettel a kapott eredmnyekre ez a konstrukci egyltaln nem alkalmas ipari hasznostsra a
gyenge kihozatal s a Ni+ affinitsnl relatv magasabb tiszttsi kltsgek miatt.

3.4. GluA2-Ubiqiutin fermentci eredmnyei

A fermentci sorn azonos krlmnyeket alkalmaztunk, mint a GluA2-GST fermentci

setben, itt csak a sejtekbe beletranszformlt vektorkonstrukciban volt a klnbsg. A kt
fermentcit, mint mr emltettk prhuzamosan vgeztk, gy szinte azonos eredmnyeket
kaptunk a lefuts s a biomassza tmeg alakulst figyelembe vve.

40
GluA2-Ubiquitin I fermentci 14

35 12

30
10
25
8
OD 600

g/L
20
6
15
4
10

5 2

0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
id (h)
OD 600 IPTG

3.7. bra: GluA2-Ubiquitin fermentci lefutsnak profilja.

A reaktorban a beoltst kveten a kezdeti OD600= 0.77 rtket mutatott, a termel kultrt
szintn exponencilis szakaszban indukltuk OD600= 23.8 rtken. Itt is megfigyelhet az indukls
miatt bekvetkez stacioner fzis kialakulsa. Az indukls 1 ml 1M-os IPTG-vel trtnt, idtartama
pedig szintn 4 ra volt. A fermetci vgn 600 32 = 2.5 1010 / rtknek felel meg, a
szraz sejttmeg 12.2 g/L volt, a nedves sejttmeg pedig 35 g/L

40
3.5. GluA2-Ubiqiutin fzis komplex tiszttsnak eredmnyei (PGU)

Mivel az ltalunk ltrehozott konstrukcira mg nem ltezett kidolgozott tiszttsi protokoll,

ezrt a mr ismertetett 3 klnbz puffer csalddal prblkoztunk, amelyet szakirodalom s sajt
tapasztalatok alapjn lltottunk ssze.

3.1. tblzat: PUG konstrukci tiszttshoz hasznlt alap pufferek.

PGU (His-tag)

PBS puffer HEPES puffer TRIS puffer

pH 7.5 pH 7.5 pH 7.5

1X PBS 100 mM HEPES 100 mM TRIS

1 mM DTT 2 mM DTT 2 mM DTT

1 mM PMSF 1 mM PMSF 1 mM PMSF

0.1 % MP40 5% Glicerin 5% Glicerin

1X Triton X-100 1% Triton X-100
1X protez inhibotor
50 mM NaCl 50 mM NaCl

1X protez inhibotor 1X protez inhibotor

Mint lthat a tisztts sorn PBS, HEPES, TRIS alap pufferekkel is hasznltunk, az ltaluk
produklt termk koncentrcikat sszehasonltottuk. Miden a 3 puffercsalddal vgigvittk a
tisztts lpseit a glszrsig, miden esetben pedig 5 g nedves sejttmeget trtunk fel hogy
sszehasonlthat eredmnyeket kapjunk.
Elsknt a PBS alap pufferrel prblkoztunk a His-tag oszlopon val tisztts eredmnye
nem kecsegtetett sok jval, mivel az elci sorn meglehetsen szennyezett mintt kaptunk, ami
azt jelentette, hogy rengeteg fehrje agreglodott s nem specifikusan megtapadt az oszlopon. A
moss sorn az alacsony imidazol koncentrci nem volt kpes lemosni a szennyezdseke, viszont
az eluls sorn alkalmazott 200 mM imidazol koncentrci mr eltvoltott midet az oszloprl.
Az elutls sorn 10 ml elcit kaptunk, melybl szintn 2 ml mintt vittnk tovbb gzszrsre.

41
A glszrs sikeres volt 8 ml elcit kaptunk, viszont alacsony termkkihozatalt rtnk el a PBS
puffer alkalmazsval. A Qubit 2.0 fluorimter mrseire alapozva 0.11 mg/ml rtket kaptunk,
amelybl visszaszmolva az 5 gramm feltrt sejtbl 4.4 mg termket tudtunk kitermelni.

3.8. bra: GluA2-Ubiquitin PBS-pufferrel trtn tisztts eredmnyei.

