I.

- INTRODUCCIÓN

Las Infecciones del Tracto Urinario constituyen un problema de salud a escala mundial y

representa la más común de las etiologías extraintestinales ocasionadas por Escherichia

coli, que a su vez, es la principal causa de la enfermedad. El proceso de infección tiene

lugar a partir de un prerrequisito esencial que es la adhesión bacteriana a receptores

específicos del uroepitelio; además, estas cepas con el transcurso del tiempo y por abusos

de antibióticos, han presentado resistencia a antimicrobianos, esto, por la diseminación de

los genes de resistencia que es común que se localicen en plásmidos, los cuales tienen la

capacidad de transferirse de una cepa bacteriana a otra mediante el proceso de conjugación,

mecanismo que incluso puede ocurrir entre bacterias de diferentes género. Es conocido que

las enfermedades que disminuyen las defensas del individuo lo predisponen a infecciones

por organismos oportunistas.

El propósito de este proyecto será el estudio y comparación de cepas de E. coli aisladas de

orina de pacientes con VIH, con respecto a pacientes inmunocompetentes. Es interés de

este proyecto conocer si estas dos poblaciones de cepas poseen factores de virulencia

similares, y si el análisis de variabilidad genética permite encontrar polimorfismos

específicos relacionados con su virulencia.

1
II. ANTECEDENTES

2.1 Virus de la Inmunodeficiencia humana (VIH) Taxonomía, historia y epidemiología

El VIH (acrónimo de Virus de Inmunodeficiencia Humana) es el agente infeccioso

determinante del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Según el Comité

Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV) el VIH se incluye en el género Lentivirus,

encuadrado en la subfamilia Orthoretrovirinae de la familia Retroviridae.

Fue descubierto e identificado como el agente de la naciente epidemia de SIDA por el equipo

de Luc Montagnier en Francia en 1983. El virión es esférico, dotado de una envoltura y con

una cápside proteica. Su genoma en una cadena de ARN monocatenario que debe copiarse

provisionalmente a ADN para poder multiplicarse e integrarse en el genoma de la célula que

infecta. Los antígenos proteicos de la envoltura exterior se acoplan de forma específica con

proteínas de la membrana de las células infectables, especialmente de los linfocitos T4.

El proceso de conversión de ARN en ADN es una característica principal de los retrovirus y

se lleva a cabo mediante acciones enzimáticas de transcriptasa inversa. Con la

demostración de la existencia de la transcriptasa inversa, se inició, en la década de 1970 la

búsqueda de los retrovirus humanos, que permitió el aislamiento en 1980 del virus de la

Leucemia de células T del adulto, HTLV-I. (Heeney y cols 2006)

El VIH tiene un diámetro de aproximadamente 100 nanómetros. Su parte exterior es la

"cubierta", una membrana que originalmente pertenecía a la célula de donde el virus

emergió. En la cubierta se encuentra una proteína del virus, la gp41, o "glicoproteína

transmembrana". Conectada a la gp41 está la gp120, la cual puede unirse al receptor CD4
localizado en la superficie de los linfocitos T para penetrar en ellos. El núcleo tiene la

"cápside", compuesta por la proteína p24. En su interior está el ARN, la forma de información

genética del VIH.

En diciembre de 2006, de acuerdo con la Organización Mundial de la Salud, había 39,5

millones de personas con VIH en el mundo, de las cuales 24,7 millones vivian en África

Subsahariana. (Jannsen-Cilag,2008)

2.2 Formas de transmisión del VIH

Hasta el momento, sólo se han demostrado y documentado tres formas de transmisión:

Sexual. (Acto sexual sin protección). El contagio se produce por el contacto de secreciones

infectadas con la mucosa genital, rectal u oral de la otra persona.

Parenteral (por sangre). Es una forma de contagio a través de jeringuillas contaminadas que

se da por la utilización de drogas intravenosas o cuando los servicios sanitarios, como ha

ocurrido a veces en países pobres, no usan las mejores medidas de higiene. También en

personas, como hemofílicos, que han recibido una transfusión de sangre contaminada o

productos contaminados derivados de la sangre; y en menor grado trabajadores de salud

que estén expuestos a la infección en un accidente de trabajo como puede ocurrir si una

herida entra en contacto con sangre contaminada; también durante la realización de

piercings, tatuajes y escarificaciones.

Vertical (de madre a hijo). El contagio puede ocurrir durante las últimas semanas del

embarazo, durante el parto, o al amamantar al bebé. De estas situaciones, el parto es la más

problemática. Se puede tratar a la madre con antivirales en torno al parto para reducir
considerablemente la probabilidad de contagio del bebé (a menos del 1%). (Donegan y cols

1990)

2.3 Mecanismo de infección y replicación del VIH

Las células que el VIH invade son esencialmente los linfocitos T CD4+, pero también en

menor medida los monocitos/macrófagos, las células dendríticas, las células de Langerhans

y las células de microglía del cerebro. La replicación viral por lo tanto tiene lugar en tejidos

diversos (de ganglios linfáticos, intestino, cerebro, timo, etc). Los órganos linfoides, sobre

todo los ganglios linfáticos, constituyen la principal sede de su replicación. El virus está

presente en numerosos líquidos del organismo, en particular la sangre y las secreciones

genitales. (Smith y cols 2005)

La replicación del virus se desarrolla en las siguientes etapas:

La fijación representa la primera etapa en la invasión de una célula. Se basa en el

reconocimiento mutuo y acoplamiento de proteínas de la envoltura del virión, las gp120 y

gp41, y los receptores de la célula blanco, los linfocitos CD4. Este reconocimiento no es

posible sin ayuda de coreceptores propios de las células susceptibles de ser invadidas; en el

caso de los macrófagos son los CCR5 y en el caso de los LT4, los CXCR4, que interactúan

con la proteína superficial. Macrófagos y LT4 tienen en común su principal receptor: el

receptor CD4. Este reconocimiento es condición obligada para que el virus llegue a penetrar

en la célula y continuar con el proceso de infección.

La penetración es el segundo paso: una vez reconocido el virión por los receptores de

superficie, se vacía dentro de la célula fusionándose la envoltura lipídica del virión con la

membrana plasmática de la célula. Protegidos por la cápside y las nucleocápsides, los dos
ARN mensajeros que forman el genoma viral y sus proteínas asociadas se encuentran ahora

en el citoplasma listo para ser procesado. (Medtempus 2007)

La transcripción inversa del ARN vírico para formar ADNc (ADN complementario,

monocatenario) con la misma información. Cada una de las dos moléculas de ARN llega

desde el virión asociada a una molécula de transcriptasa inversa que se ocupa del proceso.

Las dos moléculas de ADNc se asocian para formar una molécula de ADN, que es la forma

química de guardar la información que una célula eucariota es capaz de procesar.

El paso siguiente es la integración del genoma vírico en el genoma de la célula huésped,

para ello penetra en el núcleo y se inserta en el ADN celular con ayuda de una integrasa,

que procede del virión infectante. La transcripción del ADN vírico se realiza por los

mecanismos normales de la célula. El resultado de la transcripción es un ARNm (ARN

mensajero).

El ARNm obtenido es complejo, constituido por una sucesión de intrones (partes no

informativas) y exones (partes informativas). Debe ser procesado por cortes y reempalmes

antes de que la información que contiene pueda servir para fabricar las proteínas

correspondientes. Una vez procesado, el ARNm puede salir del núcleo a través de los poros

nucleares. (The body 2004)

Una vez en el citoplasma, el ARNm proporciona la información para la traducción, es decir, la

síntesis de proteínas, que es realizada a través del aparato molecular correspondiente, del

que forman la parte fundamental los ribosomas. El resultado de la traducción no consiste

inmediatamente en proteínas funcionales, sino en poliproteínas que aún deben ser cortadas
en fragmentos. Por acción de proteasas específicas del VIH, las poliproteínas producto de la

traducción son procesadas, cortándolas, para formar las proteínas constitutivas del virus.

Las proteínas víricas fabricadas se ensamblan, junto con ARN provirales, para formar los

componentes internos de la estructura del virión, los que constituyen la cápside y su

contenido.

El último paso es la gemación, cuando los nucleoides víricos se aproximan a la membrana

plasmática y se hacen envolver en una vesicula que termina por desprenderse, formando un

nuevo virión o partícula infectante. En cada célula infectada, se ensamblan varios miles de

nuevos viriones, aunque muchos son incompletos y no pueden infectar. (Atman 2000)

2.4. Infecciones oportunistas en pacientes con VIH

Las infecciones bacterianas son reconocidas como una causa importante de morbilidad y

mortalidad en los pacientes infectados con el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH),

aunque la verdadera incidencia es difícil de discernir y muy variada en comparación con la

población no inmunosuprimida. La incidencia es muy alta en pacientes con conteo de

linfocitos CD4 por debajo de 200 células/mm3, y con neutropenia grave menor que 500

neutrófilos µ/l (Currier y cols 2001).

El daño del sistema inmunitario derivado del VIH puede dar lugar al desarrollo de infecciones

oportunistas (Norgren y cols 1987). Se trata de infecciones comunes en casos de VIH/SIDA

que se producen cuando el sistema inmunitario del cuerpo está debilitado.

