El efecto del pH en la actividad enzimatica, se determin6 utilizando diferentes amortiguadores a 1 mM CaCl durante Ia reaccién enzimatica. Para el pH 2.5 se us6 250 mM Glicina-HCl, 1 mM CaCl, para el pH 5.5 se usé 360 mM acetato sodio, 1 mM CaCh. ya pH 75 ¥9 se us6 100 mM Tris-HCl. 1 mM CaCl ajustando los valores de pla 7.5 y 9 con écido clorhidrico concentrado. Cada ensayo a diferentes valores de pH se realizd por triplicado. Las jig de fésforo (P) en las muestras se calcularon mediante una interpolaciéa matemitica del valor de atsorbancia de 1a muestra en la curva de absorbancia ws jg de fosforo, utlizando el método de minimos cvadrados, y tomando en cuenta el factor de dilucién de la muestra. Las unidades de ftasa en U/mL se calcularon com la siguiente ecvacion: Be20eRD) ar Ulm: Donde los Pr son los 1g de fosforo liberado del fitato por la accicn de la fitasa de Ja mmestra y se obtuvieron de la siguiente ecuscién: Pi=Pu-(Pis+ Pas} Los Puvson los 1g de fésforo liberados de la muestra. Pas son los ug de fésforo liberados del blanco de sustrato, Pay son los yg de fosforo liberados del blanco de muestra; 20 es un factor de conversién calculado como el inverso del volumen de snvestra usado en la seaccién enzimitica expresado en mL. (0.05 mL), FD es el factor de dilucién inicial (antes de la reaccién enzimética) o final (después de Ia reacciéa enzimnitica) de la mmestra 0 el producto de ambos, t equivale al tiempo de incubaciéa de 4a reaccion enzimitica (30 min) a 37°C, y 31 es el peso atémico del fosforo. En los diferentes ensayos el FD fue variable antes de hacer Ia reaccién enzimitica o después de ella dependiendo de la muestra y del ensayo. Los cilculos se realizaron con Ta ayuda del programa Microsoft Excel para Windows XP.‘La determinacién de la actividad de fitasa se llev6 a cabo mediante el método escrito por Kim y colaboradores, 1998 (Kim ef al, 1998a). Este método se basa en el incremento de fosfato inorgénico liberado a partir de dcido fitico o sus sales durante la reaccién por unidad de tiempo. El fosfato inorgénico liberado reacciona con el molibdato de amonio formando un complejo iéaico que al ser reducido absorbe la fuz visible de 820 nm y puede ser determinado por espectrofotometria. Una unidad de fitasa en Um es considerada como los umoles de fisforo liberado por minuto por mL de muestra, bajo 12s condiciones evaluadas, generaimente a 37°C durante 30 min (Kim et al, 1998). Las fitasas son usadas como aditivos en alimentos para animales mejorando la biodisponibilidad de fosfato y reduciendo Ia perdida de fosfatos y cationes divalentes del fitato. Enel uso de las fitasas como aditivos en los alimentos para dietas de animales, es deseable que estas enzimas presenten termoestabilidad entre 80 a 100 °C, temperaturas cempleadas durante el proceso del peletizado del alimento para animales, El sustrato utilizado para Ia reaccién enzimitica fue el acido fitico (sal dodecasédica del acide hexafesfirico de inositol) de Sigma Aldrich Corporation (PM: 9238). La actividad fitica fue medida en una mezcla de reaccién conteniendo una alicuota de la preparacién euzimitica, 1.6 mM de ftato de sodio, 100 mM de Tris HCI pH 7.5, 1 mM de CaCl: para el caso de las fitasas de Bacillus y para las fitasas de Aspergillus se wiliz6 un busier de 360 mM de acetato de sodio pH 5.5, 1 mM de CaCh € incubando 2 37°C durante 30 min. La reaccién fue detenida con un volumen igual de ‘Acido tricloroacético al 15% y el fosfato inorganico liberado se deteminé midiendo 1a abserbancia a $20 nm de acuerdo a lo repartado por Kim.