Spektrofotometer

Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spektrometer
dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang
tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorpsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika energi
tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang
gelombang. Kelebihan spektrofotometer dibandingkan fotometer adalah panjang gelombang
dari sinar putih lebih dapat terseleksi dan ini diperoleh dengan alat pengurai seperti prisma,
grating ataupun celah optis.
Pada fotometer filter, sinar dengan panjang gelombang yang diinginkan diperoleh
dengan berbagai filter dari berbagai warna yang mempunyai spesifikasi melewatkan trayek
panjang gelombang tertentu. Pada fotometer filter, tidak mungkin diperoleh panjang
gelombang yang benar-benar monokromatis, melainkan suatu trayek panjang gelombang 30-
40 nm. Sedangkan pada spektrofotometer, panjang gelombang yang benar-benar terseleksi
dapat diperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. Suatu spektrofotometer
tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu, monokromator, sel pengabsorpsi untuk
larutan sampel atau blangko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorpsi antara sampel
dan blangko ataupun pembanding (Khopkar SM,1990).
Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik analisis spektroskopik yang memakai
sumber REM (radiasi elektromagnetik) ultraviolet dekat (190-380 nm) dan sinar tampak
(380-780 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer. Spektrofotometri UV-Vis
melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga
spektrofotometri UVVis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan
kualitatif.
Spektroskopi UV/VIS merupakan metode penting yang mapan, andal dan akurat.
Dengan menggunakan spektroskopi UV/VIS, substansi tak dikenal dapat diidentifikasi dan
konsentrasi substansi yang dikenal dapat ditentukan. Pelarut untuk spektroskopi UV harus
memiliki sifat pelarut yang baik dan memancarkan sinar UV dalam rentang UV yang luas.
Spektrofotometer Uv-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur transmitansi,
reflektansi dan absorbsi dari cuplikan sebagai fungsi dari panjang gelombang.
Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan alat yang terdiri dari spektrometer dan
fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang
tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorbsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya secara relatif jika
energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang
gelombang. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum sinar tampak yang
sinambung dan monokromatis. Sel pengabsorbsi untuk mengukur perbedaan absorbsi antara
cuplikan dengan blanko ataupun pembanding.
Spektrofotometer Uv-Vis merupakan spektrofotometer yang digunakan untuk
pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak. Semua metode spektrofotometri
berdasarkan pada serapan sinar oleh senyawa yang ditentukan, sinar yang digunakan adalah
sinar yang semonokromatis mungkin.
Spektrofotometer UV-Vis (Ultra Violet-Visible) adalah salah satu dari sekian banyak
instrumen yang biasa digunakan dalam menganalisa suatu senyawa kimia. Spektrofotometer
umum digunakan karena kemampuannya dalam menganalisa begitu banyak senyawa kimia
serta kepraktisannya dalam hal preparasi sampel apabila dibandingkan dengan beberapa
metode analisa.
Spektrofotometri UV/Vis melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada
molekul yang dianalisis, sehingga spetrofotometer UV/Vis lebih banyak dpakai ntuk analisis
kuantitatif dibanding kualitatif.
Spektrofotometri UV-vis adalah pengukuran serapan cahaya di daerah ultraviolet
(200350 nm) dan sinar tampak (350 800 nm) oleh suatu senyawa. Serapan cahaya uv atau
cahaya tampak mengakibatkan transisi elektronik, yaitu promosi elektron-elektron dari orbital
keadaan dasar yang berenergi rendah ke orbital keadaan tereksitasi berenergi lebih tinggi.
Absorbsi
Absorbsi cahaya UV-Vis mengakibatkan transisi elektronik, yaitu promosi electron-
electron dari orbital keadaan dasar yang berenergi rendah ke orbital keadaan tereksitasi
berenergi lebih tinggi. Energi yang terserap kemudian terbuang sebagai cahaya atau
tersalurkan dalam reaksi kimia. Absorbsi cahaya tampak dan radiasi ultraviolet meningkatkan
energi elektronik sebuah molekul, artinya energi yang disumbangkan oleh foton-foton
memungkinkan electron-electron itu mengatasi kekangan inti dan pindah ke luar ke orbital
baru yag lebih tinggi energinya. Semua molekul dapat menyerap radiasi dalam daerah UV-
tampak karena mereka mengandung electron, baik sekutu maupun menyendiri, yang dapat
dieksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi.

Absorbsi untuk transisi electron seharusnya tampak pada panjang gelombang diskrit
sebagai suatu spectrum garis atau peak tajam namun ternyata berbeda. Spektrum UV maupun
tampak terdiri dari pita absorbsi, lebar pada daerah panjang gelombang yang lebar. Ini
disebabkan terbaginya keadaan dasar dan keadaan eksitasi sebuah molekul dalam subtingkat-
subtingkat rotasi dan vibrasi. Transisi elektronik dapat terjadi dari subtingkat apa saja dari
keadaan dasar ke subtingkat apa saja dari keadaan eksitasi. Karena berbagi transisi ini
berbeda energi sedikit sekali, maka panjang gelombang absorpsinya juga berbeda sedikit dan
menimbulkan pita lebar yang tampak dalam spectrum itu.