Los recuentos de células CD4 pueden jugar un importante papel a la hora de determinar el

riesgo de contraer una infección. Algunos factores, como la raza o el compartir agujas para el
consumo de drogas, también plantean un riesgo mayor de contraer diferentes enfermedades.

La buena noticia es que los medicamentos para el VIH utilizados en un régimen TARGA

(terapia antirretroviral de gran actividad) pueden ayudar a reducir el riesgo de infección.

(Jannser-Cilag 2008)

Los pacientes inmunosuprimidos tienen una gran susceptibilidad a sufrir de infecciones

oportunistas, la más frecuente es la Infección del Tracto Urinario (ITU) en la cual E. coli es el

patógeno oportunista aislado con más frecuencia. Las ITU son generalmente infecciones

ascendentes causadas por cepas presentes en la microbiota normal intestinal que presentan

factores de virulencia que les permiten invadir, colonizar y dañar el tracto urinario

provocando bacteriuria asintomática, cistitis o pielonefritis.

Las mujeres sufren más de este tipo de infecciones que los hombres, debido a la localización

tan estrechamente cercana entre el ano y el aparato genital, haciendo asi que una

autoinfección sea muy común. (Blanco y cols 1991)

Las infecciones del aparato genitourinario reciben diferente nombre según el órgano que sea

afectado:

Se define Bacteriuria Asintomática (BA) cuando se presentan dos exámenes de urocultivo

positivos consecutivos, con el mismo germen, con recuento de colonias >100 000/mL, en

ausencia de sintomatología. Su incidencia es del 3 al 10%, dependiendo del nivel

socioeconómico de las pacientes. Se piensa que el origen de las bacterias sería el riñón, ya

que 25-50% de estos casos tienen antígeno O de la bacteria presente, prueba de

fluorescencia positiva para anticuerpos de la pared bacteriana y enzima B glucoronidasa en

concentraciones variables. Alrededor del 40% de las pacientes con BA no tratada desarrollan

pielonefritis aguda.
Por otro lado, la cistitis Aguda (CA): o también llamada infección urinaria baja, se caracteriza

por sintomatología de poliquiuria, disuria y disconfort pélvico de grado variable, en ausencia

de fiebre y/o dolor costolumbar. El cultivo de orina es el examen que certifica esta infección,

aunque hay controversia con respecto al número de colonias. Muchos piensan que,

independientemente del número, habiendo sintomatología, la infección debe calificarse como

cistitis y, por lo tanto, tratarse como tal. Cuando existe sintomatología y se encuentra

sedimento urinario compatible con infección y urocultivo positivo, independiente del número

de colonias, se inicia tratamiento. A diferencia de bacteriuria asintomática, el 94% de estas

pacientes presenta prueba de fluorescencia negativa para anticuerpos bacterianos,

indicando que la vejiga es el sitio de infección. (Medline 2008)

Se define a la Pielonefritis Aguda (PA): o infección urinaria alta, como la forma más grave de

presentación de la infección del tracto urinario. El cuadro clínico se caracteriza por fiebre,

que puede llegar a ser muy elevada (arriba de 39 °C), escalofríos intensos, y, en 85% de los

casos, dolor en región costolumbar.

La bacteriuria es siempre significativa, y en el 7-10% de las pacientes se produce

bacteremia. El hecho más significativo es que 2-3% de ellas desarrollará shock séptico, con

la consiguiente gravedad para madre y feto. Menos frecuentemente, la PA se ha asociado a

síndrome de dificultad respiratoria del adulto, complicación muchas veces mortal.

La mayoría de las infecciones urinarias altas se producen en los dos últimos trimestres de la

gestación (67%) y 20% ocurren en el puerperio. Muchas pacientes con esta infección

experimentan contracciones uterinas frecuentes e intensas, debido a que la mayoría de los

gérmenes involucrados contienen fosfolipasa A2, enzima fundamental para la síntesis de

prostaglandinas, sustancias involucradas en el inicio del trabajo de parto.

La BA no tratada evoluciona a PA en el 13,5 al 65% de los casos. Con tratamiento, en

cambio, esos porcentajes disminuyen del 0-5,3%. De las pacientes con PA, 28% desarrolla

bacteriuria recurrente y 10% presenta nuevamente PA durante el mismo embarazo. (Romero

y cols 1989)

2.5 Escherichia coli como agente oportunista

Para que la bacteria E. coli pueda invadir, colonizar y dañar el tracto urinario debe de tener

diversos factores de patogenicidad que le permitan hacer daño al tracto uroepitelial, entre los

factores de patogenicidad más importantes se incluyen sideróforos (aerobactina), la

presencia de adhesinas que permiten su adhesión al uroepitelio, la capacidad de

estructurarse en biopelículas, la liberación de toxinas (hemolisinas, factor citotóxico

necrotizante), las invasinas u otros como las islas de patogenicidad (genes responsables de

los factores de virulencia que se encuentran agrupados en fragmentos de DNA muy

particulares llamados también PAI [Pathogenicity Islands]). Una cepa de E.coli es tanto más

virulenta cuantos más factores de virulencia concurren en ella. (Jonson, 1991).

El principal factor de virulencia de las cepas uropatogénicas de E. coli que causan ITU en

seres humanos es la fimbria P (ó fimbria Pap de Pyelonephritis Associated Pili) que está

presente en la mayor parte de las cepas aisladas de pacientes con pielonefritis y urosepsis

(septicemias de origen urinario). La fimbria P le permite a la bacteria fijarse a los receptores

celulares y colonizar el epitelio urinario sin ser arrastrada por la orina. Dicha fimbria está

codificada en los operones cromosómicos pap y sfa respectivamente. Un tercer operon (afa)

codifica para una adhesina afimbrial (Afa) que se encuentra en muy pocas cepas. En las

infecciones extraintestinales, el hierro se convierte en uno de los principales factores que

limitan el crecimiento bacteriano. Esta limitación se debe, en gran parte, al hecho de que casi

todo el hierro está secuestrado en hemoproteínas, como la hemoglobina y la mi oglobina, o

en proteínas quelantes de hierro involucradas en su transporte, como la transferrina o la

lactoferrina. Para poder incorporar el hierro, la mayoría de las cepas de E. coli causantes de

infecciones extraintestinales poseen el sideróforo aerobactina, formado por un compuesto

quelante de hierro que la bacteria excreta y puede volver a captar. La bacteria secreta el

sideróforo cuando hay poco hierro disponible, y cuando el complejo hierro-sideróforo alcanza

la superficie celular, se une a una proteína receptora del sideróforo que se encuentra en la

membrana externa de la pared celular. Una vía alternativa para que la bacteria adquiera

hierro es la hemólisis provocada por la α -hemolisina (Hly). Muchas cepas uropatogénicas y

septicémicas humanas producen α -hemolisina y el factor de necrosis celular cnf-1. Se han

caracterizado varias islas de patogenicidad cromosómicas que contienen los genes que

codifican para la fimbria P (Pap), fimbrias P-like (Prs, P-related sequence), cnf-1 y/ó Hly.

Además, los genes para Hly pueden ser plásmidicos. (Márquez 2007)

En estudios experimentales se ha observado que las bacterias uropatógenas invaden las

células superficiales de la vejiga y que en el interior de éstas células crean biopeliculas.

Estas estructuras, contendrían bacterias bañadas en una matriz rica en polisacáridos

rodeadas por una envoltura de uroplactina las cuales podrían constituir un nuevo reservorio

para los microorganismos productores de las ITU recurrentes. (Lindsay y cols 2003)
2.6 Infecciones del tracto urinario (ITU)

El tracto genitourinario normal es estéril hasta la parte distal de la uretra. La bacteriuria

asintomática generalmente ocurre por ascenso de las bacterias de la uretra a la vejiga y que

en ocasiones llegan a ascender hasta el riñón. Las bacterias aisladas de pacientes con

bacteriuria asintomática generalmente se originan de microbiota que se encuentra en

intestino, vagina o área periuretral. Para pacientes expuestos a instrumentación del tracto

urinario, las bacterias se introducen a través de instrumentos urológicos contaminados o

fluidos que son llevados al tracto urinario del paciente sin éste estar colonizado

anteriormente. Estos organismos permanecen en el tracto urinario sin ser eliminados por el

hospedero y sin una respuesta suficiente para producir síntomas o causar erradicación.