‘A pesar de los avances logrados con el empleo de fitasa como aditivo alimenticio, ninguna fitasa disponible comescialmente satisface hasta el momento con todos los requerimientos ideales para cada aplicacion especifica. Por un lado, la termoestabilidad limitada de las fitasas ocasiona que estas enzimas se desnaturalicen 45 bajo las condiciones empleadas para a fabricacién de preparaciones alimenticias peletizadas 0 extmiéas. Ademas, una considerable cantidad de fitasa ingerida como aditivo alimenticio se degrada en el estémago y el intestino delgado de los animales, probablemente debido 2 Ia accién proteolitica de pepsina y tripsina endégena, dando 2 ugar a la necesidad del suministro de grandes cantidades de fitasas de alta eficiencia catalitica en las dietas animales. Por tal razén, diversas compatiias y cemtros de investigaci6n enfocan sus esfuerzos al desarrollo de fitasas mejoradas, termoestables, ‘Natuphos fue 1a primera fitasa comercial disponible en el mercado desde 1991. fatricada por Gist Brocades (ahora DSM) y distribuida por BASF, proveniente de una cepa de Aspergillus niger modificada, desde entonces la actividad de fitasa es definida ‘como unidades de fitasa (U 0 FTU), donde uaa FTU es definida por la cantidad de fenzima que libera un jimol de fosforo inorginico por mimito de 0.001Smol/L de fitato de sodio a pH 5.5 y 37 °C (Simons et al, 1990). Esta definicién proporcionada es til para determinar cuantificar Ia actividad de fitasas y representar la mmestra en el mercado, Las investigaciones sobre las fitesas llevan mis de 87 aiios, desde su descubrimiento hasta su comercialzacion en Europa en 1993-1994 por Gist-Brocades. El interés de 1a comercializacién de fa primera fitasa se debi6 a razones ambientales Recientemente, debido al interés econdmico y de proteccién ambiental, se ha incrementado coasiderablemente la produccida de fitasas para su empleo en preparaciones alimenticias para consumo animal en Europa y EU, y su venta se ha introducido con éxito en Latinoamérica, China y otros paises asiaticos. Actuaimente e! volumen del mercado de las fitasas se estima en 150 millones euros (Haefier of al 2005).enzimas proteoliticas del tracto gastrointestinal de estos animales. Sin embargo, las fitasas adecuadas para la alimentacion del camaron deberian tener actividad a valores de pH de 7 a 8 ya un intervalo de temperatura de 26-3°C. condiciones presentes en el a2 aparato digestivo de las especies de camarén y del medio acuoso de los tanques de cultive; ademas se requiere que éstas posean resistencia al atague proteolitico de las enzimas digestivas camarén y establidad a las temperaturas empleadas en el procesado ce los alimentos; por iiltimo una lixiviacién limitada de la fitasa presente en las preparaciones extruidas en e1 medio acuoso de los tanques de incubacién. Por otro lado no se ha observado tn efecto negativo en la sobre-vivencia causado por la suplementacién de fitasa (Robinson ef al, 2002), indicands Ia ausencia de toxicidad de esta enzima, as fitasas incrementan efectivamente la disponibilidad del fosforo proveniente de Jos alimentos a base de harina de soya, pero existe menos informacion sobre la isponibilidad de proteinas y aminoécidos. La supiementacién de fitasa en alimentos para la mutricién de peces y otras especies de interés en la acuacaltura a base de hariaas de origen vegetal es de gran interés para las empresas del ramo de alimentos pecuatios, El fésforo es un antrimento esencial para el crecimiento, el desarrollo esquelético (Asgard & Shearer, 1997) y reproduccion de peces (Hardy & Shearer, 1985). La captacién de fosfato del agua por los peces es minima, siendo la dieta Ia principal fuente 4e fosfatos en la mutricién de peces, para cumplir con los requerimientos nutricionales de esta experie, ms que el fosfato presente en el agua. Por otro lado el fésforo es un