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DNA 抽出

1. 2ml Tube に乾燥葉 10-50mg を入れ、ジルコニアビーズを 1-2 個入れる。

2. 粉砕器にセットし、25Hz/2min の粉砕を 2 回以上行う。
3. Tube 内壁の粉末を落とし、2×CTAB 液 800μl・2-メルカプトエタノール 16
μl 加え、よく混和する。
4. 55℃のヒートブロックで、40-50 分間インキュベーション。数分度にかき混
ぜる。
5. クロロホルム・イソアミルアルコール(25:1)を 800μl 加え、よく混和する。
6. 遠心（13000-15000rpm・10000G/20℃/10min）
7. 新しい 2ml Tube を用意し、上層をピペットマンで(700μl 程度)移す。
8. 再度クロロホルム・イソアミルアルコール(25:1)を 800μl 加え、よく混和す
る。
9. 遠心（13000-15000rpm・10000G/20℃/10min）
10. 新しい 1.5ml Tube を用意し、上層をピペットマン(600μl 程度)で移す。
11. イソプロパノール（400μl/回収した CTAB 液の 2/3 量）を加え、Tube の上
下を数回ひっくり返してやさしく、転倒混和させる。
12. -20℃で 30min-数時間放置。
13. 遠心（13000rpm-15000rpm・10000G/4℃/15min）
14. DNA の沈殿を確認後、DNA が落ちないように注意しながら上澄みを捨てる。
キムワイプを Tube の蓋に挟み、Tube を逆さまにして放置（５min）
15. 70%エタノールを 1000μl 加え、転倒混和する。
16. 遠心（13000-15000rpm・10000G/4℃/5min）
17. 14-16 を繰り返す。
18. 70%エタノールを捨てた後、キムワイプを Tube の蓋に挟み、Tube を逆さ
まにして放置（５min）。
19. 蓋を開けたまま、アルミホイルをかぶせて、55℃のヒートブロックにおき、
残っているエタノールを完全に揮発させる（10-15min）。
20. 沈殿の量に応じて、TE 溶液を 50-200μl 加えて、溶かす。
21. 電気泳動と分光光度計によって、DNA の濃度と質のチェックのあと、
Template 用と Total DNA 用に DNA を分ける。