A fenti glkpen jl ltszik, hogy a His-tag oszloprl szrmaz elci mennyire

szennyezett, tovbb a gzszrs sorn sem lett tkletesen tiszta a vgtermk. GluA2-Ubiquitin
fzis konstrukci 14.6 kDa molekulatmeg, mint lthat a megfelel helyen tallhat a glben.
Elvgeztk a tiszttsi lpseket HEPES s TRIS alap pufferekkel, melyek sorn a
kvetkez eredmnyek szlettek:
Affinits kromatogrfia utn HEPES pufferekkel 20 ml elcit kaptunk, ebbl 2 ml
glszrtnk, mely utn 10 ml elcit kaptunk (koncentrci fggvnyben glszrs sorn
kihgul a minta), ennek a 10 ml elcinak a koncentrcija 0.5 mg/ml volt, visszaszmolva
az 5 g feltrt nedves sejttmegre, 50 mg tiszta termket lehet gy kinyerni.
Affinits kromatogrfia utn TRISZ pufferekkel 8 ml elcit kaptunk, ebbl 2 ml
glszrtnk, mely utn 8 ml elcit kaptunk, ennek a 8 ml elcinak a koncentrcija 0.22
mg/ml volt, visszaszmolva az 5 g feltrt nedves sejttmegre, 7.04 mg tiszta termket lehet
gy kinyerni.

42
 Az albbi glkpen a HEPES s a TRIS pufferekkel trtn tiszttsi lpsei sorn gyjttt
mintk lthatak, ahol jl megfigyelhet, hogy a HEPES pufferekkel trtn tisztts tlagon felli
eredmnyeket produkl az elci viszonylag tiszta, s lthat hogy gszlrs sorn a termk
teljesen megtisztult. A TRIS s a PBS pufferek hatkonysga messze elmarad a HEPES puffertl.

3.9. bra: GluA2-Ubiquitin TRIS s HEPES pufferekkel trtn tisztts eredmnyei.

A glkpen tovbb lthat hogy megtermeltk a YUH enzimet, amellyel le tudjuk majd hastani
a GluA2 peptidet az Ubiqiutin fzis partnerrl. Az enzimet szintn fermentorban lltottuk el,
a tiszttsi lpeseket kveten 40 mg tiszta enzimet lltottunk el, melybl egy nagyon keveset
felhasznltunk a hasts kiprblsra, a tbbit meg lefagyasztottuk.
A glkp utols zsebben megprbltuk a tiszttott GluA2-Ubiquitin-t emszteni a glszrt
YUH enzimmel, de mivel nem megfelel kondcikat alkalmaztunk nem ment vgbe az emszts.
sszegezve a tiszttsi eredmnyeket a kvetez szmtott hozamokat kapjuk az egyes
pufferek alkalmazsa esetn (3.2. tblzat). Mint lthat a megfelel puffer alkalmazsval tlagon
felli eredmny rhet el.

43
 3.2. tblzat: PUG konstrukci hozama.

PGU (His-tag)

Elmleti hozam PBS puffer HEPES puffer TRIS puffer

5 g nedves sejt 4.4 mg 50 mg 7.04 mg

35 g/L nedves sejt 30,8 mg/L 350 mg/L 49.28 mg/L

3.6. GluA2-Ubiqiutin msodik fermentci eredmnyei

A katatsunk sorn vgrehajtottunk egy msodik fermentcit a PGU konstrukcival,

melynek clja magasa biomassza hozam elrse volt, hogy maximalizlni tudjuk az elmleti
termkkihozatalt. A fermentcit az elzvel megegyez paramtereken vgeztk kivve a
induklst, amelyet egy magasabb sejtszmon hajtottunk vgre.

GluA2-Ubiquitin II fermentci
85 35
80
75
30
70
65
60 25
55
50 20
OD 600

45

g/L
40
35 15
30
25 10
20
15
5
10
5
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
id (h)
OD 600 IPTG

3.10. bra: GluA2-Ubiquitin msodik fermentci lefutsnak profilja.

A fermantci sorn a ksi induklsnak s a folyamatos rtpllsnak ksznheten sokkal

nagyobb biomassza hozamot rtnk el, ebbl kifolylag sokkal nagyobb termkhozamra is

44
szmtottunk. A fermentci vgn, 600 32 = 6.08 1010 / rtknek felel meg, a szraz
sejttmeg 29 g/L volt, a nedves sejttmeg pedig 84 g/L volt.
HEPES pufferek alkalmazsval ebbl a fermentcibl szrmaz 5 g nedves sejttmeget
feldolgoztunk, s megtiszttottuk az elz fermentci eredmnyeinek reproduklsa rdekben. Az
affinits kromatogrfia sorn az FPLC rendszeren a kvetkez kromatogramot kaptuk:

3.11. bra: GluA2-Ubiquitin affinits kormatogrammja.

