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CENTRO DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA


LABORATÓRIO DE ENGENHARIA QUÍMICA III

Determinação da atividade
da Enzima Invertase livre
1. RESUMO

O objetivo deste experimento determinar a atividade da enzima invertase através


do método das velocidades iniciais, nas temperaturas de 45 a 60C, com intervalo de 5C.
Para o estudo, foi realizada a reação da hidrólise da sacarose pela ação da enzima
invertase livre em reator batelada. As propriedades da enzima invertase foram
determinadas com solução de sacarose e caracterizando-se a enzima através da
determinação da atividade e da energia de ativação da reação.

2. INTRODUÇÃO

Enzimas são biomoléculas que possuem alto poder catalítico, muito superiores aos
dos catalisadores que são produzidos sinteticamente, além disso, são altamente
específicas. O objetivo de um catalisador é acelerar as reações químicas, portanto essa é a
função da enzima, que desempenham este papel nas reações que ocorrem nos
organismos, sendo que muitas destas reações não ocorreriam sem a presença das
enzimas
As enzimas possuem diversas aplicações, podem auxiliar na quebra de grandes
moléculas de nutrientes, como proteínas, gorduras e carboidratos em moléculas menores,
permitindo a passagem por sua membrana, e também são responsáveis pela estocagem e
liberação de energia.
A enzima invertase é utilizada na hidrólise da sacarose a xarope de glicose e frutose,
que é muito utilizado na indústria alimentícia. Essa reação enzimática apresenta
vantagens em relação aos métodos tradicionais de hidrólise ácida com ácido sulfúrico,
pois o consumo energético é menor, além de o produto obtido ser de melhor qualidade.

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1. ENZIMAS

Enzimas são proteínas, que atuam como catalisadores biológicos e participam


reações metabólicas de todos os organismos vivos. Elas têm a função de reduzir a energia
de ativação de uma reação, aumentando assim a sua velocidade sem que a constante de
equilíbrio ou a energia livre da reação seja alterada. Estão presentes no metabolismo dos
organismos vivos e são responsáveis pela biossíntese de inúmeros compostos, sob
condições de temperatura e pressão semelhantes ao do ambiente.
As enzimas não são alteradas após sua aplicação como catalisadores nos
processos. Cada enzima é altamente específica para com o substrato, ou seja, ela é
responsável por um único tipo de reação química. Elas podem ser de origem animal,
vegetal, bacteriana e fúngica, e possuem diversas aplicações na indústria, como por
exemplo no preparo de alimentos, remédios e um enorme número de compostos
químicos. Porém, o uso das mesmas em aplicações industriais tem sido limitado, porque a
maioria das enzimas é relativamente instáveis, seu custo é alto e é difícil recuperar a
enzima ativa no final do processo. Isso restringe o uso de enzimas solúveis a processo em
batelada, seguido de procedimentos para separar o produto da mistura reacional, levando
à desnaturação da enzima e tornando o processo, na maioria das vezes, antieconômico.
O tamanho de suas moléculas é grande, quando comparado com substratos ou
grupos funcionais, tendo um peso molecular variando de perto de 12000 até acima de um
milhão.
A enzima invertase é também chamada de frutofuranosidade e ela catalisa a
hidrólise da sacarose, que se divide em glicose e frutose, gerando uma mistura equimolar
desses dois componentes, que é conhecida como açúcar invertido.
A sacarose é o dissacarídeo que é encontrado em alta quantidade e freqüência na
natureza, e também é muito importante na alimentação humana. Ela é encontrada
normalmente na cana-de-açúcar e a beterraba, mas também em todas as plantas que
sofrem o processo de fotossíntese.

3.2. CINÉTICA ENZIMÁTICA EM FASE HOMOGÊNEA

O centro ativo de uma enzima é uma estrutura formada por aminoácidos residuais
com alta afinidade pelo substrato, e a funcionalidade biológica das enzimas depende da
manutenção de sua estrutura protéica nativa.
Existem alguns fatores que influenciam a atividade enzimática, a qual é avaliada
através do aumento ou redução da velocidade da reação catalisada. A análise da atividade
da enzima é chamada cinética enzimática, e é determinada por diferentes fatores, como
concentração da enzima, concentração do substrato e sua disponibilidade, concentração
de cofatores, concentração e tipo de inibidores (quando presentes), e ainda pH e
temperatura.
O avanço de grande parte das reações enzimáticas, a velocidade de reação diminui
com o tempo. Os fatores que podem contribuir para esta diminuição da velocidade de
reação podem ser:
 Produto da reação inibe a enzima;
 O grau de saturação da enzima com o substrato pode diminuir devido ao
decréscimo da concentração de substrato, a medida que avança a reação;
 As reações reversas podem se tornar a medida que a concentração do produto
aumenta;
 A enzima pode sofrer inativação térmica ou pelo PH.
Se estes fatores acima mencionados não tiverem tempo de se manifestar, a
atividade enzimática é determinada a partir da medida da velocidade inicial da reação
pois neste ponto as condições em que a reação se processa são exatamente conhecidos.