Existen factores tales como predisposición genética, vaciamiento incompleto de la vejiga o

presencia de un cuerpo extraño provocando la persistencia de los organismos. (Medline

2008)

E. coli es el organismo que con más frecuencia se aísla de sujetos con bacteriuria

asintomática. Sin embargo existe un rango amplio de otras bacterias aisladas. En adultos

mayores y pacientes manejados con cateterización intermitente, E. coli es el agente aislado

con menor frecuencia en hombres que en mujeres. En personas con anormalidades

estructurales o funcionales del tracto urinario, a menudo con cuerpos extraños o con manejo

antimicrobiano repetitivo, frecuentemente se aíslan otras enterobacterias y microorganismos

gram-negativos tales como Pseudomona aeruginosa, organismos gram-positivos incluyendo

Enterococcus spp y Staphylococcus coagulasa negativo y otros como Staphylococcus

saprophyticus podrían ser aislados mas frecuentemente en pacientes con bacteriuria

asintomática que con los que muestran signos de infección. A menudo, el huésped presenta

una respuesta local urinaria aún en ausencia de síntomas. La piuria se reporta en bacteriuria
asintomática en 43% de las niñas en edad escolar, 32% en mujeres jóvenes sanas, 78% en

mujeres diabéticas, 25% a 80% en mujeres embarazadas y 90% en hombres y mujeres

ancianos. Los niveles totales de leucocitos en orina son variables, pero los pacientes

podrían tener altos niveles de leucocitos en orina (piuria) acompañando constantemente a la

bacteriuria asintomática por años. La bacteriuria debida a gram-positivos esta asociada con

bajos niveles de piuria. Otros marcadores inmunológicos o inflamatorios tales como las

citocinas e inmunoglobulinas urinarias podrían estar presentes. Los resultados y significado

clínico de esta respuesta local aun no esta bien comprendida. (Bryan y Reynold 1984)

2.7 Antibioticos

El tratamiento antibiótico adecuado y oportuno de las ITU soluciona el problema en forma

eficiente en la gran mayoría de los casos y evita la aparición de complicaciones como

infecciones recurrentes, infecciones del parénquima renal e infecciones sistémicas. (Johnson

y cols 2005).

El tratamiento antibiótico se inicia inmediatamente después de la toma de muestra de orina,

de forma empírica según consideraciones epidemiológicas, debiendo escogerse un

antimicrobiano efectivo contra el microorganismo más probablemente involucrado, tomando

en cuenta los antecedentes del paciente. Esto implica que es necesario conocer la

susceptibilidad in vitro de los agentes etiológicos de ITU, frente a los antimicrobianos de uso

habitual, debido al fenómeno dinámico y en constante aumento de la resistencia bacteriana.

(Madigan y cols 2000)

III.- OBJETIVOS

3.1. Objetivo general

Comparar los factores de virulencia y moleculares de cepas de Escherichia coli aisladas a

partir de orina de pacientes con VIH y personas inmunocompetentes.

3.2. Objetivos particulares

1. Aislar e identificar cepas de E. coli a partir de muestras de orina obtenidas de

pacientes con y sin VIH.

2. Caracterizar las cepas de acuerdo a sus patrones de susceptibilidad a drogas

3. Caracterizar las cepas de E. coli por factores de virulencia

4. Determinar la capacidad de adherencia y de defensa que tiene la E. coli mediante la

determinación de formación de biopelículas.

5. Tipificar genéticamente las cepas de E. coli mediante RAPD´s

IV. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1.Muestras

Se tomaron muestras de orina de pacientes inmunocompetentes y de seropositivos para VIH

(los cuales contaron con el estudio de carga viral y de conteo de linfocitos), atendidos en las

siguientes instituciones de salud: Instituto Mexicano del Seguro Social, Hospital General “Dr.

Zubirán”, Hospital Clinica del Centro y Hospital Christus Muguerza del Parque de la ciudad

de Chihuahua Chihuahua.

4.2 Cepas

Se aisló una cepa de Escherichia coli de un pacientes seropositivo con ITU, la cual se

etiquetó como 1VIH. Se agregaron al estudio 9 cepas de Escherichia coli anteriormente

incluidas en otros estudios etiquetadas como: 2VIH, 3VIH, 4VIH, 5VIH, 6VIH, 7VIH, 8VIH,

9VIH y 10VIH.

El Instituto Mexicano del Seguro Social, proporcionó las muestras de orina a partir de las

cuales se aislaron 9 cepas de Escherichia coli de pacientes sin inmunosupresión, que se

etiquetaron como 2C, 4C, 5C, 6C, 7C, 8C, 9C, 11C y 12C.

Los siguientes Hospitales donaron muestras de orina de pacientes sin VIH, a partir de las

cuales se aislaron cepas de Escherichia coli: Hospital del Centro (14 cepas), Hospital

General “Dr. Zubirán” (5 cepas) y Hospital Christus Muguerza del Parque (6 cepas); las

cuales fueron etiquetadas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,

21, 22, 23, 24 y 25.

Como referencia se usó la cepa de Escherichia coli ATCC 25922

4.3 Recolección de datos del expediente de los pacientes con VIH

Se recolectaron los valores de carga viral, analizados mediante la técnica RT-PCR y los

valores de linfocitos CD4 analizados por citometría de flujo.

4.4 Toma, manejo y transporte de la muestra

Se tomaron 3 muestras de 30 mL de orina obtenidas durante la primera micción de la

mañana y recolectadas a la mitad del chorro. Las muestras proporcionadas en el hospital se

transportaron a temperatura ambiente al laboratorio de Biotecnología de la Facultad de

Ciencias Químicas donde se les realizó el estudio, mediante análisis microbiológico y

molecular.

4.5 Materiales y equipo

4.5.1 Materiales

Bata de laboratorio de manga larga, guantes de polietileno chicos AMBIDERM, asas de

nicromio circular y estéril, espátula, tubos de ensaye 13*100, gradilla para tubos 13*100,

tapas de rosca, tubos de ensaye de fondo plano, cajas petri de plastico estériles desechables

100*15 mm, mechero, matraces Erlen Meyer (250 mL y 500 mL), papel aluminio, papel

estraza, micropipetas de 0.5-10 μL, 10-100 μL y 100-1000 μL, puntas para micropipeta de

10, 100 y 1000 μL, pipetas serologicas de 2 mL- 5 mL -10 mL, tubos eppendorf 1.5 μL,

gradilla para tubos eppendorf, tripie, tela de asbesto, papel filtro WHATMAN, embudo,

probetas 50 mL, 100 mL y 250 mL, vaso de precipitado 100 mL y 250 mL, frascos de vidrio

ambar y transparentes, cinta scotch, adhesiva y testigo, parafilm, propipetero, frascos con

gotero, algodón, marcador permanente sharpie , matraz aforado de 100 mL.

4.5.2 Equipo

Microscópio óptico de campo claro (Olympus CX31), autoclave (Barnstead Internacional),

balanza analítica (Explorer Ohaus, AE ADAM®), cámara de electroforesis (Owl Separation

Systema ,Inc), campana de extracción (Labconco), congelador (Fischer Scientific),

refrigerador ((VWR Scientific), horno de microondas (Mabe), incubadora (fischer scientific),

microcentrífuga (Eppendorf 5804 R), termociclador (Perkin Elmer/ Gene Amp PCR System

2400), transiluminador UV (Epi Chemi II Darkroon-UVP Laboratory Products), vortex

(Thermolyne), equipo de fotografía (Kodak), baño maría (Labnet), microcentrífuga

(microcentrifuge CE).

4.5.3 Reactivos

Agarosa (Sigma), agua destilada, agua inyectable, bromuro de etidio (Sigma), cajas de agar

sangre preparado (BD BBL), agar Mac Conkey (Bioxon), agar Mueller Hilton (Bioxón), caldo

de soya tripticaseína (Becton Dickinson de México S.A. de C.V.), cloroformo (Baker

Analyzer), dNTP’s (Gibco BRL), EDTA (Gibco BRL), etanol absoluto anhidro (Sigma), fenol,

hielo, isopropanol (Sigma), marcadores de peso molecular 100 pb ladder, proteínasa K

(invitrogen), lisozima (10 mg/mL), CTAB (sigma), SDS (Sigma), Taq ADN polimerasa

recombinante (Invitrogen), dNTP’s (Invitrogen), trizma base (Sigma), buffer (Invitrogen),

cloruro de magnesio (Invitrogen), antibiòticos (Gentamicina, Nitrofurantoina, Ceftriaxona,

Trimetropima con sulfametoxasol, Amikacina, Cefuroxima, Ampicilina), metanol 99%, cristal

violeta1%, acido acético glacial 33%, safranina, TAE 1X, buffer de carga, fenol cloroformo

isoamílico 25:24:1, iniciadores ( CNF-s, CNF-as, afa-1, afa-2, sfa-1, sfa-2, pap-1, pap-2,

OPL-04, OPA-07, P-05).

4.6. Métodos

4.6.1 Análisis microscópico

A las muestras de orina se les realizó análisis microscópico por medio de la tinción de Gram.

Se tomó 1 mL de orina, se centrifugó a 5000 rpm por 20 min y el sobrenadante se descartó.

El precipitado, se extendió en un portaobjetos, la muestra se dejó secar al aire, y se pasó a

través de la flama, para fijarla, después se procedió a su tinción.

Las bacterias crecidas en agar Mac Conkey se analizaron en microscopio también mediante

la tinción de Gram, colocando una gota de solución salina en un portaobjetos suspendiendo

las bacterias de una colonia, se dejó secar y se fijó a la flama del mechero (pasando tres

veces el portaobjetos de la punta hacia la base). Para la tinción al portaobjetos se le añadió

cristal violeta dejando actuar por 1 minuto, se enjuagó con agua y se le adicionó yodo lugol

(1 minuto), se enjuagó y se decoloró con alcohol acetona, por último se le agregó safranina

(1 minuto), se enjuagó y se observó en el microscopio. Las bacterias gram positivas se

observan de color morado y las gram negativas de color rosa.

4.6.2 Cultivo y Pruebas bioquímicas

Urocultivo

Del sedimento de la orina se inoculó en condiciones estériles en agar sangre, Mac Conkey y

EMB, se incubó a 37ºC por 24 horas para su cultivo.