Absorptivitas (a) merupakan suatu konstanta yang tidak tergantung pada konsentrasi,
tebal kuvet dan intensitas radiasi yang mengenai larutan sampel. Absorptivitas tergantung
pada suhu, pelarut, struktur molekul, dan panjang gelombang radiasi. Satuan a ditentukan
oleh satuan-satuan b dan c. Jika satuan c dalam molar (M) maka absorptivitas disebut dengan
absorptivitas molar dan disimbolkan dengan dengan satuan M -1
cm-1 atau liter.mol-1cm-1.
Jika c dinyatakan dalam persen berat/volume (g/100mL) maka absorptivitas dapat ditulis
dengan E1%1cmA1%1cm (Gandjar dan Rohman, 2007).

Komponen-komponen Pada spektrofotometer

Yang pertama adalah sumber cahaya, Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer,
haruslah memiliki pancaran radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi.Sumber energi cahaya
yang biasa untuk daerah tampak, ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu
pijar dengan kawat rambut terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola
lampu pijar biasa, daerah panjanggelombang ( ) adalah 350 2200 nanometer (nm). sumber
cahaya ini digunakan untuk radiasi kontinyu:

Untuk daerah UV dan daerah tampak

Lampu wolfram (lampu pijar) menghasilkan
Hal kedua yang diperlukan adalah pembaur cahaya yang kerennya disebut
monokromator yang di video memberikan sinar pelangi, karena dari sana lah kemudian kita
bisa memilih panjang gelombang yang diinginka/diperlukan. Pada video yang diperlihatkan
sinar tampak atau untuk spektro visible, tapi untuk UV pun kerjanya sama, hanya saja tidak
akan terlihat oleh mata kita.

Hal ketiga adalah tempat sampel atau kuvet, pada praktikum tempat meletakan kuvet
ada dua karena alat yang dipakai tipe double beam, disanalah kita menyimpan sample dan
yang satu lagi untuk blanko. Pada pengukuran di daerah sinar tampak digunakan kuvet kaca
dan daerah UV digunakan kuvet kuarsa serta kristal garam untuk daerah IR.
 Keempat adalah detektor atau pembaca cahaya yang diteruskan oleh sampel, disini
terjadi pengubahan data sinar menjadi angka yang akan ditampilkan pada reader (komputer).
Komponen lain yang nampak penting adalah cermin-cermin dan tentunya slit (celah kecil)
untuk membuat sinar terfokus dan tidak membaur tentunya, jadi satu hal penting dalam
pekerjaan dengan spektrofotometer Uv-Vis adalah harus dihindari adanya cahaya yang masuk
ke dalam alat, biasanya pada saat menutup tenpat kuvet, karena bila ada cahaya lain otomatis
jumlah cahaya yang diukur menjadi bertambah.

Cara kerja spektrofotometer

Cara kerja spektrofotometer secara singkat adalah sebagai berikut. Tempatkan larutan
pembanding, misalnya blangko dalam sel pertama sedangkan larutan yang akan dianalisis
pada sel kedua. Kemudian pilih foto sel yang cocok 200nm-650nm (650nm-1100nm) agar
daerah yang diperlukan dapat terliputi. Dengan ruang foto sel dalam keadaan tertutup nol
galvanometer didapat dengan menggunakan tombol dark-current. Pilih h yang diinginkan,
buka fotosel dan lewatkan berkas cahaya pada blangko dan nol galvanometer didapat
dengan memutar tombol sensitivitas. Dengan menggunakan tombol transmitansi, kemudian
atur besarnya pada 100%. Lewatkan berkas cahaya pada larutan sampel yang akan dianalisis.
Skala absorbansi menunjukkan absorbansi larutan sampel.
Berikut prinsip / cara kerja alat spektrofotometer:

Gambar 1. Prinsip / cara kerja spektrofotometer

Tipe Instrumen Spektrofotometer

Pada umumnya terdapat dua tipe instrumen spektrofotometer, yaitu single-beam dan
double-beam. gambar Single-beam instrument dan Double-beam instrument

1. Single-beam instrument
 Single-beam instrument dapat digunakan untuk kuantitatif dengan mengukur
absorbansi pada panjang gelombang tunggal. Single-beam instrument mempunyai beberapa
keuntungan yaitu sederhana, harganya murah, dan mengurangi biaya yang ada merupakan
keuntungan yang nyata. Beberapa instrumen menghasilkan single-beam instrument untuk
pengukuran sinar ultra violet dan sinar tampak. Panjang gelombang paling rendah adalah 190
sampai 210 nm dan paling tinggi adalah 800 sampai 1000 nm (Skoog, DA, 1996).

