Genotoxicity evaluation in workers

occupationally exposed to lead

Paramjit Grover*, P.V. Rekhadevi, K. Danadevi, S.B. Vuyyuri, M. Mahboob, M.F. Rahman

김윤지, 박지민, 위혜진, 이현정, 임미래, 장보미

당신의 생각은?
세포 내부에서 유전 정보 손상 또는 돌연변이를 야기하는 것.

발암 가능성이 있음.

변질은 DNA에 직간접적으로 영향을 미칠 수 있음.

- 돌연변이 유도, 직접적인 DNA 손상

영구적 유전 변화는 미래세대로 전달되는 체세포, 생식세포 어느 한 쪽에 영향을 줌.

세포들은 DNA 수선, 세포자살 중 하나에 의해 돌연변이 발병 예방.

- but 손상이 돌연변이 유발로 이어지는 것을 항상 막을 수 없음.
납(lead)이란?
특성
- CAS No. 7439-92-1
- Pb (MW = 207.20g)
- 청회색의 고체
- 무겁지만 자르거나 압연이 쉬워 가공
용이한 금속
용도
- 화석연료 연소시, 식수 납 파이프, 페인트, 색소, 축전지 재료, 피복전선
재료, 유리의 유약 재료, 화장품 재료, 석유정제첨가물 재료 등
영향
- 뇌 질환, 근육약화, 쇠약, 변비, 두통, 안면창백, 기억상실, 불면증, 식욕부진,
체중감소, 빈혈, 초조감.
혜경씨가 6년 동안 만진 솔더크림에는 납 성분이 포함되어 있다. 납은
대표적인 발암물질이며, 고농도의 납에 노출되면 뇌에 이상증상이
일어나기도 한다. 얇은 비닐장갑 하나를 낄 뿐이라 피부에 크림이 묻는
일도 빈번했다. 그러나 혜경씨는 솔더크림에 납 성분이 포함되었다는 말을
들어본 적이 없었다.

오직 혜경씨가 받은 교육은 몸에 솔더 크림이 묻었을 때는 유기용제 IPA로

닦으라는 것이었다. 유기용제 또한 발암물질인 벤젠 성분이 들어 있다. 삼성
반도체를 그만둔 지 4년 후, 2005년 10월 혜경씨는 소뇌부 뇌종양 진단을
받았다.
광범위한 환경과 산업의 독소 중 하나로 심각한 공중 보건 문제를 유발.

납 화합물들은 발암 물질로 지정

연구 목적
인도 Hyderabad의 2차 납 회수시설 근로자들의
DNA손상, 소핵 빈도, 염색체 이상, 항산화 효소
수준에 대한 노출 영향을 평가.
2.1 : 실험 대상

직접 설문조사에 근거 (인구 통계학 기준)

- 의학(X-ray, 예방접종, 약), 생활양식(흡연, 커피, 알코올, 다이어트),
직업문제(근무시간/일, 연 노출, 보호장비)를 포함

실험군과 대조군 각각 여섯 집단으로 나눔

실험군 : 초기 실험대상자 326명 중 최종 90명을 선발

윤리위원회에 의해 승인됨.
2.1 실험 대상

실험군 (n=90) 대조군 (n=90)

• 폐전지 납 추출에 주로 종사
• 납산 배터리 제조 • 납 노출 X
• 약 300 day/year 근로 • 체내 중금속 X
• 4.5 ㎍/㎥ 의 납에 노출 • 유전독성 물질 X
• 동일연령집단 • 약물 복용 X
• 동등한 사회경제적 집단 • 방사선 노출 X
2.2 : 자료 수집

샘플 : 혈액, 소변, 구강점막도말

→ 실험군, 대조군 모두 채취, ICE 상태로 실험실로 운송,
2시간 안에 가공처리, 6개월간 수행

혈액 샘플 : 정맥혈 5mL 수집, Heparini 처리가 된 혈액 2mL을

Eppendorf에 투여, 남은 3mL은 생화학분석처리

소변 샘플 : 소변 통에 소변 10mL을 수집

구강점막도말 샘플 : 칫솔로 볼 안쪽을 문질러 얻음

2.3 : 혈중 및 뇨중 납 농도

• 유도결합 플라즈마 질량분석기 사용

(ICP-MS/Autralia, Varuan, Ultramass-700)
• 사중극 질량분석기 사용

암모니아(0.07M)가 포함된 4.5mL 탈염수 : Triton-X

100 (500mg/L)+Na-EDTA(500mg/L)=1:9
→ 혈액 부분 표본의 0.5mL을 희석

희석된 샘플들은 ICP-MS에 의해 분석.