Pruebas bioquímicas

Las colonias del agar Mac Conkey se analizaron bioquímicamente con el BBL CRYSTAL y el

combo urine de MICRO SCAN para identificar a los microorganismos presentes. Para

utilizar este sistema se debe identificar si la bacteria es Gram negativo o positivo para
escoger de acuerdo a esto el juego de bioquímicas que se utilizaría. En el caso de el juego

para Gram negativas se realiza catalasa, OF, fermentación de glucosa, indol, fenilalanina

desaminasa, producción de H2S, descarboxilación de lisina, descarboxilación de ornitina,

citrato, arabinosa, sorbitol, rojo de metilo y Vogues Proskauer.

4.6.3 Suceptibilidad a drogas (Madigan y cols 2000)

Se empleó el método de Kirby-Bauer; en los microorganimos identificados, se tomaron

colonias y se suspendieron en solución salina disolviéndolas lentamente (para no formar

grumos), hasta que se visualizara la misma turbidez del tubo 0.5 del Nefelómetro de Mac

Farland (se compara la turbidez con el apoyo de un fondo blanco – negro). Con un hisopo

estéril se tomó una muestra de la suspensión bacteriana y se realizó la descarga en uno de

los cuadrantes del agar Mueller Hinton con la finalidad de estriar de forma cerrada para que

el agar se impregne total de la suspensión. Se colocaron los sensidiscos con el dispensor de

antimicrobianos. Se incubó a 37°C por 24 horas en condiciones de aerobiosis y se midió el

halo de inhibición, posteriormente se determinó la susceptiblidad y la resistencia a los

antimicrobianos.

4.6.4 Extracción de ADN (Honore- Bouakline y cols 2003)

Se agregaron colonias de Escherichia coli en 3 mL de caldo enriquecido Tripticasa soya por

24 horas a 37º C. Se tomó un mililitro de caldo con crecimiento y se colocó en un tubo

eppendorf (1.5 μL), se centrifugó por 3 minutos y se descartó el sobrenadante, se agregó el

siguiente mililitro de caldo con crecimiento y se centrifugó nuevamente, esto se repitió hasta

que se logró compactar en una pastilla todo el caldo con crecimiento. La pastilla se mezcló

con 200 μL de agua estéril y se calentó a 100º C por 10 min para inactivar las cepas.

Finalizado este tiempo, se centrifugó nuevamente a 5000 rpm por 3 min, para lisar a las

bacterias. 100 μL se traspasaron a un tubo nuevo eppendorf para utilizarse como DNA stock.
4.6.5 Detección del cnf-1 (Van Bost y cols 2003)

En la tabla 1, se muestran las condiciones para la reacción de PCR usadas para la detección

del cnf-1.

Tabla 1. Condiciones de la reacción de PCR para la detección del gen cnf-1

Stock [final] Vol (μL)

Buffer 10 X 1X 2.5
MgCl2 30mM 2.0mM 1.0
DNTPs 2.5mM 0.05 mM 0.5
Cnf-s 200 pmol 8 pmol 1.0
Cnf-as 200 pmol 8 pmol 1.0
Agua 3.0
DNA 15.0
Taq polimerasa 500 U 2.5 U/μL 1.0

El programa de amplificación que se aplicó: 3 min. de desnaturalización inicial a 94 ºC,

seguido de 30 ciclos de 1 min a 94 ºC, 1 min a 60 ºC, 1 min a 72 ºC y un tiempo de extensión

final de 7 min a 72 ºC, la conservación de la muestra se llevó a 4ºC. En la figura 1 se

muestra el diagrama del las condiciones del termociclador.

94ºC 94ºC
72ºC72ºC
60ºC
3’ 1’ 1’ 7’
1’

30 ciclos

Figura 1. Diagrama de amplificación del gen cnf-1

4.6.6 Detección de la producción de Alfa Hemolisina (Beutin y cols 1989)

Las cepas aisladas e identificadas, se sembraron en el medio agar sangre y se incubaron por

18 horas a 37ºC, después se les analizó la producción de alfa hemolisina, por medio de la

presencia de un halo hemolítico alrededor de la colonia.

4.6.7 Capacidad de adherencia (Stepanovic y cols 2000)

Para medir la capacidad de adherencia de las cepas de E. coli, se realizó el ensayo de

microtitulación en placa, utilizando placas de ELISA. Se resuspendió una colonia bacteriana

en 1 mL caldo tripticasa soya, se tomaron 200 µ l y se colocaron por triplicado en los pozos

de la placa, posteriormente se cubrieron e incubaron en condiciones aerobias a 37ºC por 24

horas. Después el contenido de cada pozo se aspiró y se lavó 3 veces con 250 µ l de

solución fisiológica, las placas se agitaron vigorosamente para quitar las bacterias que no se

adhirieron a la placa. Posteriormente se añadieron 200 µ l de metanol al 99% y se dejó 15

min para fijar las bacterias, luego se dejó secar para ser teñida con 0.2 ml cristal violeta al

2% por 5 min, después se enjuagó al chorro de agua para quitar el exceso de colorante. Se

dejó secar y se adicionaron 160 µ l de ácido acético glacial al 33% (v/v). Por último se leyó la

Densidad Óptica (OD) a 570 nm.

En base a esto se clasificaron a las bacterias en cuatro categorías:

* No adheribles OD ODc (0),

* Débil mente adheribles ODc < OD 2 X ODc (+)

* Moderadamente adheribles 2 X ODc < OD 4 X ODc (++)

* Fuertemente adheribles 4 X ODc < OD (+++).

4.6.8 Detección de gen pap, afa y sfa (Le Bouguenec y cols 1992)

Para la amplificación se utilizaron las siguientes condiciones:

Stock [final] Vol (μL)

Tris HCl 100 mM Tris HCl 10 mM

Buffer 1.25
KCl 500 mM KCl 50 mM

MgCl2 30 mM 1.5 mM 1.25

pap 1 10 mg/mL 0.45 μM 2.25

pap 2 10 mg/mL 0.45 μM 2.25

sfa 1 10 mg/mL 0.45 μM 2.25

sfa 2 10 mg/mL 0.45 μM 2.25

afa 1 10 mg/mL 0.45 μM 2.25

afa 2 10 mg/mL 0.45 μM 2.25

dNTPs 2.5 mM 0.2mM 2.0

Agua 7.75

DNA 5

Taq 500 u 1.2 u 1.0

*Las secuencias de los iniciadores utilizados fueron los siguientes: pap 1 (5’ –
GACGGCTGTACTGCAGGGTGTGGCG-3’),pap 2 (5’-ATATCCTTTCTGCAGGGATGCAATA-3’ ), con un peso de
328 pb; sfa1 (5’-CTCCGGAGAACTGGGTGCATCTTAC-3’), sfa2 (5’-CGGAGGAGTAATTACAAACCTGGCA-3’)
con un peso de 410 pb; afa 1 (5’-GCTGGGCAGCAAACTGATAACTCTC-3’ ), afa 2 (5’-
CATCAAGCTGTTTGTTCGTCCGCCG-3’), con un peso de 750 pb.

Los ciclos de la amplificación comprendieron: 3 min de desnaturalización inicial a 94 ºC,

seguido de 25 ciclos de 2 min a 94 ºC, 1 min a 65 ºC, 2 min a 72 ºC y un tiempo de extensión

final de 7 min a 72 ºC, en la figura 2 se muestra el diagrama del las condiciones del

termociclador.
 94ºC 94ºC
72ºC 72ºC
65ºC
3’ 2’ 2’ 7’
1’

25 ciclos

Figura 2. Diagrama de las condiciones del termociclador para la amplificación de los genes
de adherencia pap, afa y sfa.

4.6.9 Formación de biopelículas (Rivera y Mendez 2005)

Se agregó a un tubo con 2 mL de caldo tripticasa soya estéril una colonia de E. coli,

incubándose 24 horas a 37ºC. Se aspiró el contenido con una pipeta sin tocar las paredes

del tubo. Se tiñó con colorante de safranina para observar la formación de un halo rosa en

las paredes del tubo.

4.6.10 Polimorfismos de Fragmentos Amplificados al Azar (RAPD) (Bernal y cols 2004)

Para los RAPDs se utilizaron los siguientes iniciadores: OPL4 5´- GACTGCACAC-3, P5 5´-

CGGCCCCGGT-3, OPA 07 5´-GAAACGGGTG-3´. En las tablas 2, 3 y 4, se muestran las

condiciones de los RAPDs para cada iniciador.