contaminante critico del medio ambiente acuitico, concentracién excesiva de fosfatos en 1 agua causa eutroficacion de ries, lagos y otras reservas acusticas (Correll, 1999). Asi que [a inclusién de fitasa en la dieta de peces u otros organismos acuatices cultivables, haa sido sugerida para reducir la expresin de fosfato hacia el agua y disminuis el efecio contaminante,La fitasa es incoporadsa en dletas comerciales para animales como pollos. cerdos Y¥ peces, para mejorar 1a disponibilidad de fOsforo, minerales, aminodcidos y energia Del 60-80% de fésforo en alimento derivado de plantas se encuentra acomplejado en forma de fitato. El ftato y los mutrientes acomplejados a éste 20 pueden ser adsorbidos en al tracto digestivo sin la accion de las fitasas. Generalmente esta actividad puede ccurrir en el tracto digestivo v/o en el alimento antes del consumo (Sebastian et al. 1998). La hubilidad de tas fitasas para hidrolizar el fitato en el tracto digestivo es ‘ceterminada por sus propiedades enzimaticas. Ya que es el estomago el principal sitio onde se requiere la actividad de una fitasa, ésta debe de poseer una buena actividad a PH icidos y deben de ser resistentes ala pepsina El valor de pH en el tracto digestivo de 1a especie animal donde se requiera aplicar una fitasa, detemminard el tipo de fitasa a cemplease dependiente de elintervalo de pH en el cual la fitasa tiene actividad. La fitasa es incomporada en dietas comerciales para animales como pollos. cerdos peces, para mejorar la disponibilidad e fosforo, minerales, aminodcidos y energia, Del 60-80% de fésforo en alimento derivado de plantas se encuentra acomplejado en forma de fitato, Fl fitato y los mutrientes acomplejados 2 éste no pueden ser adsorbidos en el tracto digestivo sin la accién de las fitasas, Generalmente esta actividad puede ‘ocurrir en el tracto digestivo y/o en el alimento antes del consumo (Sebastian et al, 1098), Las fitasas son proteinas que catalizan la hidtélisis de los grupos fosfatos del icido fitico. Las fitasas producidas por el género Bacillus poseen propiedades bioguimicas diferentes a las ftasas fingicas que actualmente se encuentran ea el mercado, lo cual offece 1a oportunidad que éstas sean empleadas en aplicaciones distinas a las actualmente cealizadas. Las fitasas deben cumplir con una serie de criterios para ser usadas como aditivos en alimentos de animales o en procesos de tecnologia de alimentos. Estas deben ser cfectivas en la liberasiéa de fosforo in vitro e in vivo en el tracto digestivo de animales, resists temperaturas altas durante el proceso de peletizado y soportar el ataque protedlitico de las enzimas digestivas, ademis de tolerar Iargos periodos de almacensmiento y transporte 2 temperatura ambiente.En los estudios comparativos, se procuré tener siempre en igualdad el valor de 1a ‘ctividad fitica inictal para cada ensayo realizado con cada una dé las enzimas, ademas s© procuré tener precaucién especial en las concentraciones de calcio presente en cada ensayo y que la determinaciéa de la actividad enzimatica siempre se realizara a una concentratiéa de 1 mM de CaCh, para lo cual 1a concentracién de calcio requerida siempre foe ajustada de forma precisa, ya que la actividad fitica de las fitasas bacterianas es depenciente de la concentracion de este metal. El hecho de que las fitasas bacterianas (PhyC-N. PkyC-R y FTE) seaa attivas a pH de neutro a basicos, las hacen candidatas poteaciales para ser empleadas como aditivo en Ia alimentacién de aquellas especies animales, en las cuales el pH de los tractos digestivos sean de neutros 2 bisicos, o bien en especies agistricas como es el ‘caso de algunos peces y crustaceos como el camarén Blanco del Pacific.