2. Double-beam instrument
Double-beam dibuat untuk digunakan pada panjang gelombang 190 sampai 750 nm.
Double-beam instrument dimana mempunyai dua sinar yang dibentuk oleh potongan cermin
yang berbentuk V yang disebut pemecah sinar. Sinar pertama melewati larutan blangko dan
sinar kedua secara serentak melewati sampel, mencocokkan foto detektor yang keluar
menjelaskan perbandingan yang ditetapkan secara elektronik dan ditunjukkan oleh alat
pembaca (Skoog, DA, 1996).

Spektrofotometer Infra Merah (IR)

Spektrofotometer Infra Merah (IR) merupakan suatu metode mengamati interaksi
molekul dengan radiasi elektromagnetik yang berada pada daerah panjang gelombang 0,75
1000 m. Radiasi elektromagnetik dikemukakan pertama kali oleh James Clark Maxwell,
yang menyatakan bahwa cahaya secara fisis merupakan gelombang elektromagnetik, artinya
mempunyai vektor listrik dan vektor magnetik yang keduanya saling tegak lurus dengan arah
rambatan. Berikkut adalah gambaran berkas radiasi elektromagnetik :

Saat ini telah dikenal berbagai macam gelombang elektromagnetik dengan rentang
panjang gelombang tertentu. Spektrum elektromagnetik merupakan kumpulan spektrum dari
berbagai panjang gelombang. Berdasarkan pembagian daerah panjang gelombang, sinar infra
merah dibagi atas tiga daerah: daerah infra merah dekat, daerah infra merah pertengahan,
daerah infra merah jauh.

Dalam pembagian daerah spektrum infra merah tersebut, daerah panjang gelombang
yang digunakan pada alat spektrofotometer infra merah adalah pada daerah infra merah
pertengahan, yaitu pada panjang gelombang 2,5 50 m.

Dalam hal ini, interaksi antara sinar infra merah dengan molekul hanya menyebabkan
vibrasi, yaitu bergerak pada tempatnya. Dasar spektrofotometri infra merah digambarkan oleh
Hook, dimana didasarkan atas senyawa yang teriri dari 2 atom atau diatom yang mana
digambarkan dengan dua buah bola yang saling terikat oleh pegas seperti berikut:
Berdasarkan gambar di atas, jika pegas direntangkan atau ditekan pada jarak keseimbangan
tersebut maka energi potensial dari sisem tersebut akan naik.

Setiap senyawa pada keadaan tertentu telah mempunyai tiga macam gerak, yaitu:

1. Gerak translasi, yaitu perpindahan dari satu titik ke titik lain

2. Gerak Rotasi, yaitu berputar pada pororsnya

3. Gerak Vibrasi, yaitu bergetar pada tempatnya saja

Bila ikatan bergetar, maka energi vibrasi terus menerus dan secara periodik berubah
dari energi kinetik ke energi potensial dan sebaliknya. Jumlah energi total adalah sebanding
dengan frekuensi vibrasi dan tetapan gaya (k) dari pegas dan massa (m1 dan m2) dari dua
atom yang terikat. Energi yang dimiliki oleh sinar infra merah hanya cukup kuat untuk
mengadakan perubahan vibrasi.

Perubahan Energi Vibrasi

Atom atom di dalam molekul tidak dalam keadaan diam, tetapi biasanya terjadi
peristiwa vibrasi. Hal ini bergantung pada atom atom dan kekuatan ikatan yang
menghubungkannya. Vibrasi molekul sangat khas untuk suatu molekul tertentu dan biasanya
disebut finger print. Vibrasi molekul dapat digolongkan atas dua golongan besar, yaitu:

1. Vibrasi regangan (Streching), adalah peristiwa bergeraknya atom terus sepanjang

ikatan yajng menghubungkannya sehingga akan terjadi perubahan jarak antara
keduanya, walaupun sudut ikatan tidak berubah. Vibrasi regangan ada dua, yaiut
regangan simetri (unit struktur bergerak bersamaan dan searah dalam satu bidang
datar) dan regangan asimetri (unit struktur bergerak bersamaan dan tidak searah tetapi
masih dalam satu bidang datar).
2. Vibrasi Bengkokan (Bending), jika sistem tiga atom merupakan bagian dari sebuah
molekul yang lebih besar, maka dapat menimbulkan vibrasi bengkokan atau vibrasi
deformasi yang mempengaruhi osilasi atom molekul secara keseluruhan. Vibrasi
bengkokan ini terbagi menjadi empat jenis, yaitu: Vibrasi goyangan(rocking), vibrasi
guntingan (Scissoring), vibrasi kibasan (Wagging), vibrasi pelintiran (Twisting).

