Vježba broj 9

ODREĐIVANJE AKTIVNOSTI ENZIMA: α-AMILAZE I KATALAZE

1. TEORETSKI DIO

Postoji niz metoda za određivanje aktivnosti amilaze. Prema njihovom principu mogu se podijeliti na
slijedeće grupe:

- Viskozimetrijske metode (zasnivaju se na smanjenju viskoznosti rastvora škroba zbog

hidrolitičkog djelovanja amilaze);
- Saharogene metode, zasnivaju se na određivanju reduktivnih spojeva koji nastaju hidrolizom
škroba. Ove metode nisu precizne;
- Hromogene metode, koriste se u proteklih 20-tak godina, a zasnivaju se na djelovanju
amilaze na škrob ili amilozu ili amilopektin koji su kovalentno vezani (eterski ili esterski) za
neku boju koja je derivat trijazina, koja se oslobađa pri hidrolizi škroba (amiloze ili
amilopektina) , centrifugiranjem odvaja i mjeri fotometrijski;
- Nefelometrijske metode, zasnivaju se na smanjenju zamućenosti reakcione smjese škroba i
ispitivanog materijala (urin, plazma, pljuvačka) nakon hidrolize škroba;
- Spektrofotometrijske i fluorimetrijske enzimske metode u kojima se prati oksidoredukcija
nikotinamidadenin dinukleotida (NAD-a);
- Fotometrijske metode sa sintetskim supstratima čiji se razgradni produkti mogu mjeriti
fotometrijski, kontinuirano. Takvi su supstrati razni: p-nitrofenilni i Cl-p-nitrofenilni maltozidi
(u obliku testova). To su najnovije i dosta precizne metode. Zamjenjuju klasične metode zbog
toga, što hidrolizom škroba pod djelovanjem amilaze nastaju produkti koji nisu tačno
definirani u datom momentu (amilo-, eritro-, ahromodekstrini);
- Amiloklasične metode-zasnivaju se na svojstvu škroba ili amiloze da sa jodom daju plavi
produkt (amilopektin sa jodom daje ljubičastu boju). Djelovanjem amilaze na škrob nastaju
prvo amilodekstrini (sa jodom daju plavoljubičastu boju), zatim eritrodekstrini (sa jodom daju
crvenu boju), ahromodekstrini (ahrodekstrini) sa jodom se ne boje U grupu amiloklasičnih
metoda ubraja se i metoda određivanja amilaze po Wohlgemuth-u.

Prva metoda za određivanje aktivnosti amilaze koja se zasniva na tome koje razrijeđenje uzorka još
razgrađuje škrob, pa se dodatkom joda (Lugolovog rastvora) ne javlja plava boja. Metodu je uveo
Wohlgemuth kao prvu metodu određivanja enzima u dijagnostičke svrhe. Najveću dijagnostičku
vrijednost metoda je pokazala kod oboljenja pankreasa i parotitisa. Tako α-amilaza iz pljuvačke
(ptijalin) ima povećanu aktivnost u pljuvačci, serumu i urinu kod akutnog parotitisa (zaušnjaka) ili kod
čira (ulcusa) na želucu. Amilaza iz pankreasa (dijastaza) ima povećanu aktivnost u serumu i urinu kod
akutne nekroze pankreasa u početnom stadiju, akutnog pankreatitisa. Značajno povišenje aktivnosti
dijastaze u urinu javlja se kod upala žučne kese, uremije, perforacije čira na želucu, postoperativnih
stanja.