45
 A lps sorn az els 10 elci tartalmt gyjtttk ssze, amely megfelel 20 ml elcinak.
Ezt kveten ismt 2 ml mintt vittnk fel gzszr oszlopra, amelyrl ismt 10 ml mintt fogtam
fel. A gzszrs FPLC kromatogrammja a lenti brn lthat.

3.12. bra: GluA2-Ubiquitin glszrs kormatogramm.

Az brn a msodik cscs alatti terlet tartalmazza azokat a frakcikat emleyben a glszrt GluA2-
Ubiquitin tiszttott fehrje tallhat (10ml). A kromatogrammon lthat els cscs a mintban lv

46
szennyezdseket tartalmazza. Az glszrs elcijnak koncentrcijt megmrve ismt 0.5 mg/ ml
koncentrcit kaptunk, amely pontosan megfelel az elz tisztts eredmnyeinek. A tisztts sorn
megmrtk a His-tag oszloprl begyjttt elcik sszfehrje tartalmt melyben 67 mg fehrje vlt
detektlhat. A glszrs utni fehrjekoncentrcival sszehasonltva megllapthat hogy a His-
tag oszloprl elelult mintban 17 mg szennyez fehrje volt, amelyet a glszrs sorn sikerlt
eltvoltani. A glszrs sorn kapott elci tisztasgt lthatjuk az albbi 3.13 brn. Teht 5 gramm
nedves sejttmegbl ismt 50 mg tiszta termket lehet kinyerni. Figyelembe vve hogy e fermentci
sorn sokkal nagyobb 84 g/L nedves sejttmeget lltottunk el, az 1 literre vettet termkhozam teht
840 mg/L termket jelent.

3.7. GluA2-Ubiqiutin fzis komplex emsztse YUH enzimmel

A megtermelt YUH enzim segtsgvel elvgeztk a GluA2 leemsztst az Ubiquitinrl, az

alkalmazott protokolt az anyag s modszer fejezetben lertiuk.

3.13. bra: GluA2-Ubiquitin emsztse YUH enzimmel.

47
 Mint a glkpen lthat a YUH enzim az optimlis krlmnyeken maradktalanul emsztist
hajt vgre, jl elklnthetek a keletkezett termkek [40].

4. Kvetkeztetsek

Mivel sikerl elrnnk a kitztt clokat katatsunk sikeresnek mondhat, hiszen sikerlt j
megkzeltseket alkalmazunk, s taln a szerencsnek ksznheten is tlagon feli eredmnyeket
elrni.
Mint ahogy az utols fermentci eredmnyeibl is lthat sikerlt 1 L vgtrfogatban 840
mg GluA2-Ubiquitin fzis fehrjt expresszlni. Az eredmnyek meglepek, hiszen HEPES
pufferek alkalmazsval messze tlagon felli eredmnyeket rtnk el [42],[43]. GluA2 clpeptid
ebben az esetben az expresszlt fzis komplex mintegy 42.5%-t teszi ki, teht eredmnyeink
alapjn 357 mg tiszta clpeptid kitermelse rhet el az ltalunk fejlesztett mdszer alapjn. Az
expresszi tovbbi optimalizlsa s a nagyobb sejtszm elrsvel ez a hozam mg legalbb 20-
30%-kal nvelhet, hiszen tapasztalataink, s ms expresszik sorn mr sikerl 100 g/L nedves
sejktmeget elrnnk bioreaktorban. Az expresszi hozama vetekszik a hagyomnyosan
zrvnyestekbe (inclusion body) termeltetett rekombinns fehrjk hozamval [44]. Mg a
zrvnytestes expresszi sorn a fehrjket oldhatv kell tenni, ami egy meglehetsen drga s
komplikltabb tiszttsi protokoll, addig az ltalunk termelt peptdidkomplexet vzoldhat formban
tudtuk kitermelni a sejtekbl, egyszer tiszttsi mdszereket alkalmazva [45].
Az elrt eredmnyeink alapjn kijelenthet hogy az Ubiquitin fzis fehrje tkletesen
alkalmas peptidek bioszintzisnek kivitelezsre, hiszen elhrtja a peptidexpresszi tjban lv
szinte sszes akadlyt, s tlagon felli hozamokat eredmnyez a megfelel tiszttsi protokoll
kidolgozsa esetn. Ebbl kvetkezik, hogy az ltalunk kidolgozott eljrs kivlan alkalmas lehet
akr ipari mrtk peptidexpresszira is, hiszen olcsn kivitelezhet, nagy hozamot produkl. Vgl
pedig a mdszer egy kivl alternatva lehelten a gygyszeripar szmra, amellyel cskkenthet
lehetne a kmiai szintzissel ellltott terpis peptidek gyrtsi kltsge.
A jvben szeretnnk ms peptidekkel is kiprblni a konstrukcit, s tovbb finomtani a
tiszttst, valamint optimalizlni az expresszi idtartamt, s nvelni a sejtszmot az adott
trfogatbl trtn mg nagyobb termkkihozatal rdekben [42],[43],[44].