Daerah Spektrum Infra Merah

Para ahli kimia telah memetakan ribuan spektrum infra merah dan menentukan panjang
gelombang absorbsi masing-masing gugus fungsi. Vibrasi suatu gugus fungsi spesifik pada
bilangan gelombang tertentu.
Daerah Identifikasi

Vibrasi yang digunakan untuk identifikasi adalah vibrasi bengkokan, khususnya

goyangan (rocking), yaitu yang berada di daerah bilangan gelombang 2000 400 cm-1.
Karena di daerah antara 4000 2000 cm-1 merupakan daerah yang khusus yang berguna
untuk identifkasi gugus fungsional. Daerah ini menunjukkan absorbsi yang disebabkan oleh
vibrasi regangan. Sedangkan daerah antara 2000 400 cm-1 seringkali sangat rumit, karena
vibrasi regangan maupun bengkokan mengakibatkan absorbsi pada daerah tersebut.

Dalam daerah 2000 400 cm-1 tiap senyawa organik mempunyai absorbsi yang unik,
sehingga daerah tersebut sering juga disebut sebagai daerah sidik jari (fingerprint region).
Meskipun pada daerah 4000 2000 cm-1 menunjukkan absorbsi yang sama, pada daerah
2000 400 cm-1 juga harus menunjukkan pola yang sama sehingga dapat disimpulkan bahwa
dua senyawa adalah sama.

Sumber sinar infra merah

Pada umumnya, sumber infra merah yang sering di pakai adalah berupa zat pada inert
yang dipanaskan dengan listrik hingga mencapai suhu antara 1500-2000 K. Akibat
pemanasan ini akan dipancarkan sinar infra merah yang kontinyu.
Jenis-jenis Sumber Infra Merah
1. Nerst glower, terbuat dari campuran oksida unsur lantanida
2. Globar, berbentuk batang yang terbuat dari silicon karbida
3. Kawat Ni-Cr yang dipijarkan, sumber radiasi untuk instrument ini berbentuk gulungan
kawat Ni-Cr yang dipanaskan kira-kira sampai 1000 C, menghasilkan suatu spektrum
kontinyu dari energi elektromagnetik yang mencakup daerah dari 4000-200 cm-1 bilangan
gelombang. Energi yang diradiasi oleh sumber sinar akan dibagi menjadi dua bentuk kaca
sferik M1 dan M2.
Instrumen Spektrofotometer Infra Merah (IR)
Komponen dasar spektrofotometer IR sama dengan UV tampak , tetapi
sumber,detektor dan komponen optiknya sedikit berbeda. Mula-mula sinar infra marah di
lewatkan melaui sampel dan laritan pambanding kemudian di laewatkan pada monokromator
untuk menghilangkan sinar yang tidak diinginkan. Berkas ini kemudian dididspersikan
melalui prisma atau gratting. Dengan melewatkannya melalui slit, sinar akan di fokuskan
pada detektor. Alat IR biasanya dapat merekam sendiri absorbansinya sendiri. Temperatur
dan kelembpan juga harus di atur yaitu maksimum 50% dan apabial melebihi bats tersebut
maka menbuat permukaan prisma dan sel alkali halida menjadi suram.
 Sumber radiasi yang serin di gunakan adalah Nernest atau lampu Glower yang di buat
dari oksida-oksida zirkonium dan natrium, berupa batang berongga denga diameter 2mm dan
panjang 30mm. Batang ini di panaskan sampai suhu1500-20000C dan akan memberikan
radiasi diatas 7000cm-1. Sumber Glower juga di gunkan dalam instrumen dengan absorbansi
sekitar 5200cm-1.
Monokromator yang di gunakkan dalam infra merah terbuat dari berbagai macam
bahan antara lain gelas, lelehan silika, LiF, CaF2, BaF2,NaCl, AgCl, KBr, Csl. Tetapi pada
ummnya prisma NaCl di gunakan yuntuk daerah 4000-6000cm-1 dan prisma Kbruntuk
400cm-1.
Untuk detektor dalam infra merah digunakan detektor termal. Di antara detektor
termal , termokopellah yang banyak di gunakan. Bolometer memberikan sinyal listrik sebagai
hasil perubahan dalam tahanan konduktor metal dengan temperatur .
Untuk intrumen yang di gunakan umumnya ada 2 macam intrumen yaitu u tuk