3.3. ATIVIDADE ENZIMÁTICA


A determinação da atividade da enzima envolve a medida da velocidade da reação,
portanto, as seguintes definições devem ser conhecidas:

 Atividade: uma unidade “U” de atividade é a quantidade de enzima que catalisa a


transformação de 1mol de produto por minuto, nas condições de ensaio
(temperatura, pH, concentração de substrato, etc.)(U = moles de
produto/minuto).
 Atividade específica: é expressa em termos da atividade por miligrama de proteína
(U/mg).
A atividade catalítica das enzimas depende da temperatura, e como no caso dos
catalisadores convencionais, à medida que se aumenta a temperatura a taxa da reação
aumenta, porém, a estabilidade da proteína descreve a desativação térmica.
A atividade catalítica das enzimas é altamente dependente da temperatura, como
no caso dos catalisadores convencionais, porém, à medida que se eleva a temperatura
dois efeitos ocorrem simultaneamente: (i) a taxa de reação aumenta, como se observa na
maioria das reações químicas; (ii) a estabilidade da proteína decresce devido à
desativação térmica.
A influência da temperatura sobre a atividade da enzima livre ou imobilizada é,
geralmente, representada em termos de atividade ou velocidade de reação em função da
temperatura.
Para o cálculo da atividade enzimática (A) utilizou-se a seguinte equação:

µ𝑚𝑜𝑙𝑠 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒 + 𝑓𝑟𝑢𝑡𝑜𝑠𝑒


𝐴 = 𝑏. (𝑈) (1)
𝑚𝑖𝑛

E a atividade específica (Ae) da enzima:

A moles de gli cos e


Ae  . (2)
mg de proteína utilizadas min .mg

Onde:
y = a  b.t é dada nos gráficos de µmols de glicose + frutose versus tempo.
a = coeficiente linear da reta ajustada.
b = coeficiente angular da reta ajustada.
t = tempo de reação (min).
y = µmoles de glicose + frutose.

Para o calculo da energia de ativação (Ea), utiliza-se o gráfico de ln da atividade


versus o inverso da temperatura, a equação para a determinação é:

𝐸𝑎
− =𝑏
𝑅
𝐸𝑎 = −𝑏. 𝑅 (𝐽) (3)
Onde:
y = a  b.t é dada nos gráficos de ln da atividade versus o inverso da temperatura.
a = coeficiente linear da reta ajustada.
b = coeficiente angular da reta ajustada.
1/T = inverso da temperatura (1/K).
y = ln da atividade.
R= constante universal dos gases perfeitos.

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. MATERIAIS

 Solução de sacarose 5% p/v, pH 4,5 tamponada com tampão acetato de sódio;


 Solução de invertase solubilizada na concentração de 1g/L;
 Banho termostático;
 Reator batelada encamisado, com agitação (CSTR);
 Banho contendo água em ebulição;
 Tubos de ensaio;
 Reagente DNS;
 Água destilada;
 Cronômetro;
 Espectrofotômetro;
 Termômetro;
 Proveta 50 ml;
 Balão volumétrico;
 Pipetas automáticas;
 Agitador “vortex”;

4.2. MÉTODOS

Primeiramente regulou-se a temperatura de 45º C no banho termostático, e


diluiu-se a enzima livre em 1:20 (0,5mL de solução de enzima + 9,5mL de água).
Após alcançada a estabilidade da temperatura, adicionou-se 50 ml de solução de
sacarose no reator e com a agitação ligada, aguardou-se até a temperatura desejada.
Foi retirada o branco para a leitura da absorbância contendo 0,5mL de sacarose +
2,0 mL de água.
Depois, no reator, foi adicionado 1 mL da solução de enzima com uma
concentração de 0,05 mg/mL, e imediatamente acionou-se o cronômetro. Após 10s,
retirou-se uma amostra de 0,5mL e colocou-se a mesma em um tubo de ensaio contendo
2,0 mL de água. Com o tubo devidamente fechado para uma menor evaporação, levou-se
ao banho contendo água em ebulição por 10 minutos. As amostras de 0,5mL foram
retiradas do reator, com o auxílio da pipeta automática, em tempos de 3 em 3 minutos
até atingir um total de 21 minutos, sendo que todas foram levadas a fervura durante um
período de 10 minutos.
Alcançado o tempo de fervura necessário para a inativação da enzima, as amostras
foram levadas a uma bacia com banho frio até que alcançasse a temperatura próxima a
ambiente.
Então, depois disso, feito a análise dos açúcares redutores transferindo-se 0,5mL
de cada amostra para outro tubo de ensaio, devidamente agitados para evitar soluções
nas paredes do tubo, adicionando-se 2,5mL de DNS. Os tuboS foram então agitados e
devidamente fechados para evitar evaporação, e então levados em banho fervente por
10 minutos. Esfriou-se novamente em banho frio para atingir a temperatura ambiente, e
adicionou-se 3mL de água destilada. Agitou-se novamente os tubos e fez-se a leitura de
absorbância de cada amostra em um comprimento de onda de 600 nm.
Esta sequencia foi refeita para as temperaturas de 50ºC, 55ºC e 60ºC.