 Tabla 2. Condiciones para RADP con el iniciador OPL4

Stock [final] Vol(µ l)

Agua 14.0

OPL4 5µ M 0.5 µ M 2.5

DNTPs 2.5 mM 0.05 mM 0.5

MgCl2 30 mM 2.4 mM 2.0

Buffer Tris-HCl: 100 mM Tris-HCl: 10 mM 2.5

KCl: 500 mM KCl: 50 mM

Taq polimerasa 500 U 5U/µ l 1.5

DNA 300 ng/µ l 24 ng/µ l 2.0

Tabla 3. Condiciones para RADP con el iniciador P5

Stock [final] Vol(µ l)

Agua 14.0

P5 5µ M 0.5 µ M 2.5

dNTPs 2.5 mM 0.05 mM 0.5

MgCl2 30 mM 2.4 mM 2.0

 Buffer Tris-HCl: 100 mM Tris-HCl: 10 mM 2.5

KCl: 500 mM KCl: 50 mM

Taq polimerasa 500 U 5U/µ l 1.5

DNA 300 ng/µ l 24 ng/µ l 2.0

 Tabla 4. Condiciones para RADP con el iniciador OPA07

Stock [final] Vol(µ l)

Agua 12.5

OPA 07 3µ M 0.6 µ M 5.0

dNTPs 2.5 mM 0.05 mM 0.5

MgCl2 50 mM 2.0 mM 1.0

Buffer 10 X 1X 2.5

Taq polimerasa 500 U 5U/µ l 1.5

DNA 300 ng/µ l 24 ng/µ l 2.0

La mezcla de reacción se realizó en un tubo para PCR estéril de 0.5 mL. El programa de

amplificación usado para RAPD`s comprendió: 5 min. de desnaturalización inicial a 94ºC,

seguido de 30 ciclos de 30 seg a 94 ºC, 30 seg a 36 º y 30 seg a 72 ºC, y un tiempo de

extensión final de 4 min a 72 ºC, la conservación de la muestra se llevó a 4ºC. En la figura 3

se muestra el diagrama de amplificación. Los productos de amplificación se visualizaron

mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%.

94ºC 94ºC 72ºC 72ºC

 36ºC
5’ 30s 30s 4’
30s
30 ciclos

Figura 3. Diagrama de amplificación para RAPD

4.6.11 Análisis de datos.

Los patrones de bandeo generados por PCR-RAPD fueron analizados con un QuantityOne

de Biorad para obtener el dendograma.

V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En el presente estudio se analizaron muestras de orina de pacientes con y sin VIH que

presentaban infección del tracto urinario, las cuales fueron cultivadas en agares selectivos y

enriquecidos. Se realizó la tinción de Gram en búsqueda de bacilos Gram negativos, luego

las colonias se analizaron bioquímicamente en microplacas de los sistemas BBL CRYSTAL y

el combo Micro Scan para identificar a la bacteria Escherichia coli.

Se obtuvieron un total de 28 cepas de pacientes inmunocompetentes y 1 cepa de pacientes

inmunosuprimidos. Al estudio se añadieron 18 cepas de E. coli uropatógena (9 de población

inmunosuprimida y 9 de población inmunocompetente) que ya habían sido aisladas e

identificadas en otro proyecto. De esta manera se contó con 47 cepas de E. coli

uropatógena, 37 de pacientes sin VIH y 10 cepas de pacientes inmunosuprimidos.

Con el fin de comparar su patogenicidad se sometieron a diferentes pruebas, para conocer

cuál grupo poseía más factores de virulencia y propiedades que conferían a la bacteria el

poder de invadir y permanecer en el tracto urinario.

5.1 Susceptibilidad a drogas

Se realizó una investigación previa para determinar los antimicrobianos que más se recetan

en las ITU, esto con el fin de seleccionar y evaluar la susceptilibidad que tienen las cepas de

Escherichia coli de pacientes con y sin VIH a estas drogas. Para determinar si las cepas

eran resistentes, intermedias o sensibles a la acción del antibiótico, se utilizaron las medidas

establecidas en la tabla descrita por BD BBL SENSI DISC (Tabla 5).

Tabla 5. Valores de la concentración mínima inhibitoria para la interpretación de la

sensibilidad.
* BD BBL TM SENSI-DISC TM ANTIMICROBIAL SUCEPTIBILITY TEST DISCS

Antibiótico Resistente (cm) Intermedio (cm) Susceptible (cm)

Amikacina ≤ 1.4 1.5-1.6 ≥ 1.7

Ampicilina ≤ 1.3 1.4-1.6 ≥ 1.7

Ceftriaxona ≤ 1.3 1.4-2.0 ≥ 2.1

Cefuroxima ≤ 1.4 1.5-1.7 ≥1.8

Gentamicina ≤ 1.2 1.3-1.4 ≥ 1.5

Nitrofurantoína ≤ 1.4 1.5-1.6 ≥ 1.7

Trimetroprim sulfametoxazol ≤ 1.0 1.1-1.5 ≥ 1.6

 En la tabla 6 se muestran los resultados obtenidos al analizarse la lectura de los halos de

inhibición al desarrollar el método de Kirby- Bauer.

Tabla 6. Lectura de halos de inhibición de las cepas de E.coli de pacientes con y sin VIH

Cepas control aisladas de pacientes sin Cepas aisladas de pacientes con VIH

VIH n=37 n=10

Resistencia Resistencia
Drogas Resistentes Sensibles Resistentes Sensibles
intermedia intermedia

Amikacina 3/37 (8.1%) 1/37 (2.7 %) 33/37 (89.1%) 9/10(90%) ********** 1/10 (10%)

Ampicilina 33/37 (89.1%) ********** 4/37 (10.8%) 10/10(100%) ********** **********

Ceftriaxona 7/37 (18.9 %) 2/37 (5.4 %) 28/37 (75.7%) 9/10 (90%) ********** 1/10 (10%)

Cefuroxima 9/37 (24.32 %) 1/37 (2.7 %) 27/37 (72.9%) 9/10 (90%) 1/10 (10%) **********

Gentamicina 11/37 (29.7 %) ********** 26/37 (70.2%) 10/10(100%) ********** **********

Nitrofurantoina 6/37 (16.2 %) 4/37 (10.8%) 27/37 (72.9%) 10/10 (100%) ********** **********

Trimetroprim
28/37 (75.7%) ********** 9/37 (24.32 %) 10/10 (100%) ********** **********
Sulfametoxazol
Los resultados se dividieron en dos secciones: la susceptiblidad de las cepas provenientes

de pacientes sin inmunosupresión y la susceptibilidad de las cepas de pacientes con

inmunosupresión.

Al analizar los resultados de los pacientes sin VIH, se puede observar que existe una gran

resistencia a la ampicilina (89.1%) que es un derivado de la penicilina y a trimetroprim

sulfametoxazol (75.7%) incluido en el grupo de las sulfonamidas; ambos son medicamentos

que se otorgan de primera elección, es decir, que cuando se detecta una ITU, ambas drogas

se dan sin un estudio previo. Esto explica la alta drogorresistencia de la bacteria, además,

ambas drogas son de amplio espectro, es decir, se dan para diversas infecciones, por lo que

al estar la bacteria en constante contacto con los antibióticos, adquiere resistencia contra los

mismos.

En el caso de los pacientes con VIH los resultados son aún mas alarmates, ya que se

encontró una resistencia total a 4 de las 7 drogas utilizadas y las 3 restantes presentaron un

90% de ineficacia; concordando con lo expuesto en el estudio realizado por la organización

de CONASIDA, ya que éste tipo de pacientes son constantemente blanco de infecciones, por

lo que frecuentemente se encuentran en tratamiento con antibióticos, esto puede explicar la

resistencia que existe actualmente a las drogas. (Jannsen-Cilag 2008)

En el caso de los estudios sobre patrones de susceptibilidad se encuentra el de Gordon y

colaboradores (2003) en el que evaluaron la resistencia a antibióticos de las bacterias más

comunes que causan ITU. En el estudio encontraron que el principal patógeno fue E.coli

(47%) y que mostró una alta resistencia a la ampicilina (55%) y a la trimetroprim

sulfametoxazol (23%); los resultados del presente mostraron más resistencias a éstas

drogas.
Sin embargo, en estudios como el de Jonson y colaboradores (2005), la ampicilina y el

trimetroprim sulfametoxazol fueron de alta sensibilidad ante las bacterias. Lo que permite

observar la gran patogenicidad que las cepas de este estudio tienen, ya que esos dos

antibióticos fueron a los que mas resistencia mostraron las bacterias del presente estudio. La

gran dificultad que representa su erradicación y la peligrosidad en los pacientes

inmunosuprimidos representan un foco potencial para su diseminación sistémica y además

es importante mencionar que estos pacientes pueden convertise en hospedadores de cepas

drogorresistentes.

5.2 Producción de alfa hemolisina y factor de necrosis celular (cnf-1).

El cnf-1 es una toxina de 2900 pb que produce necrosis en tejido, en la figura 4, se muestra

una sección de la secuencia del gen así como la región donde híbridan los dos iniciadores, el

CNF-s [5`-TTATATAGTCAAGATGGA-3`], que esta de color azulverde y el iniciador CNF-as

[5`-CACTAAGCTTTACAATATTGA-3`] es la región color azul, la parte amarilla es el producto

de amplificación de 633 pb.

Figura 4. Secuencia del gen que codifica para el cnf-1. Producto de 633 pb (Falbo y cols,
1993)
Entre los factores de patogenicidad más importantes se encuentran la α -hemolisina (Figura

5) y el cnf-1 (Figura 6), ya que su presencia simultánea alerta sobre la capacidad de

invasión y diseminación.

Cepa 22

Fig. 5 Hemólisis alfa producida por la cepa 22 en el medio agar sangre.