analisis kuantitatif dan untuk analisis kualitatif. Karena kompleksnya spektrum IR maka di
gunakan recorder . umunya alat IR digunaka berkas ganda yang di rancang lebih sederhana
drai pada berkas tunggal. Dalam semua instrumen selalu ada chopper frekuensi rendah untuk
menyesuaikan output sumber. Rancangan optisnya mirip denga spektrofotometer UV-tampk
kecuali tempat sampel dan pembandingan di tempatkan di antara sumber dan monokromator
untuk menghamburkan sinar yang berasal dari sampel dan untuk mencegah terjadinya
penguraian secara fotokimia. Sumber sinar di bagi menjadi dua berkas , satu di ewatkan pada
sampel dan yang satu melewati pembanding, kemudain secara berturt-turut melewati
attenuator dan chopper. Setelah melalui prisma, berkas jatuh pad detektor dan di ubah
menjadi sinyal listrik yang di rekam oleh recorder. Kadang kadang di perlukan amplifier
bila sinyal lemah. Pada pengukuran kuantitatif model berkas ganda kurang begitu
memuaskan karena banyak ganguan dari sirkuit elektronik dan pengaturan titik nol besar
sehinngga menyebabkan kesalahan.
Sinar dari sumber dibagi dalam 2 berkas yang sama, satu berkas melalui cuplikan dan
satu berkas lainnya sebagai baku. Fungsi model berkas ganda adalah mengukur perbedaan
intensitas antara 2 berkas pada setiap panjang gelombang. Kedua berkas itu dipantulkan pada
chopper yang berupa cermin berputar. Hal ini menyebabkan berkas cuplikan dan berkas
baku dipantulkan secara bergantian ke kisi difraksi. Kisi difraksi berputar lambat, setiap
frekuensi dikirim ke detektor yang mengubah energi panas menjadi energi listrik.
Jika pada suatu frekuensi cuplikan menyerap sinar maka detektor akan menerima
intensitas berkas baku yang besar dan berkas cuplikan yang lemah secara bergantian. Hal ini
menimbulkan arus listrik bolak-balik dalam detektor dan akan diperkuat oleh amplifier. Jika
cuplikan tidak menyerap sinar, berarti intensitas berkas cuplikan sama dengan intensitas
berkas baku dan hal ini tidak menimbulkan arus bolak-balik, tetapi arus searah. Amplifier
dibuat hanya untuk arus bolak-balik.
Arus bolak-balik yang terjadi ini digunakan untuk menjalankan suatu motor yang
dihubungkan dengan suatu alat penghalang berkas sinar yang disebut baji optik. Baji optik ini
oleh motor dapat digerakkan turun naik ke dalam berkas baku sehingga akan mengurangi
intensitasnya yang akan diteruskan ke detektor. Baji optik ini digerakkan sedemikian jauh ke
dalam berkas baku sehingga intensitasnya dikurangi dengan jumlah yang sama banyaknya
dengan jumlah pengurangan intensitas berkas cuplikan, jika cuplikan melakukan penyerapan.
Gerakan baji ini dihubungkan secara mekanik dengan pena alat rekorder sehingga gerakan
baji ini merupakan pita serapan pada spektrum tersebut.
Secara singkat sistem kerjanya seperti ini sebuah cuplikan ynag ditempatkan di dalam
spektrofotometer infra merah dan dikenai radiasi infra merah yang berubah panjang
gelombangnya secara berkesinambungan menyerap cahaya jika radiasi yang masuk
bersesuaian dengan energi getaran molekul tertentu. Spektrofotometer infra merah memayar
daerah rentangan dan lenturan molekul. Penyerapan radiasi dicatat dan menghasilkan sebuah
spektrum infra merah. Hadirnya sebuah puncak serapan dalam daerah gugus fungsi sebuah
spektrum infra merah hampir selalu merupakan petunjuk pasti bahwa beberapa gugus fungsi
tertentu terdapat dalam senyawa cuplikan. Demikian pula, tidak adanya puncak dalam bagian
tertentu dari daerah gugus fungsi sebuah spektrum infra merah biasanya berarti bahwa gugus
tersebut yang menyerap pada daerah itu tidak ada.