5. RESULTADOS

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA INVERTASE LIVRE.

Para determinação da quantidade de glicose+frutose contida em cada amostra


(mg/mL) a partir dos dados de absorbância, é necessário a curva padrão do reagente
utilizado, o DNS, que foi fornecida pelo laboratório. A curva padrão para este experimento
foi:

y = 0,4491x – 0,0172 (4)

O cálculo de moles de glicose+frutose foi obtido pela equação abaixo:

moles de glicose = Gr*Vr/PM (5)

Sendo:
Gr = glicose+frutose formada
Vr = Volume de reação
PM = peso molecular da glicose+frutose (0,360 mg/mol)

Os resultados obtidos para as diferentes temperaturas e o gráfico para determinação


da atividade são apresentados abaixo:

Volume de Quantidade de
Tempo reação glicose+frutose mi moles de
Amostra (min) (mL) Absorbância formada (mg/mL) glicose
1 0 51 -0,016 0 0
2 3 50,5 0,02 0,8283233133 116,1953537
3 6 50 0,072 1,986194611 275,8603627
4 12 49,5 0,096 2,520596749 346,582053
T=45C
5 15 49 0,14 3,500334001 476,4343502
6 18 48,5 0,15 3,723001559 501,5710433
7 21 48 0,212 5,103540414 680,4720552
8 24 47,5 0,224 5,370741483 708,6395012

Tabela 1 – Valores obtidos para atividade enzimática a temperatura de 45C.

TEMPERATURA = 45 graus celsius


800
700
mi moles de glicose+frutose

600
500
400
300
y = 28,688x + 33,205
200 R² = 0,9739
100
0
0 5 10 15 20 25 30
Tempo (min)

Gráfico 1- Atividade enzimática para temperatura de 45C.

Volume de Quantidade de
Tempo reação glicose+frutose mi moles de
Amostra (min) (mL) Absorbância formada (mg/mL) glicose
1 0 51 -0,03 0 0
2 3 50,5 0,021 0,850590069 119,3188847
3 6 50 0,06 1,718993543 238,7491031
4 12 49,5 0,094 2,476063238 340,4586952
T=50oC
5 15 49 0,113 2,899131597 394,6040229
6 18 48,5 0,132 3,322199955 447,5741607
7 21 48 0,245 5,838343353 778,4457804
8 24 47,5 0,283 6,684480071 881,9800094

Tabela 2 – Valores obtidos para atividade enzimática a temperatura de 50C.

Temperatura=50C
1000
900
mi moles de glicose+frutose

800
700
600
500
400
300 y = 33,503x - 14,455
200 R² = 0,9205
100
0
-100 0 5 10 15 20 25 30
Tempo (min)

Gráfico 2- Atividade enzimática para temperatura de 50C.

Volume de Quantidade de
Tempo reação glicose+frutose mi moles de
Amostra (min) (mL) Absorbância formada (mg/mL) glicose
1 0 51 -0,005 0 0
2 3 50,5 0,056 1,62992652 228,6424701
3 6 50 0,104 2,698730795 374,8237215
4 12 49,5 0,134 3,366733467 462,9258517
T=55oC
5 15 49 0,197 4,769539078 649,1872634
6 18 48,5 0,21 5,059006903 681,5606522
7 21 48 0,298 7,018481407 935,797521
8 24 47,5 0,322 7,552883545 996,5610233

Tabela 3 – Valores obtidos para atividade enzimática a temperatura de 55C.

Temperatura=55C
1200
mi moles de glicose+frutose

1000

800

600

400
y = 38.665x + 62.71
200 R² = 0.9674

0
0 5 10 15 20 25 30
Tempo (min)

Gráfico 3 - Atividade enzimática para temperatura de 55C.