소변샘플은 질산과 함께 상온에서 처리.
혈액과 소변 농도는 ㎍/L로 정량화.
2.4 : comet assay를 사용한 DNA 손상 분석

단세포를 전기영동과
한 가닥, 두 가닥 아가로스로 형광염색법 후에
손상된 DNA 세포 코팅된 슬라이드 손상된 DNA
위에 올려 헤드와 comet
배양시킴. tail을 만듦.

조직, 혈액,
배지로부터 살아있는
세포를 채취
2.4 : comet assay를 사용한 DNA 손상 분석

샘플에서 40㎕ 수집

Trypan blue exclusion technique에 의해 세포 생존률 결정

Olympus BX 51 형광 현미경으로 400배 확대한 대물렌즈로 분석

- 515nm~516nm의 여기필터 및 590nm의 장벽필터가 장착

손상되지 않은 세포 : 꼬리 없는 핵 모양
손상된 세포 : 혜성 꼬리 모양

Comet tail length = 최대 전체 길이 – 머리 지름

2.5 : 미소핵 분석 ( MicroNucleus Test) – 구강 상피 세포

20mL 완충액(0.1M EDTA, 0.01M Tris-HCl, 0.02M NaCl, pH7)이 담긴 샘플 병에서 세포 수집

→ 각 실험 대상자들마다 3회씩 실행

완충액에서 10분 동안 400×g 상태로 세 번 원심분리 후 세포 현탁액 50㎕는

예비가열 된 슬라이드 위에서 15분 간 건조

30분 동안 80% 차가워진 메탄올로 고정한 뒤 하루 동안 실온에서 건조 후

착색될 때까지 -20도에 저장

슬라이드는 DNA 염색인 4,6디아미노-2-페닐인롤중염산염으로 착색

→ Olympus BX 51 형광 현미경으로 관찰

이핵 세포, 핵 융해, 핵 붕괴와 broken egg와 같은 이상 검사는 Tolbert에 따라 이루어짐.

 2.6 : 미소핵 분석 ( MicroNucleus Test) – 말초혈액 림프구

0.5mL = 20% 소태아혈청 + 100U/mL 페니실린 + 100㎍/mL 스트렙토마이신이 있는 RPMI-1640 4.5mL

→ 0.2mg/mL 피토헤마글루티닌-M(PHA)를 배양균을 활성화시키기 위해 첨가

배양균들은 37도, 72시간 동안 복제 및 배양과정을 거침

→ 44시간째 사이토칼라신-B를 세포질 분열을 위해 5㎍/mL를 첨가

배양균은 72시간 후에 원심분리로 얻음

림프구는 5분간 0.075M KCl과 저장성 처리하였으며 정착액(메탄올:아세트산=3:1)에서 두 번 고정

세포 현탁액을 바른 인공적으로 냉각한 슬라이드를 10분 동안 pH 6.8, 10% 김자액으로 착색

•2000개의 이핵된 림프구는 400배 확대하여 기록됨

•1000개의 세포당 소핵 빈도와 핵 원형질 결함이 계산됨

Fenech, Morley 방법에 의해 수행

2.7 : 염색체 이상 분석

혈액 부분표본 0.8ml 는 F-10 배양액

(20% 소태아 혈청+0.5ml PHA, 5000IU/ml 페니실린+1000IU/ml 스트렙토마이신)에 배양

배양균은 48시간 동안 37도인 5% CO2 ,95% air- incubator에서 배양

유사분열중기는 0.2㎍/mL 콜히친을 얻기 3시간 전에 배양균들에게 첨가

세포들은 원심분리 후 37도에서 15분 동안 미리 예열한 저장액(0.075M KCI)으로 재부유 시키고

아세트산과 메탄올(1:3)용액에 고정시킴

염색체는 3.3% 김자액으로 염색시킨 후 광학 현미경을 사용해 1000배 확대하여 분석 및 확인

CA (염색분체, 염색체 절단, 염색분체 결실, 염색분체 고리, 이동원체, 방사형을 만드는 4개의 염색체,
무동원체 절편) 분석
2.8 : 효소 분석

• SOD, GPx, CAT, MDA의 활동은 혈청에서 분광측정적으로 측정.