Gambar 2. Skema IR
Kromatoigrafi
Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan yang dewasa ini telah banyak
digunakan, dibandingkan dengan metode yang lainnya seperti detilasi, kristalisasi,
pengendapan, ekstraksi, dan lain-lain mempunyai keuntungan dalam pelaksanaan yang lebih
sederhana, penggunaan waktu yang sangat singkat terutama mempunyai kepekaan yang
tinggi serta mempunyai kemampuan memisahkan yang tinggi, Metode ini digunakan, jika
dengan metode lain tidak dapat di lakukan misalnya karena jumlah cuplikan sangat sedikit
atau campurannya kompleks.
Meskipun dasar kromatografi adalah suatu proses pemisahan namun banyak diantara
cara ini dapat digunakan untuk analisi kuatitatif. Jenis-jenis kromatografi yang bermanfaat
dalam analisi kualitatif dan analisis kuantitatif adalah kromatografi kertas, kromatigrafi lapis
tipis (KLT), kromatografi kolom, kromatografi gas, dan kromatografi cair kinerja tinggi.
Kromatografi kertas dan KLT pada umunya lebih bermanfaat untuk tujuan indentifikasi,
karena lebih mudah dan sederhana.
Kromatografi kolom memberikan pemilihan fase diam yang lebih luas dan berguna
untuk pemisahan campuran secara kuantitatif. Dalam indutri metode ini banyak dipakaiuntuk
menghilangkan zat-zat yang tidak diinginkandalam hasil, misalnya pada pemurnian minyak
tanah atau minyak goring dan pemurnian hidroksida yang dihasilkan dari proses elektrolisis.
Teknik pemisahan kromatografi dilakukan untuk mendapatkan pemisahan campuran
diantara dua fase. Fase tersebut adalah fase diam dan fase gerak. Fase diam dapat berupa zat
cair dan zat padat, sedangkan fase gerak dapat berupa zat cair atau gas.
Kromatografi dapat bersifat preparatif maupun analitik. Tujuan kromatografi
preparatif biasanya adalah untuk memisahkan senyawa dalam campuran (biasanya digunakan
untuk pemurnian). Kromatografi analitik digunakan untuk mengetahui perbandingan senyawa
dalam campuran.
Dalam kromatografi, dikenal beberapa istilah, antara lain:
1. Analit adalah zat yang dipisahkan.
2. Kromatogram adalah output visual yang diperoleh dari hasil pemisahan. Adanya puncak
karakterisitik yang berbeda menunjukkan adanya senyawa yang berbeda.
3. Eluen adalah pelarut yang digunakan untuk memisahkan analit.
4. Fasa gerak adalah fasa zat yang bergerak pada arah tertentu.
5. Fasa diam adalah fasa yang tetap pada tempatnya.
6. Waktu retensi adalah waktu yang diperlukan analit untuk melewati sistem.
7. Volume retensi adalah volume fasa gerak yang dibutuhkan untuk mengelusi komponen
analit.
Penggolongan kromatografi ada 3 yaitu :
1. Berdasarkan prinsip/mekanisme pemisahan
2. Berdasarkan fase yang digunakan
3. Berdasarkan alat yang digunakan
Kromatografi Berdasarkan prinsip/mekanisme pemisahannya pemisahannya,
kromatografi dapat dibedakan menjadi: (a) kromatografi adsorpsi; (b) kromatografi
partisi; (c) kromatografi penukar ion; (d) kromatografi eksklusi ukuran; (e)
kromatografi afinitas.
Kromatografi berdasarkan fase yang digunakan dapat dibedakan menjadi (a)
kromatografi Padat cair; (b) kromatografi Padat cair; (c) kromatografi Cair cair
(k.partisi); (d) kromatografi Gas cair
Kromatografi Berdasarkan alat yang digunakan dapat dibedakan menjadi
(a) Kromatografi planar; (b) HPLC; (c) Kromatografi kertas; (d) Kromatografi cair
kinerja tinggi; (e) kromatogarfi vakum; (f) kromatografi kolom.
Kromatografi Gas (GC)
Kromatografi gas adalah suatu metode analisis yang didasarkan pemisahan fisik zat
organik atau anorganik yang stabil pada pemanasan dan mudah diatsirikan. Pada umumnya
kegunaan kromatografi gas adalah untuk melakukan pemisahan dan identifikasi senyawa
yang mudah menguap dan juga untuk melakukan analisis kualitatif dan kuantitatif senyawa
dalam campuran. Dalam kromatografi gas, fase bergeraknya adalah gas dan zat terlarut
terpisah sebagai uap. Pemisahan tercapai dengan partisi sampel antara fase gas bergerak dan
fase diam berupa cairan dengan titik didih tinggi (tidak mudah menguap) yang terikat pada
zat padat penunjangnya.
GC menggunakan gas sebagai gas pembawa/fase geraknya. Ada 2 jenis kromatografi
gas, yaitu :
1. Kromatografi gascair (KGC) yang fase diamnya berupa cairan yang diikatkan pada
suatu pendukung sehingga solut akan terlarut dalam fase diam.
2. Kromatografi gas-padat (KGP), yang fase diamnya berupa padatan dan kadang-kadang
berupa polimerik.
Prinsip kromatografi gas: Pada dasarnya prinsip yang digunakan pada kromatografi
gas dan HPLC secara garis besar adalah sama karena sama-sama menggunakan kolom, hanya
saja pada kromatografi gas, sampel yang diinjeksikan harus yang tahan panas karena
menggunakan gas pembakar. Disamping itu pada kromatografi gas, selain oleh afinitasnya
terhadap fase diam maupun fase gerak, pemisahannya juga ditentukan oleh titik didih
keatsirian dari sampel.
 Fase Diam Dan Fase Gerak Pada Kromatografi Gas
1) Fase Diam
Pemilihan fasa diam juga harus disesuaikan dengan sampel yang akan dipisahkan.
Untuk sampel yang bersifat polar sebaiknya digunakan fasa diam yang polar. Begitupun
untuk sampel yang nonpolar, digunakan fasa diam yang nonpolar agar pemisahan dapat
berlangsung lebih sempurna.
Fase diam pada Kromatografi Gas biasanya berupa cairan yang disaputkan pada
bahan penyangga padat yang lembab, bukan senyawa padat yang berfungsi sebagai
permukaan yang menyerap (kromatografi gas-padat). Sistem gas-padat telah dipakai secara
luas dalam pemurnian gas dan penghilangan asap, tetapi kurang kegunaannya dalam
kromatografi. Pemakaian fase cair memungkinkan kita memilih dari sejumlah fase diam yang
sangat beragam yang akan memisahkan hampir segala macam campuran.
2) Fase Gerak
Disebut juga sebagai gas pembawa. Fungsi utamanya adalah untuk membawa uap
analit melalui system kromatografi tanpa berinteraksi dengan komponen-komponen sampel.
Adapun syarat-syarat fase gerak pada kromatografi gas yaitu sebagai berikut::
- Tidak reaktif
- Murni (agar tidak mempengaruhi detector)
- Dapat disimpan dalam tangki tekanan tinggi. Biasanya mengandung gas helium, nitrogen,
hydrogen, atau campuran argon dan metana
- Pemilihan gas pembawa yang digunakan tergantung dari detektor apa yang digunakan.