Volume de Quantidade de
Tempo reação glicose+frutose mi moles de
Amostra (min) (mL) Absorbância formada (mg/mL) glicose
1 0 51 0,001 0 0
2 3 50,5 -0,003 0 0
3 6 50 0,002 0,02226675573 3,092604963
4 12 49,5 0,017 0,3562680917 48,98686261
T=60oC
5 15 49 0,001 0 0
6 18 48,5 0,015 0,3117345803 41,9975754
7 21 48 0,023 0,4898686261 65,31581682
8 24 47,5 0,016 0,334001336 44,06962072

Tabela 4 – Valores obtidos para atividade enzimática a temperatura de 60C.

Chart Title
70
mi mols de glicose + frutose

60

50

40

30

20
y = 2,4442x + 0,9131
10 R² = 0,7335

0
0 5 10 15 20 25 30
Tempo (min)

Gráfico 4 - Atividade enzimática para temperatura de 60C.

Determinação da atividade enzimática (A):

A atividade enzimática (A) foi calculada pela equação (1):


µ𝑚𝑜𝑙𝑠 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒 + 𝑓𝑟𝑢𝑡𝑜𝑠𝑒
𝐴 = 𝑏. (𝑈)
𝑚𝑖𝑛

Sendo b o coeficiente angular da reta ajustada para os gráficos moles de glicose


versus tempo de reação.

Feito para todas as temperaturas.

A atividade específica (Ae) da enzima foi calculada pela equação (2):

A moles de gli cos e


Ae  . (2)
mg de proteína utilizadas min .mg

Feito para todas as temperaturas.

A quantidade de mg de proteína utilizada foi fornecida pelo técnico do laboratório,


sendo de 185 mg de proteína por g de pó.

Abaixo estão demonstrados os resultados:

Atividade
Temperatura enzimática Atividade
(oC) (U/mL) específica (U/mg) ln Ae 1/T
40 28,688 0,1550702703 -1,863876908 0,003193357816
50 33,503 0,1810972973 -1,708720838 0,00309453814
55 38,665 0,209 -1,565421027 0,003047386866
60 2,404 0,01299459459 -4,343221808 0,003001650908

Tabela 5 – resultados das atividades enzimáticas obtidas para cada temperatura

Partindo da equação abaixo:

Ea 1
ln  A  ln  A0     (6)
R T 

É possível construir o gráfico lnAe versus 1/T, obtemos o coeficiente angular -Ea/R.
Energia de ativação

Ln atividade específica

y = -1971.9x + 4.4233
R² = 0.9684

1/T

Gráfico 6- Gráfico para determinação da energia de ativação.

Logo,

-Ea/R = -1971,9
Sendo:
R = 8,314 J.K-1. mol-1

Ea = -16394,4 J/mol

6. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS.


Foram obtidas as atividades enzimáticas e as atividades enzimáticas específicas
para reações de hidrólise da sacarose a xarope de glicose e frutose a 45, 50, 55 e 60°C. A
partir dos gráficos apresentados, é possível observar que para cada temperatura, o
número de moles de glicose formados é proporcional ao tempo de reação, como era
esperado
Com relação aos resultados obtidos para a atividade enzimática, foi possível
observar que esta aumentou com a temperatura até 55 ºC, o que era esperado pois uma
maior temperatura proporciona uma maior velocidade de reação. Porém, para a
temperatura de 60 ºC, observa-se uma diminuição da atividade enzimática, indicando uma
possível desnaturação da enzima. Por isso para obtenção do gráfico de 1/T x Ln atividade
específica, foi desconsiderado o ponto do ensaio a 60 ºC, obteve-se então uma energia de
ativação de -16394,4 J/mol.
7. CONCLUSÃO.
Este é um experimento necessário para se estudar a cinética de uma reação
enzimática, observar sua dependência com a temperatura e uma estimar a energia de
ativação para a reação. É importante ressaltar que para uma melhor determinação da
energia de ativação seriam necessários mais pontos com um intervalo de temperatura
menores.
Alguns erros puderam ser observados durante o procedimento, como erros nas
coletas das amostras, das diluições, erros de leitura da absorbância devido a imperfeições
nas cubetas. Todos esses erros, podem ter prejudicado os resultados obtidos, por isso é
importante ter precisão e meticulosidade no manuseio dos equipamentos.
A partir dos dados obtidos, pode-se concluir que o experimento foi bem-sucedido na
demonstração do comportamento enzimático.

8. BIBLIOGRAFIA.
Bergamasco, R. “Cinética da hidrólise da sacarose pela invertase”. Dissertação de
mestrado. Universidade estadual de Londrina, 1989.

Zanin, G. M. “Sacarificação de amido em reator de leito fluidizado com enzima


amiloglicosidase imobilizada”. Tese de doutorado. Universidade estadual de Campinas,
1989.