• U-ALA는 Tomikuni, Ogata의 규정에 따라 분석.
• E-ALAD 활동판단은 Berlin,Schaller에 따름.

2.9 : 통계적 분석
Result Odds
Class Ratio는 실험군/대조군
Interval(급간)은 비율 의미
분포 점수들을 불연속적
실험군을 P, 대조군은 1-P
군집이나
Odds 계층으로
Ratio는 P/(1-P) 묶기 위해 사용되는
실험군이
범위이다. 대조군에 비해 몇 배인지 알 수 있다.

Table 1. 대조군과 실험군의 인구 통계학적 특성 (n=90)

Result

Table 2. 대조군과 실험군의 유전독성과 생화학변수의 그룹 간 비교

Result

Table 3. 대조군과 실험군의 연령, 흡연, 알코올, 노출에 의한 comet tail 평균 길이 (㎛)
Result

비례

Table 4. 실험군에서 end points와 독립변수에 대한 다중선형회귀분석

Result

Table 5. 대조군과 실험군에서 연령, 흡연, 알코올, 노출에 대한

구강상피세포에서의 MN 빈도 (‰)
Result

이핵 세포
핵융해
핵붕괴


Table 6. 대조군과 실험군의 구강상피세포, 림프구에서 핵형 이상 빈도 (‰)
 Result

Table 7. 대조군과 실험군에서 연령, 흡연, 알코올, 노출에 대한 림프구에서 MN 빈도 (‰)

Result

Table 8. 대조군과 실험군에서 연령, 흡연, 알코올, 노출에 대한 CA 빈도(%)

Result

염색분체 절단
염색체 절단
염색분체 고리
동원체
무동원체 절편

Table 9. 대조군과 실험군에서 CA의 다른 유형들의 빈도

Conclusion (COMET ASSAY)

• 연령과 노출에서 DNA손상은 양의 상관관계를 보였으나 연령이 더

영향을 끼침.
• COMET TAIL 길이가 실험군과 대조군에서 상당한 차이를 보임

실험군
• DNA손상이 상당히 증가하였는데 그 중 알코올 섭취자들과 5≥ and
6h/1day일한 근로자들의 comet tail길이가 더 김
• 연령과 흡연에서는 영향이 나타나지 않았음

대조군
• 연령, 흡연, 알코올 섭취는 DNA손상에 대한 영향을 미치지 않음
Conclusion(MNT in BEC’S)

대조군보다 실험군의 MN빈도가 증가함

알코올 섭취는 실험&대조군 모두에게 MN형성을 유도함

실험군에서 긴 기간 동안의 노출은 MN빈도에 상당한 영향을 끼침

하루노출량과 연령은 구강 상피세포의 MN빈도에 상당한 영향을 끼침

Conclusion(MNT in PBL)

• 연령과 노출은 림프구에서 MN빈도수에 상당한 영향을 미침

실험군

• PBL에서 MN의 빈도수는 대조군보다 높음

• 알콜섭취자는 평균MN빈도가 높음
• 5년초과, 하루여섯시간이하의 노출은 MN빈도수가 증가함
• 30명의 흡연자들은 PBL에서 MN의 증가가 보임

대조군
• 연령, 흡연, 알코올 섭취는 MN빈도수에 영향을 주지 않음
 Conclusion(CA in PBL)

CA는 30세 이상 그리고 알코올 섭취자에게서 더 높음

실험군

• 염색체 손상을 나타내는

CA (염색분체절단, 염색체절단, 염색분체 고리, 동원체, 무동원체 절편) 가 대조군보다 높음
• 납노출기간은 CA빈도수에 상당한 영향을 줌
• 흡연은 CA에 영향을 끼치지 않음
Conclusion(Pb content and enzyme assays)

혈액과 소변에서의 납 함량, U-ALA의 검사는

대조군보다 실험군에서 더 높음

E-ALAD의 활동, SOD, GPx, CAT는 대조군보다 실험군이 낮음

대조군보다 실험군에서 MDA(지질과산화)의 증가를 보임

discussion

• 근로자들은 다양한 유해인자들에 노출됨

• 금속의 유해한 영향에 대한 인식 부족
• 보호장비 착용의 이점에 대한 교육 미비

→ 납의 농도가 초기보다 더 높아짐.