Komponen dalam Kromatografi Gas

Adapun komponen-komponen dari kromatografi gas yaitu sebagai berikut :

Gambar 3. Komponen kromatografi gas

1. Gas Pembawa
Gas pembawa harus bersifat inert artinya gas ini tidak bereaksi dengan
cuplikan ataupun fasa diamnya. Gas ini disimpan dalam silinder baja bertekanan
tinggi sehingga gas ini akan mengalir cepat dengan sendirinya. Karena aliran gas
yang cepat inilah maka pemisahan dengan kromatografi gas berlangsung hanya
dalam beberapa menit saja.
Gas pembawa yang biasa digunakan adalah gas argon, helium, hidrogen dan
nitrogen. Gas nitrogen memerlukan kecepatan alir yang lambat (10 cm/detik) untuk
mencapai efisiensi yang optimum dengan HETP (High Eficiency Theoretical Plate)
minimum. Sementara hidrogen dan helium dapat dialirkan lebih cepat untuk
mencapai efisiensi optimumnya, 35 cm/detik untuk gas hidrogen dan 25 cm/detik
untuk helium. Dengan kenaikan laju alir, kinerja hidrogen berkurang sedikir demi
sedikit sedangkan kinerja nitrogen berkurang secara drastis.
Semakin cepat solut berkesetimbangan di antara fasa diam dan fasa gerak
maka semakin kecil pula faktor transfer massa. Difusi solut yang cepat membantu
mempercepat kesetimbangan di antara dua fasa tersebut, sehingga efisiensinya
meningkat (HETP nya menurun). Pada kecepatan alir tinggi, solut berdifusi lebih
cepat melalui hidrogen dan helium daripada melalui nitrogen. Hal inilah yang
menyebabkan hidrogen dan helium memberikan resolusi yang lebih baik daripada
nitrogen. Hidrogen memiliki efisiensi yang relatif stabil dengan adanya perubahan
kecepatan alir. Namun, hidrogen mudah meledak jika terjadi kontrak dengan udara.
Biasanya, helium banyak digunakan sebagai penggantinya. Kotoran yang terdapat
dalam carrier gas dapat bereaksi dengan fasa diam. Oleh karena itu, gas yang
digunakan sebagai gas pembawa yang relatif kecil sehingga tidak akan merusak
kolom. Biasanya terdapat saringan (molecular saeive) untuk menghilangkan kotoran
yang berupa air dan hidrokarbon dalam gas pembawa . Pemilihan gas pembawa
biasanya disesuaikan dengan jenis detektor.
2. Injektor
Sampel dapat berupa gas atau cairan dengan syarat sampel harus mudah menguap
saat diinjeksikan dan stabil pada suhu operasional (50-300 C). Injektor berada
dalam oven yang temperaturnya dapat dikontrol. Suhu injektor biasanya 50 C di atas
titik didih cuplikan. Jumlah cuplikan yang diinjeksikan sekitar 5 L. Tempat
pemasukkan cuplikan cair pada kolom pak biasanya terbuat dari tabung gelas di
dalam blok logam panas. Injeksi sampel menggunakan semprit kecil. Jarum semprit
 menembus lempengan karet tebal disebut septum yang mana akan mengubah
bentuknya kembali secara otomatis ketika semprit ditarik keluar.
Untuk cuplikan berupa gas dapat dimasukkan dengan menggunakan alat suntik gas
(gas-tight syringe) atau kran gas (gas-sampling valve). Alat pemasukan cuplikan
untuk kolom terbuka dikelompokkan ke dalam dua kategori yaitu injeksi split (split
injection) dan injeksi splitless (splitless injection). Injeksi split dimaksudkan untuk
mengurangi volume cuplikan yang masuk ke kolom. Cuplikan yang masuk biasanya
hanya 0,1 % hingga 10 % dari 0,1-2 L, sementara sisanya dibuang.
3. Kolom
Kolom pada umumnya terbuat dari baja tahan karat atau terkadang dapat terbuat dari
gelas. Kolom kaca digunakan bila untuk memisahkan cuplikan yang mengandung komponen
yang dapat terurai jika kontak dengan logam. Diameter kolom yang digunakan biasanya 3
mm 6 mm dengan panjang antara 2-3 m. kolom dibentuk melingkar agar dapat dengan
mudah dimasukkan ke dalam oven ( thermostat ).
Kolom adalah tempat berlangsungnya proses pemisahan komponen yang terkandung
dalam cuplikan. Di dalam kolom terdapat fasa diam yang dapat berupa cairan, wax, atau
padatan dengan titik didih rendah. Fasa diam ini harus sukar menguap, memiliki tekanan uap
rendah, titik didihnya tinggi (minimal 100 C di atas suhu operasi kolom) dan stabil secara
kimia. Fasa diam ini melekat pada adsorben. Adsorben yang digunakan harus memiliki
ukuran yang seragam dan cukup kuat agar tidak hancur saat dimasukkan ke dalam kolom.
Adsorben biasanya terbuat dari celite yang berasal dari bahan diatomae. Cairan yang
digunakan sebagai fasa diam di antaranya adalah hidrokarbon bertitik didih tinggi, silicone
oils, waxes, ester polimer, eter dan amida. (The Techniques). Pemilihan fasa diam juga harus
disesuaikan dengan sampel yang akan dipisahkan. Untuk sampel yang bersifat polar
sebaiknya digunakan fasa diam yang polar. Begitupun untuk sampel yang nonpolar,
digunakan fasa diam yang nonpolar agar pemisahan dapat berlangsung lebih sempurna.
Ada dua tipe kolom yang biasa digunakan dalam kromatografi gas, yaitu kolom pak
(packed column) dan kolom terbuka (open tubular column).
- Kolom pak (packed column)
Kolom pak terbuat dari stainless steel atau gelas Pyrex. Gelas Pyrex digunakan jika
cuplikan yang akan dipisahkan bersifat labil secara termal. Diameter kolom pak berkisar
antara 3 6 mm dengan panjang 1 5 m. kolom diisi dengan zat padat halus sebagai zat
pendukung dan fasa diam berupa zat cair kental yang melekat pada zat pendukung. Kolom
pak dapat menampung jumlah cuplikan yang banyak sehingga disukai untuk tujuan
preparatif. Kolom yang terbuat dari stainless steel biasa dicuci dengan HCl terlarut, kemudian
ditambah dengan air diikuti dengan methanol, aseton, metilen diklorida dan n-heksana.
Proses pencucian ini untuk menghilangkan karat dan noda yang berasal dari agen pelumas
yang digunakan saat membuat kolom. Kolom pak diisi dengan 5% polyethylene glycol
adipate dengan efisiensi kolom sebesar 40,000 theoretical plates
- Kolom terbuka (open tubular column)
Kolom terbuka terbuat dari stainless steel atau quartz. Berdiameter antara 0,1 0,7 mm
dengan panjang berkisar antara 15 - 100 m. semakin panjang kolom maka akan efisiensinya
semakin besar dan perbedaan waktu retensi antara komponen satu dengan komponen lain
semakin besar dan akan meningkatkan selektivitas. Penggunaan kolom terbuka memberikan
resolusi yang lebih tinggi daripada kolom pak. Tidak seperti pada kolom pak, pada kolom
terbuka fasa geraknya tidak mengalami hambatan ketika melewati kolom sehingga waktu
analisis menggunakan kolom ini lebih singkat daripada jika menggunakan kolom pak.