48
5. Hivatkozsok

[1] U.S. Food and drug Administration: http://www.registrarcorp.com/ (2016).

[2]TransparencyMarketResearch:http://www.transparencymarketresearch.com/pressrelease/peptide-
therapeutics-market.htm (2016).
[3] Life Tein: http://www.lifetein.com/ (2016).
[4] Mybiosource: http://www.mybiosource.com (2016).
[5] Huszka, Beta. Az exendin-4 minifehrje lete a DNS-tl az NMR-ig.(2010)
[6] Vermasvuori, Raisa. "Production of recombinant proteins and monoclonal antibodies-Techno-
enonomical evaluation of the production methods." (2009).
[7] Merlin, Matilde, et al. "Comparative evaluation of recombinant protein production in different
biofactories: the green perspective." BioMed research international 2014 (2014).
[8] Bray, Brian L. "Large-scale manufacture of peptide therapeutics by chemical synthesis." Nature
Reviews Drug Discovery 2.7 (2003): 587-593.
[9] Bourgin, Daniel. "Challenges in Industrial Production of Peptides." (2005). LONZA

[10] Rov, Petra. "A TC5b minifehrje szerkezetstabilizl shdjnak vizsglata NMR
spektroszkpia segtsgvel. (2008)
[11] Grslund, Susanne, et al. "The use of systematic N-and C-terminal deletions to promote
production and structural studies of recombinant proteins." Protein expression and purification 58.2
(2008): 210-221.
[12] Osborne, Michael J., et al. "Efficient expression of isotopically labeled peptides for high
resolution NMR studies: Application to the Cdc42/Rac binding domains of virulent kinases in
Candida albicans*." Journal of biomolecular NMR 26.4 (2003): 317-326.
[13] Michalikov, Csilla. "Rekombinns DNS technolgia." (2013).
[14] Gntechnolgia s fehrjemrnksg, elektronikus-jegyzet szerzk: Az ELTE Biokmiai
Tanszk Munkakzssge, szerkeszt: Nyitray Lszl
[15] Juhsz, gnes. "Plazmidok s felhasznlsuk a gntechnolgiban." (2012).
[16] Studier, F. William, et al. "[6] Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned
genes." Methods in enzymology 185 (1990): 60-89.

49
[17] Studier, F. William, and Barbara A. Moffatt. "Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to
direct selective high-level expression of cloned genes." Journal of molecular biology 189.1 (1986):
113-130.
[18] Studier, F. William. "Use of bacteriophage T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression
system." Journal of molecular biology 219.1 (1991): 37-44.
[19] Novagen.. 2002-2003. Protein Expression: Prokaryotic Expression: pETBlue and pET System
Overview. Novagen 2002-2003 Catalog. p 84-91.
<http://www.novagen.com/SharedImages/Novagen/05_PROEXP.pdf>. Accessed 2003 Feb 17.
[20] Bardczy, Viola. IN VITRO TRANSZLCIS VEKTOROK FEJLESZTSE S
ALKALMAZSA PHD DOLGOZAT (2009).
[21] Szemecz Bla, Heterolg fehrjk expresszijra alkalmas rendszer fejlesztse,(2005)
[22] Kohno, Toshiyuki, et al. "A new general method for the biosynthesis of stable isotope-enriched
peptides using a decahistidine-tagged ubiquitin fusion system: an application to the production of
mastoparan-X uniformly enriched with 15N and 15N/13C." Journal of biomolecular NMR 12.1
(1998): 109-121.
[23] Wang, Zhongyuan, et al. "Ubiquitin-intein and SUMO2-intein fusion systems for enhanced
protein production and purification." Protein expression and purification 82.1 (2012): 174-178.
[24] I. SEJTFELTRS IPARI KINYERSTECHNIKA GYAKORLAT BIOMRNK MSc
[25] Lrincz, A. Nemnyi, M. (2002): Az in vitro sejtfeltrs hatkonysgt befolysol fizikai
tnyezk (2. rsz). Laboratriumi Informcis Magazin, Biofizika rovat. XI. vfolyam, No. 2. pp. 36-
38.
[26] Horvthn Szanics, Enik. Proteomikai mdszerek alkalmazsa klnbz eredet fehrjk
vizsglatra. Diss. Budapesti Corvinus Egyetem, 2007.
[27] KTA Protein Purification Systems (KTA FPLC): http://www.gelifesciences.com (2016).
[28] Elek, Lszl Rbert. "Affinits kromatogrfia." (2014).
[29] Hengen, Paul N. "Purification of His-Tag fusion proteins from Escherichia coli."Trends in
biochemical sciences 20.7 (1995): 285-286.
[30] Szamos, Jen. Hromfzis megoszls alkalmazsa lelmiszerfehrjk vizsglatban. Diss.
Budapesti Corvinus Egyetem, 2004.
[31] Nam, Hee-Geun, Tae-Hyun Kim, and Sungyong Mun. "Effect of Ethanol Content on Adsorption
Equilibria of Some Useful Amino Acids in Poly-4-vinylpyridine Chromatography." Journal of
Chemical & Engineering Data 55.9 (2010): 3327-3333.