1 2 3 4 5 6

600 pb

Fig. 6 Detección del cnf-1. Carril 1: marcador de 100pb, carriles 2-6: factor de necrosis
positivo para las cepas 2, 11, 13, ATCC y HIV1. Gel de agarosa al 2% donde se observa la
banda de 600 pb.
En el tabla 7 se muestran los resultados obtenidos al comparar las cepas provenientes de

pacientes con y sin VIH respectivamente, encontrándose que los dos factores se presentaron

de manera simultanea en el 10% de las cepas de pacientes con VIH y solo en el 5.4% de las

cepas de pacientes inmunocompetentes, lo que sugiere una mayor patogenicidad de las

cepas de los pacientes con VIH.

El cnf-1 estuvo presente en el 100% de las cepas de pacientes con VIH en comparación

con las de los pacientes sin VIH que sólo se presentó en el 35.1%, esto refleja la

potencialidad de diseminación que tienen las cepas provenientes de los pacientes

inmunosuprimidos.

La alfa hemolisina se presentó de forma individual sólo en las cepas de los pacientes

inmunocompetentes. En ninguna de las cepas de pacientes con VIH se encontró sólo la

α hemolisina. En la tabla 8 se muestran las cepas de E.coli que presentaron estos factores.

Tabla 7. Frecuencia de α - hemolisina y cnf-1 en cepas de Escherichia coli proveniente de

pacientes con y sin VIH

Cepas provenientes Cepas provenientes

α -hemolisina cnf-1 de pacientes con VIH de pacientes sin VIH
n=10 n=37

+ + 1/10 (10%) 2/37 (5.4%)

+ - 0/10 (0%) 2/37 (5.4%)

- + 9/10 (90%) 11/37(29.7%)

- - 0/10 (0%) 22/37 (59.5)

Tabla 8. Cepas de Escherichia coli provenientes de pacientes con y sin VIH que portan los
genes α hemolisina y cnf-1 individual o simultáneamente.

Cepas provenientes
Cepas provenientes de
α -hemolisina cnf-1 de pacientes con VIH
pacientes sin VIH n=37
n=10

+ + H6 cepa11, cepa 13

+ - ******* cepa 14, cepa 22

cepa2,
H1,H2,H3,H4,H5,H7,
1C,4C,5C,6C,7C,8C,9C,
- +
H8,H9,H10
10C,11C,12C

cepas(1,3,4-10,12,15-
- - *******
21,23-25)C2 Y C3

Los resultados obtenidos por Caprioli y col (1989) e Island y col (1989) son diferentes, ya que

ellos encontraron que las cepas de E.coli causantes de ITU eran hemolíticas y presentaban

también el gen cnf-1. El encontrar el gen cnf-1 en todas las cepas de pacientes

inmunosuprimidos, muestra el potencial de estas cepas de provocar infecciones sistémicas,

ya que se le adjudica una alta virulencia a este factor, debido a que es por medio de el gen

cnf-1 que la bacteria logra la invasión al tejido, con la consecuencia de múltiples efectos que

van desde daño al tejido (cambios en la polarización de las fibras de actina del citoesqueleto)

causando la incapacidad de movimiento en las células, lisis de eritrocitos e inducción de la

formación de células multinucleadas; provocando necrosis por invasión y colonización del

tejido sin que se encuentre resistencia alguna por parte del huésped. (Caprioli y col., 1987,

Oswald y col., 1991 y Elliott y col., 1998).

5.3 Capacidad de adherencia

Otra manera de poder evaluar y comparar la virulencia de las cepas de E. coli es medir su

capacidad de adherencia, la cual impide a la bacteria que la orina la arrastre y ésta pueda

colonizar, invadir y dañar el epitelio urinario. Las cepas más patógenas cuentan con una alta

adherencia. Para realizar este ensayo, primero se hizo una curva de calibración del

colorante cristal violeta, esto con el fin de estandarizar la prueba. Se tomaron distintas

concentraciones del colorante en partes por millón (ppm) 5, 10, 15, y 20, por triplicado y se

colocaron en una placa de ELISA, se leyó en el espectrofotómetro y en base a las

densidades ópticas obtenidas se calculó la ecuación de la recta Y= 0.0179X – 0.0457 con un

coeficiente de relatividad de R2= 0.9947, ésto nos indica que los datos están correctos y la

prueba tiene validez.

En la figura 7 se observa la placa de ELISA con el ensayo de microtitulación en donde se

aprecia la capacidad de adherencia de las cepas (intensidad de coloración del cristal violeta),

podemos ver en las muestras por triplicado que se obtiene la misma intensidad de coloración

del cristal violeta, lo que indica que no hubo contaminación en las muestras.

Controles

Muestras

X1, X2, X3
Blancos

Fig. 7 Ensayo de microtitulación en placa, los controles se colocaron por triplicado en la

primera fila a la izquierda asi como los blancos en la ultima fila a la derecha. Las muestras
estan colocadas a partir de la segunda fila por triplicado

.
Una vez obtenidas las densidades ópticas se determinó la media y la desviación estándar del

control a partir de la ecuación de la recta obtenida en la curva de calibración, obteniéndose

una media de X=107 (promedio de las tres repeticiones) y una desviación estándar de

0.00365, para poder posteriormente clasificar las bacterias con base a la capacidad de

adherencia:

ODc= X + 3Desviaciones estándar

ODc= 107 + 3(0.00365)

ODc= 0.1180

No adherentes = OD ≤ ODc = OD ≤ 0.1180

Débil adherencia = ODc < OD ≤ 2ODc = 0.1180 < OD ≤0.236

Moderada adherencia =2ODc < OD≤ 3ODc = 0.236<OD ≤ 0.354

Fuerte adherencia =3ODc < OD ≤ 4 ODc = 0.354 <OD ≤ 0.472

En la tabla 9 se observan las densidades ópticas obtenidas en el lector de microplacas y en

base a esto la clasificación de capacidad de adherencia de las distintas cepas.

Tabla 9. Densidades ópticas obtenidas en el lector de ELISA, así como la clasificación de
las cepas con base a su capacidad de adherencia. No adherentes (0), Debilmente
adherentes (+), Moderadamente adherentes (++) y Fuertemente adherentes (+++)

ORIGEN DE LAS CEPAS OD CLASIFICACION

Cepa de pacientes con VIH
Control 0.107
1V 0.160 +
2V 0.144 +
3V 0.321 ++
4V 0.173 +
5V 0.152 +
6V 0.143 +
7V 0.188 +
8V 0.120 +
9V 0.127 +
10V 1.666 +++
Cepa de pacientes sin VIH
Control 0.112
1C 0.174 +
2C 0.114 +
3C 0.355 +
4C 0.383 ++
5C 0.112 0
6C 0.368 ++
7C 0.171 +
8C 0.246 ++
9C 0.147 ++
10C 0.114 +
11C 0.079 0
12C 0.494 +++
Control 0.107
1 0.087 0
2 0.102 0
3 0.112 +
4 0.135 +
 ORIGEN DE LAS CEPAS OD CLASIFICACION
Cepa de pacientes sin VIH
5 0.102 0
6 0.106 0
7 0.125 +
8 0.162 +
9 0.173 +
10 0.137 +
Control 0.107
11 0.142 +
12 0.140 +
13 0.115 0
14 0.213 +
15 0.116 0
16 0.117 0
17 0.091 0
18 0.109 0
19 0.133 +
20 0.127 +
21 0.160 +
22 0.292 ++
23 0.121 +
24 0.132 +
25 0.584 +++
ATCC25922 0.346 ++

Al analizar los resultados, se observa que en las cepas de los pacientes con VIH el 100% de

las cepas tiene capacidad de adherirse, el 80% presentaron adherencia débil, el 10%

moderada y el 10% fuerte adherencia.

En las cepas de los pacientes sin VIH solo el 71.61% presentaron adherencia, siendo el 50%

débilmente adherentes, el 15.8% moderadamente adherentes y el 5.3% fuertemente

adherentes. (Figura 8)
 80
70
60

Porcentaje
50
40 VIH
30 SIN VIH
20
10
0
No Moderada
adherentes adherencia

Fig. 8 Frecuencia de adherencia en cepas provenientes de las dos poblaciones estudiadas

en los que se representan como barras azules las cepas de pacientes con VIH y en rojo las
cepas de los pacientes sin VIH.

Los resultados obtenidos difieren de artículos como el de Mardh y col. en 1979, en los que se

describe que las cepas uropatógenas de E. coli son fuertemente adherentes a comparación

de los obtenidos en este estudio, dónde prevalecen las cepas con adherencia débil; esta

difencia de adherencias puede deberse a que la E. coli estudiada se tratara de una cepa

causal de cistitis o pielonefritis (en estos casos las cepas poseen una adherencia alta con la

cuál migran, colonizan e invaden el tracto urinario de forma ascendente sin ser arrastradas

por la orina).

Las cepas que se utilizaron en el presente estudio no reflejan una gran capacidad de

adherencia en su mayoría, sin embargo, el sólo hecho de que haya aunque sea una débil

adherencia, es un factor que impide que la orina arrastre la bacteria permitiéndole la

colonización del tejido y originar que la infección pueda ascender.