4. Termostat (Oven)
Termostat (oven) adalah tempat penyimpanan kolom. Suhu kolom harus dikontrol.
Temperatur kolom bervariasi antara 50C - 250C. Suhu injektor lebih rendah dari suhu
kolom dan suhu kolom lebih rendah daripada suhu detektor. Suhu kolom optimum
bergantung pada titik didih cuplikan dan derajat pemisahan yang diinginkan.
Operasi GC dapat dilakukan secara isotermal dan terprogram. Analisis yang
dilakukan secara isotermal digunakan untuk memisahkan cuplikan yang komponen-
komponen penyusunnya memiliki perbedaan titik didih yang dekat, sedangkan sistem
terprogram digunakan untuk memisahkan cuplikan yang perbedaan titik didihnya jauh.

5. Detektor
Detektor adalah komponen yang ditempatkan pada ujung kolom GC yang
menganalisis aliran gas yang keluar dan memberikan data kepada perekam data yang
menyajikan hasil kromatogram secara grafik. Detektor menunjukkan dan mengukur jumlah
komponen yang dipisahkan oleh gas pembawa. Alat ini akan mengubah analit yang telah
terpisahkan dan dibawa oleh gas pembawa menjadi sinyal listrik yang proporsional. Oleh
karena itu, alat ini tidak boleh memberikan respon terhadap gas pembawa yang mengalir pada
waktu yang bersamaan. Beberapa detektor yang dapat digunakan antara lain: detektor hantar
bahang (DHB), detektor ionisasi nyala (FID), detektor tangkap ion, dan lain sebagainya.
6. Rekorder
Rekorder berfungsi sebagai pencetak hasil percobaan pada lembaran kertas berupa
kumpulan puncak, yang selanjutnya disebut sebagai kromatogram. Seperti telah
diberitahukan diawal, jumlah puncak dalam kromatogram menyatakan jumlah komponen
penyusun campuran. Sedangkan luas puncak menyatakan kuantitas komponennya.

Gambar 4. Diagram kromatografi gas