Katalaza je široko rasprostanjen enzim i sreće se kod prokariaota i eukariota. Predstavlja dio
antioksidativne zaštite organizma. Katalaza razlaže toksični vodikperoksid na molekul kisika i vodu.
Katalaza je tetramer sastavljen od četiri polipeptidna lanca, svaki sadrži preko 500 aminokiselina.
Sadrži četiri porfirinska hema, grupe koje omogućavaju enzimu da reaguje sa vodikperoksidom.
Zastupljen je gotovo kod svih organizama, počev od mikroorganizama (aerobnih i anaerobnih),
biljaka, životinja do čovjeka. Kod čovjeka je široko zastupljenja posebno u ćelijama jetre u
peroksizomima i crvenim krvnim zrncima. Optimalni pH za ljudsku katalazu je oko 7, dok kod ostalih
organizama, u zavisnosti od vrste pH se kreće između 4-11. Ljudska katalaza djeluje na 37°C, dok kod
nekih jednoćelijskih organizama optimalna temperatura djelovanja je 90°C. Osnovna uloga ovog
enzima je razgradnja vodikperoksida.

Katalaza je veoma aktivan enzim, jedna molekula katalaze konvertuje million molekula
vodikperoksida u vodu i kisik svake sekunde. Katalaza može katalizirati i oksidaciju, pomoću
vodikperoksida, različitih metabolita i toksina, kao što su formaldehid, mravlja kiselina, fenoli,
acetilaldehid i alkoholi. Dešava se slijedeća reakcija, čiji mehanizam je i dalje nepoznat.

H2O2 + H2R → 2H2O + R

Joni teških metala (kao što su bakarni joni) mogu da se ponašaju kao nekompeticijski inhibitori
katalaze. Otrovi, kao što su cijanidi su kompeticijski inhibitori katalaze, snažno se vezuju za hem
katalaze i zaustavljaju enzimsku reakciju. Kod čovjeka i drugi enzimi mogu da razgrade vodikperoksid.
Glutationperoksidaza je u fiziološkim uslovima (mala koncentracija vodikperoksida) je čak aktivnija od
katalaze. Kada koncentracija vodikperoksida poraste uključuje se katalaza. Katalaza test je jedan od
tri glavna testa koji se koristi u mikrobiologiji za identifikaciju bakterija. Prisustvo enzima katalaze se
detektuje upotrebom vodikperoksida. Bakterije koje su katalaza-pozitivne dodavanjem
vodikperoksida „oslobađaju” kisik.

2. EKSPERIMENTALNI DIO

 Određivanje aktivnosti α-amilaze

U stalak se pripremi 10 čistih epruveta i u svakoj odpipetira po 1 ml fiziološkog rastvora (0,90% NaCl).
U posebnu, čistu epruvetu se sakuplja profiltrirana pljuvačka bez dodatka vode radi lakšeg i bržeg
filtriranja. Sakupi se nešto više od 1 ml, a potom odpipetira 1 ml i stavi u prvu epruvetu. Sadržaj
epruvete se dobro promiješa i na taj način se dobije dva puta razblažena pljuvačka. Nakon toga se
odpipetira 1 ml tako razblažene pljuvačke i stavi u drugu epruvetu. Sadržaj i ove epruvete se dobro
promiješa i dobije četiri puta razblažena pljuvačka. Postupak se ponavlja sve do desete epruvete iz
koje se 1 ml pljuvačke izbaci. Potrebno je prilikom ovog razblaživanja pipetu kojom se pipetira i
prebacuje sadržaj jedne epruvete u drugu, nakon svakog prebacivanja sadržaja isprati vodom. Kada
se naprave razblaženja pljuvačke, u svaku epruvetu se odpipetira po 1 ml 0,1% koloidnog rastvora
škroba. Sadržaji u svakoj epruveti se promiješaju, sve se vrati u stalak i termostatira na sobnoj
temperaturi. Poslije 15 minuta termostatiranja u svaku epruvetu (od desete do prve) se doda po
jedna kap Lugolovog reagensa. U epruvetama u kojima je škrob hidroliziran nema plave boje, a u
kojima nije hidroliziran pojavljuje se plava boja. Između obojenih i neobojenih sadržaja u epruveta
javlja se jedan koji sa Lugolovim rastvorom daje crvenu boju. Boja potiče od razgradnih produkata
škroba-eritrodekstrina sa jodom iz Lugolovog reagensa. U toj epruveti razblažena pljuvačka sadrži
jednu enzimsku jedinicu α-amilaze, po Wohlgemuth-u. Jedna enzimska jedinica α-amilaze po
Wohlgemuth-u je ona aktivnost ovog enzima pri kojoj se na temperaturi od 38 C hidrolizira 1 mg
škroba za 30 minuta, odnosno 0,00055 mg škroba za jednu sekundu. Najmanje razblaženje uzorka u
kome se za 30 minuta na temperaturi od 38 C hidrolizira jedan mg škroba do produkata koji sa
Lugolovim rastvorom ne daju plavu boju (eritrodekstrini-daju crvenu boju) sadrži jednu jedinicu α-
amilaze po Wohlgemuth-u (1 WJ).
Pretvaranje IU u katale:

1 kat = 1 mol/s = 60 mol/min = 60x106 μmol/min = 6x107 IU

1 IU = 1 μmol/min = 1/60 μmol/s = 1/60 μkat = 16,67 nkat

Ukoliko se kao supstrat na koji djeluje amilaza koristi škrob koji ima molekulsku masu 55000, onda 1
WJ α-amilaze iznosi 0,01 nkat.

 Određivanje aktivnosti katalaze

Princip određivanja: Prema Bah-u i Oparin-u kvantitativno određivanje katalaze zasnovano je na

osobini H2O2 koji zaostaje nakon razložnog djelovanja katalaze, da reaguje sa KMnO4 uz obrazovanje
slobodnog kisika. Jednačina ove reakcije je slijedeća:

2KMnO4 + 5H2O2 + 4H2SO4 → 2MnSO4 + 2KHSO4 + 8 H2O + 5O2

Na osnovu razlike u mL rastvora KMnO4 utrošenog za titraciju kontrolne probe i ogledne probe dolazi
se do količine H2O2 koja je razložena od strane enzima.

Reagensi i pribor:

- Preparat katalaze: Odmjeriti na analitičkoj vagi 2g brašna ili drugog izmljevenog biljnog
materijala, staviti u balon od 100 mL, dodati vode i dobro promućkati, zatim dodati 2-3 kapi
toluola, dopuniti balon destilovanom vodom do markice i ostaviti smjesu na sobnoj
temperaturi u toku 2 sata. Posle ekstrakcije, sadžaj profilitrirati kroz naboran filter papir
(može i centrifugirati) i filtrat koristiti kao ekstrakt katalaze. Za ekstrakciju enzima može se
koristiti i krompir. 20g krompira isitniti i izmrviti, staviti u balon, dodati vode, promućkati,
dopuniti vodom do 50 mL i profiltirrati. Za ispitivanje katalaze može se koristiti i krv u
razblaženju 1:1000.
- 1% rastvor H2O2
- 10% H2SO4
- 0,1 M KMnO4
- 0,1 M NaOH

Tok određivanja: U četiti tikvice nasuti pipetom po 20 mL filtrata, zatim u posljednje dvije (3 i 4) koje
služe kao kontrolne zagrijati da sadržaj proključa (kuhati 5 minuta) radi inaktivacije enzima, a onda
ohladiti.

Posle toga u sve tikvice dodati po 20 mL destilovane vode, po 5 mL 1% rastvora H2O2, koji je
prethodno neutraliziran rastvorom NaOH i ostaviti ih na sobnoj temperaturi u toku 30 minuta. Posle
tog roka dodati u probe po 5 mL 10% H2SO4 i smjesu titrirati rastvorom KMnO4. Aktivnost katalaze se
određuje po količini mg H2O2 koji se u toku 30 minuta razloži pomoću katalaze koja sadrži 1 g
ispitivanog materijala (1 mL 0,1 M KMnO4 ekvivalentan je 1, 7 mg H2O2).

(𝒂−𝒃)𝒙 𝟏,𝟕
A=
𝒈

Gdje je:
a- broj mL 0,1 M KMnO4 utrošenog za kontrolnu probu

b - broj mL 0,1 M KMnO4 utrošenog za uzorak

g –količina ispitivanog uzorka u g