• 건강 위험의 불확실성을 줄이고 노출을 최소화하는

안전 대책의 조건을 개선하기 위한 예방조치와
근로자들에 대한 모니터링이 필요
 산업보건학적 관점(납 중독의 예방대책)

< 작업환경 관리 >

납을 인체에 무해한 금속으로 대체 사용,

해당 공정을 자동화하여 근로자가 직접 납에 노출되는 기회를 줄이도록 함.

납 분진, 증기, 흄 등의 발생 억제, 확산 방지를 위해 해당기계를 밀폐하거나

발생원에서 바로 작업장 밖으로 배출되도록 국소배기 장치를 설치해야 함.

납 분진이 공기 중에 비산되는 것을 방지하기 위해 납의 분말을 체로

치거나 운반할 때는 뚜껑을 덮은 상태에서 하며, 작업장 바닥에 수시로
물을 뿌림.

사업주는 6개월에 1회 이상 작업장내의 납의 농도를 측정하여 납의 농도가

항상 허용농도 이하가 되도록 작업환경을 개선,유지해야 함.
 산업보건학적 관점(납 중독의 예방대책)

< 근로자 건강관리 >

작업을 마친 후 에어 샤워시설에서 옷에 묻는 납 분진을 완전히 제거 후

손과 얼굴을 씻거나 목욕을 해야 함.

사업장에 배치되기 전에 근로자는 건강진단을 받아야 함.

납에 노출되는 근로자는 1년에 한번 특수건강검진을 받아야 하고 이상이

있는 경우 진단의 주기는 단축될 수 있음.

사업주는 작업장에 MSDS를 게시하고 그에 대한 내용을 근로자에게

교육하여 근로자가 대처 방법을 알 수 있도록 해야 함.
 discussion

• 통계학적 전문지식을 많이 요해서 표를 분석하는데 어려움이 있었음.

• 하루 노출시간이 6시간이다. Why?

• 샘플을 왜 1주일 중 넷째 날에 수집하였다. Why?

• 네이버 (www.naver.com), 구글 (www.google.com)
• KCM(한국마더 세이프 전문 상담 센터) (http://blog.mothersafe.or.kr)
• 여성주 저널 일다(http://www.ildaro.com/sub_read.html?uid=5440&section=sc2)
• 회귀분석(상), 최병선
• 통계과학의 이해, 최종후, 교우사
• 예제를 통한 회귀분석, 김기영 외 3명, 자유아카데미
• 유투브 (www.youtube.com)
• 대한산업안전협회 (www.safety.or.kr), MSDS (www.kosha.or.kr )
• 두산백과사전(www.doopedia.co.kr), 위키백과 (http://ko.wikipedia.org/wiki)
• Fracasso, M.A., Perbellini, L., Solda, S., Talamini, G., Franceschetti, P., 2002. Lead induced
DNA strand breaks in lymphocytes of exposed workers: role of reactive oxygen species and
protein kinase C. Mutat. Res. 515, 159–169.
• Lutz, T.M., Nirel, P.M.V., Schmidt, B., 1991. Whole blood analysis by ICP-MS. In: Holland, G.,
Eaton, A.N. (Eds.), Applications of Plasma Source Mass Spectrometry. The Royal Society of
Chemistry, Cambridge, UK, pp. 96–100.
• Vaglenov, A., Carbonell, E., Marcos, R., 1998. Biomonitoring of workers exposed to lead,
genotoxic effects, its modulation by polyvitamin treatment and evaluation of the induced
radioresistance. Mutat. Res. 418, 79–92.
• Vaglenov, A., Creus, A., Laltchev, S., Petkova, V., Pavlova, S., Marcos, R., 2001. Occupational
exposure to lead and induction of genetic damage. Environ. Health Perspect. 109, 295–298.
 discussion

• 하루 노출시간이 6시간이다. Why?

• 샘플을 왜 1주일 중 넷째 날에 수집하였다. Why?