5.4 Determinación de genes de adherencia: pap, sfa y afa.

Los operones pap, sfa y afa codifican para genes de adherencia y se han encontrado

principalmente en E. coli asociada a las infecciones del tracto urinario. En la figura 9 se

muestra una sección de la secuencia del gen así como la región donde híbrida los tres

iniciadores.

a)
b)

Figura 9. Secuencias de las regiones de

hibridación de los iniciadores de adherencia. a).
Iniciadores usados en PCR. Diagrama de la
organización genética de los operones pap, afa y
sfa. b) Secuencias de DNA de los fragmentos
específicos de los operones pap, afa y sfa y los
iniciadores amplificados. (A) Secuencia interna de
DNA de 1.1-kb PstI fragmento específico del operón afa: la secuencia intermedia
aproximadamente de 60 pb muestra el sitio PapI. (B) Secuencia de DNA de 0.8-kb PapI
fragmento específico del operon sfa. Las secuencias de los iniciadores (afa l, afa2, sfa l, and
sfa2) están simbolizadas por flechas. Las regiones en las cuales las secuencias de
nucleótidos no fueron determinadas están simbolizadas por líneas punteadas. (Daigle y cols
1994)
En los resultados obtenidos se observaron cepas en los que se encontraban dos de los tres

genes (pap y sfa), al igual que otros estudios como el de Daigle y cols en 1994, ninguna de

las cepas mostró la presencia de los tres genes.

La presencia simultanea del gen pap (que codifica para la fimbria P) y la de el gen sfa (que

codifica para la fimbria S) se detectó en el 11.8% de las cepas de los pacientes sin VIH y en

el 10% de las cepas de los pacientes con VIH. La frecuencia de los genes individuales en

cepas de pacientes con y sin VIH fue 11.8% y 20% respectivamente. Se encontró en el

5.8% y 10% respectivamente el gen afa solo se detectó unicamente en el 3% de las cepas

de los pacientes sin VIH. El 67.6% y el 60% de las cepas sin y con VIH no presentaron

ninguno de los 3 factores. (Tabla 10, Fig. 10 y Fig. 11)

Tabla 10 Frecuencia de los genes de adherencia pap, sfa y afa, en cepas de pacientes con y
sin VIH

Frecuencia de genes de adherencia

Muestras sin VIH Muestras con VIH

Gen pap Gen sfa Gen afa
(n=34) (n=10)

+ + + 0/34 (0%) 0/10 (0%)

+ + - 4/34 (11.8%) 1/10 (10%)

+ - - 4/34 (11.8%) 2/10 (20%)

- + - 2/34 (5.8%) 1/10 (10%)

- - + 1/34 (3.0%) 0/10 (0%)

- - - 23/34 (67.6%) 6/10 (60%)

30
25
porcentaje

20
15
SIN VIH
10 CON VIH
5
0
gen gen gen
pap sfa afa
Fig. 10 Frecuencia de los genes de adherencia pap, afa y sfa

Marc 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
12 13 14

400 pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Fig. 11 Presencia de genes de adherencia (pap y sfa). Carril 1: marcador de 100pb ladder
carriles 2-15 cepas portadoras de los genes afa y sfa. Gel de agarosa al 2%
Los resultados mostrados en el presente trabajo de investigación concuerdan con los

obtenidos por Chantal Le Bouguenec y col en 1992, donde el gen más frecuente en las

cepas de E. coli uropatógenas fue el pap, ya que la fimbria P es uno de los factores de

virulencia mas importantes de esta bacteria, debido a que le confiere la capacidad de migrar

hacia la parte superior del tracto urinario provocando pielonefritis; se encontró la presencia

de los genes pap y sfa, pero al igual que el presente estudio, la presencia simultánea de los

tres genes no fue detectada.

5.5 Formación de Biopelículas

Las biopelículas juegan un papel esencial en la resistencia de las bacterias en el tracto

urinario, ya que gracias al exopolisacárido que estas liberan pueden formar una matriz con la

capacidad para defenderse de los ataques del huésped, de los antibióticos, e incluso poder

comunicarse entre éstas para poder transferirse genes de resistencia.

En éste estudio se evaluó la capacidad de E. coli para formar biopelículas (Figura 12). Los

resultados se observan en la tabla 11.

Figura 12. Formación de Biopelículas, teñidas con safranina.

Tabla 11. Presencia de biopelículas por cepa y porcentaje final de las cepas positivas de
pacientes con y sin VIH
 ORIGEN DE LAS CEPAS FORMACIÓN DE
CEPA DE PACIENTES SIN BIOPELICULAS
VIH
2-16 Sí
18-25
C4, C6, C7, C12
ATCC 25922
1, 17, C2, C5, C8, No
C9 y C11.
CEPA DE PACIENTES
CON VIH
1H Sí
2H Sí
3H Sí
4H Sí
5H Sí
6H Sí
7H Sí
8H Sí
9H Sí
10H No

CEPAS SIN VIH CEPAS CON VIH

n=34 * n=10

27/34 9/10
(77.1%) (90%)

*En este estudio solo se contó con 34 cepas ya que se eliminaron 3 que se habían
contaminado
Las cepas de los pacientes sin VIH presentaron formación de biopelículas en un 77.1%, en

cambio de las cepas de pacientes con VIH el 90% presentaron este factor de virulencia, lo

cuál sugiere la mayor patogenicidad de las últimas, razón por la cual las bacterias están

protegidas en el tracto urinario y los antibióticos no pueden erradicarlas, haciendo así que

estas cepas sean potencialmente más patógenas y que representen un foco potencial para

su diseminación sistémica. Ver tabla 11.

Al hacer una comparación de la capacidad de adherencia (Tabla12) en microplaca y en tubo

(biopelícula) se observa una gran similitud en los resultados obtenidos, ya que de la

población de cepas provenientes de pacientes con VIH, el 100% mostró adherencia y el 90%

formó biopelículas; mientras que en las cepas de pacientes inmunocompetentes el 70.3%

fueron adherentes y el 77.1% formó biopelículas. Esto refleja que una bacteria que es

adherente tiene la capacidad de formar biopelículas, donde antibióticos y células de defensa

del hospedador, resultan ineficaces, permitiendo a la bacteria crear reservorios que son

difíciles de eliminar.

Tabla 12. Capacidad de adherencia en microplaca y en tubo (biopeliculas) de las cepas

provenientes de pacientes con y sin VIH

Capacidad de adherencia

En microplaca En biopeliculas

Muestras VIH Muestras sin Muestras VIH Muestras sin

(n=10) VIH (n=37) (n=10) VIH (n=37)

Adherentes 10/10 (100%) 26/37 (70.3%) 9/10 (90%) 27/35 (77.1%)

5.6. Analisis de los RAPD´s (Random Amplified Polymorphic DNA – DNA polimórfico

amplificado al azar)

Para conocer la variabilidad genética de las cepas de Escherichia coli se realizó el análisis

de los RAPDs con tres iniciadores diferentes para poder comparar en este aspecto también a

las cepas de pacientes con y sin VIH.

5.6.1. Utilizando el iniciador OPA 07

Figura 13. Patrones de la amplificación con el iniciador OPA 07. De Izquierda a derecha
(marcador, control negativo, cepas 1-12 sin VIH, marcador, cepas 13-25 sin VIH, marcador)
iniciador OPA07

Figura 14. Patrones de la amplificación con el iniciador OPA 07. De izquierda a derecha
(marcador, control negativo, cepas control sin VIH (2,4,5,6,7,8,9,11,12), marcador, cepas con
VIH(1-10), marcador) iniciador OPA07
 Dice(fuzzy) (Opt:2.00%)
RAPD´s OPA7

40

45

50
Figura 15 Dendograma con el inciador OPA 07. Describe el porcentaje de similitud de la
totalidad de cepas estudiadas, la palabra Ctrl representa a las cepas provenientes de
pacientes sin VIH y las cepas obtenidas de pacientes con VIH se indican con las siglas VIH.

Al analizar el dendograma obtenido se observa una gran variabilidad genética ya que

ninguna de las cepas tiene un 100% de similitud con otra, pero si se observan 3 grandes

conglomerados en los que se dividen las cepas. Las cepas que resultaron con una mayor

similitud (92%) fueron la 8 y 9 de pacientes con VIH; al observar esto, se revisaron los

factores analizados anteriormente, observándose que coinciden en casi todos ya que ambas
presentan una resistencia total a los antibióticos, no presentan α hemolisina, tienen débil

adherencia y formaron biopelícula. Además, presentan el gen cnf-1, en lo único que se

diferencian es en que la cepa 9 presenta el gen de adherencia pap y la cepa 8 no tiene

ninguno de los genes.

5.6.2 Utilizando el iniciador p5

Figura.16 Patrones de la amplificación con el iniciador P5. Dirección de izquierda a

derecha (cepas 1-14 sin VIH, marcador, cepas 15-25 sin VIH, ATCC 25922 y marcador)
Iniciador P5
Figura 17. Patrones de la amplificación con el iniciador P5. De izquierda a derecha
(marcador, Control negativo, controles sin VIH(2,4,5,6,7,8,9,11,12), marcador, cepas con
VIH (1-10) , ATCC 25922, marcador) Iniciador P5
 Pearson correlation (Opt:2
RAPD´s P5

20
10

Figura 18 Dendograma del iniciador p5. Se describe el porcentaje de similitud de la

totalidad de cepas estudiadas la palabra Ctrl representa a las cepas provenientes de
pacientes sin VIH y las cepas obtenidas de pacientes con inmunosupresión contienen la
leyenda VIH.