50
[32] Sgor, va Rka. "Fordtott fzis HPLC kolonnk alkalmazhatsgnak sszehasonltsa
sterigmatocystin mikotoxin kimutatsra." (2013).
[33] Hagel, Lars. "Gelfiltration chromatography." Current Protocols in Molecular Biology (1998):
10-9.
[34] Bozga, G., and O. Muntean. "Reactoare chimice (reactoare omogene)." vol. I, Editura Tehnica,
pp470-480 (2000).
[35] Leibold, C., et al. "A real-time monitoring system controller for medical tissue engineering
bioreactors." Consumer Electronics (ICCE), 2015 IEEE International Conference on. IEEE, 2015.
[36] Francis, Dana M., Rebecca Page, and Wolfgang Peti. "Sequence-specific backbone 1H, 13C and
15N assignments of the 34 kDa catalytic domain of PTPN5 (STEP)." Biomolecular NMR
assignments 8.1 (2014): 185-188.
[37] brahm B., Miklossy I. (2009/2010): Biokmia I. gyakorlatok, Cskszereda
[38] Schmidt, F. R. "Optimization and scale up of industrial fermentation processes." Applied
microbiology and biotechnology 68.4 (2005): 425-435.
[39] Nakano, K., et al. "Influence of acetic acid on the growth of Escherichia coli K12 during high-
cell-density cultivation in a dialysis reactor." Applied microbiology and biotechnology 48.5
[40] Yu, Hyun-Ah, et al. "Characterization of ubiquitin C-terminal hydrolase 1 (YUH1) from
Saccharomyces cerevisiae expressed in recombinant Escherichia coli." Protein expression and
purification 56.1 (2007): 20-26.
[41] You, Ho Jin, Rebecca L. Swanson, and Paul W. Doetsch. "Saccharomyces cerevisiae possesses
two functional homologues of Escherichia coli endonuclease III." Biochemistry 37.17 (1998): 6033-
6040.
[42] Susanna Leong, School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological
University, Singapore CBAS, 17-19 July 2007
[43] Cho, Chung Woo, Sun Ho Park, and Doo Hyun Nam. "Production and purification of single
chain human insulin precursors with various fusion peptides." Biotechnology and Bioprocess
Engineering 6.2 (2001): 144-149.
[44] Schmidt, Michael, et al. "Temperature-induced production of recombinant human insulin in
high-cell density cultures of recombinant Escherichia coli."Journal of biotechnology 68.1 (1999): 71-
83.
[45] Singh, Anupam, et al. "Protein recovery from inclusion bodies of Escherichia coli using mild
solubilization process." Microbial cell factories 14.1 (2015): 1.

51
[46] Glazyrina, Julia, et al. "High cell density cultivation and recombinant protein production with
Escherichia coli in a rocking-motion-type bioreactor." Microbial cell factories 9.1 (2010): 1.
[47] Zhou, Chuncai, et al. "High potency and broad-spectrum antimicrobial peptides synthesized via
ring-opening polymerization of -aminoacid-N-carboxyanhydrides." Biomacromolecules 11.1
(2009): 60-67.
[48] Pilon, A., et al. "Ubiquitin fusion technology: bioprocessing of peptides."Biotechnology
progress 13.4 (1997): 374-379.

52