En este dendograma se observa la formación de 4 conglomerados y aunque también se

observa una variabilidad genética importante, con este iniciador hay varias cepas que tienen
alto porcentaje de similitud; en el primer conglomerado (de arriba hacia abajo) vemos que no

hay gran similitud entre las cepas ya que el porcentaje mayor es del 88% entre las cepas

VIH-1 y Ctrl 6 que solo tienen en común la formación de biopelículas, presencia del gen cnf-1

y la ausencia de α hemolisina.

En el segundo conglomerado existe una gran similitud de las cepas y llama la atención que

en este grupo la mayoría son cepas provenientes de pacientes sin VIH, pero las únicas que

tienen el 100% de similitud son las cepas 1 y 2 las cuales coinciden en su alta sensibilidad a

drogas, la ausencia de α hemolisina y en la nula capacidad de adherencia.

En el tercer conglomerado, la mayor similitud se da entre las cepas provenientes de

pacientes con VIH 5 y 3 las cuales presentan un 92% de similitud, fue interesante recordar

que ambas cepas solamente difieren en la presencia de genes de adherencia ya que la

cepa 5 presentó los genes pap y sfa y la cepa 3 no posee ninguno de estos genes.

Finalmente, en el último conglomerado la mas alta similitud se dio entre la cepa de pacientes

sin VIH 11 y la cepas de paciente con VIH 2 con un porcentaje del 92% de similitud, pero a

diferencia del caso anterior ambas cepas presentaron la presencia del gen cnf-1 y la

ausencia de la α hemolisina.
5.6.3. Utilizando el iniciador OPL-04

Figura 19. Patrones de la amplificación con el iniciador OPL-04. De izquierda a

derecha (cepas sin VIH 2-12, marcador, cepas sin VIH 13-24) Iniciador: OPL-04

Figura 20 . Patrones de la amplificación con el iniciador OPL-04. De izquierda a

derecha (marcador, control negativo, cepa 1sin VIH, cepa 25 sin VIH, controles sin
VIH(2,4,5,6,7,8,9,11,12), marcador ,cepas con VIH(1-10), marcador) Iniciador OPL-04
 Different bands(fuzzy) (Opt:1
RAPD´s OPL4

97
Figura 21. Dendograma del iniciador OPL-04. Se describe el porcentaje de similitud de la
totalidad de cepas estudiadas. La palabra Ctrl representa a las cepas provenientes de
pacientes sin VIH y las cepas obtenidas de pacientes con inmunosupresión contienen la
leyenda VIH.

Este iniciador no mostró ser muy polimórfico, en general se observan 2 conglomerados, en

el primero se observa casi el 100% de similitud en todas las cepas y en el segundo

conglomerado la similitud es un poco menos en porcentaje, pero aun así no es tan marcada

la variablidad como con los dos primeros iniciadores por lo que a este análisis no se le dará

mucho seguimiento.
Análisis de los tres iniciadores juntos

RAPD´s OPA7+RAPD´s OPL4+RAPD´s P5

matriz general

Figura 22. Dendograma de los tres iniciadores: OPL4, P5 y OPA07. Se describen el

60

65

70
50

55
porcentaje de similitud de la totalidad de cepas estudiadas, la palabra Ctrl representa a las
cepas provenientes de pacientes sin VIH y las cepas obtenidas de pacientes con
inmunosupresión contienen la leyenda VIH.

El poder observar este árbol analizando las cepas estudiadas con los tres iniciadores

utilizados nos permite visualizar de una manera mas clara las cepas que tienen una mayor

similitud, y también poder comprender la gran variabilidad genética que estas cepas tienen.

En este dendograma se observan 3 conglomerados, observándose en el primero de ellos

la mayor similitud de las cepas y cabe destacar que en este se encuentran la mayoría de las

cepas provenientes de pacientes con VIH

Con este estudio se pudo observar que las cepas analizadas tanto de pacientes con VIH y

sin VIH mostraron una gran variabilidad genética.

VI. CONCLUSIONES

Las infecciones urinarias representan una alerta en pacientes con VIH, ya que el estado

inmunológico deprimido de los pacientes los hace más susceptibles a infecciones de

bacterias patógenas y oportunistas. Escherichia coli representa el patógeno oportunista más

frecuente de las bacterias asociadas a este tipo de infecciones. Debido a los tratamientos

inadecuados y a la poca respuesta que tienen los pacientes con inmunosupresión hace

suponer el origen de reservorios que generan cepas drogo resistentes.

La creciente presencia de E. coli en las muestras de orina de los pacientes con VIH, la

resistencia casi del 100% a las drogas comúnmente utilizadas, la presencia de CNF-1 y de

los genes de adherencia en mucha mayor proporción en las cepas provenientes de

pacientes con VIH comparada con aquellos que no lo tienen, alertan sobre la gran

patogenicidad que esta bacteria tiene, la cual requerirá de esquemas más estrictos de

tratamiento para evitar su diseminación tanto endógena como exógena.

La determinación de factores de virulencia describe a E. coli como una bacteria uropatógena

en pacientes con y sin VIH.

Se justifica realizar las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos a todas las cepas de

E.coli uropatógena (ECUP) con la finalidad de disminuir la creciente aparición de cepas

resistentes y lograr tratamientos más eficientes.

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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2008)
INDICE

I.- INTRODUCCIÓN..........................................................................................................................1

II. ANTECEDENTES ..........................................................................................................................2

2.1 VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH) TAXONOMÍA, HISTORIA Y EPIDEMIOLOGÍA........................2

2.2 FORMAS DE TRANSMISIÓN DEL VIH..........................................................................................................3
2.3 MECANISMO DE INFECCIÓN Y REPLICACIÓN DEL VIH.................................................................................4
2.4. INFECCIONES OPORTUNISTAS EN PACIENTES CON VIH................................................................................6
2.5 ESCHERICHIA COLI COMO AGENTE OPORTUNISTA........................................................................................9
2.6 INFECCIONES DEL TRACTO URINARIO (ITU)............................................................................................11
2.7 ANTIBIOTICOS.......................................................................................................................................12

III.- OBJETIVOS................................................................................................................................13

3.1. OBJETIVO GENERAL..............................................................................................................................13

3.2. OBJETIVOS PARTICULARES....................................................................................................................13

IV. MATERIALES Y MÉTODOS.....................................................................................................14

4.1.MUESTRAS...........................................................................................................................................14
4.2 CEPAS..................................................................................................................................................14
4.3 RECOLECCIÓN DE DATOS DEL EXPEDIENTE DE LOS PACIENTES CON VIH.....................................................15
4.4 TOMA, MANEJO Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA.......................................................................................15
4.5 MATERIALES Y EQUIPO..........................................................................................................................15
4.5.1 MATERIALES.....................................................................................................................................15
4.5.2 EQUIPO.............................................................................................................................................16
4.5.3 REACTIVOS........................................................................................................................................16
4.6. MÉTODOS............................................................................................................................................17
4.6.1 ANÁLISIS MICROSCÓPICO.......................................................................................................................17
4.6.2 CULTIVO Y PRUEBAS BIOQUÍMICAS.........................................................................................................17
4.6.3 SUCEPTIBILIDAD A DROGAS (MADIGAN Y COLS 2000)..........................................................................18
4.6.4 EXTRACCIÓN DE ADN (HONORE- BOUAKLINE Y COLS 2003).................................................................18
4.6.5 DETECCIÓN DEL CNF-1 (VAN BOST Y COLS 2003).................................................................................19

TABLA 1. CONDICIONES DE LA REACCIÓN DE PCR PARA LA DETECCIÓN DEL GEN

CNF-1...................................................................................................................................................19

4.6.6 DETECCIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ALFA HEMOLISINA (BEUTIN Y COLS 1989)...........................................20

4.6.7 CAPACIDAD DE ADHERENCIA (STEPANOVIC Y COLS 2000)........................................................................20
* FUERTEMENTE ADHERIBLES 4 X ODC < OD (+++).........................................................................20
4.6.8 DETECCIÓN DE GEN PAP, AFA Y SFA (LE BOUGUENEC Y COLS 1992).......................................................21
4.6.9 FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS (RIVERA Y MENDEZ 2005).......................................................................22
4.6.10 POLIMORFISMOS DE FRAGMENTOS AMPLIFICADOS AL AZAR (RAPD) (BERNAL Y COLS 2004)....................22
4.6.11 ANÁLISIS DE DATOS...........................................................................................................................26

V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN....................................................................................................26

5.1 SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS..................................................................................................................27

5.2 PRODUCCIÓN DE ALFA HEMOLISINA Y FACTOR DE NECROSIS CELULAR (CNF-1)............................................30
5.3 CAPACIDAD DE ADHERENCIA...................................................................................................................34
5.4 DETERMINACIÓN DE GENES DE ADHERENCIA: PAP, SFA Y AFA.....................................................................39
5.5 FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS...............................................................................................................42
5.6. ANALISIS DE LOS RAPD´S (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA – DNA POLIMÓRFICO AMPLIFICADO
AL AZAR) ..................................................................................................................................................45
5.6.1. UTILIZANDO EL INICIADOR OPA 07.....................................................................................................45
5.6.2 UTILIZANDO EL INICIADOR P5................................................................................................................48
5.6.3. UTILIZANDO EL INICIADOR OPL-04.....................................................................................................52

VI. CONCLUSIONES.........................................................................................................................55

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................................56