SEC :

1. Ovisno o transportnom sistemu uzorka, SEC može biti ?

Ovisno o transportnom sistemu uzorka može SEC biti:
 gelska filtracija,mobilna faza: vodena otopina
 gelska permeacija,mobilna faza: organsko otapalo

2. Osnovni princip SEC?

Osnovni princip:
 Manje molekule bivaju zarobljene u porama adsorbenta (stacionarne faze)
 Veće molekule prolaze pored poroznih čestica gela, odnosno pora gela
 Brzina protoka kroz kolonu za velike molekule je veća, odnosno vrijeme zadržavanja je kraće
 Za male molekule brzina protoka je manja, odnosno vrijeme zadržavanja je duže.

3. Razlika između gelske filtracije i gelske permeacije?

Gelska filtracija: kao mobilnu fazu koristi vodeno otapalo; gelskom filtracijom se vrsi
frakcioniranje proteina i drugih u vodi topivih polimera; gelska filtaracija za frakcioniranje
koristi porozne čestice za razdvajanje više komponenti na sonovu veličine molekula; molekule
manje od pora ući će unutar pora i prema tome preći će duži put,odnosno imaće duže vrijeme
prolaska nego veće molekule koje ne mogu ući u pore čestica.
Gelska permeacija: kao mobilnu fazu koristi organsko otapalo.
Analiza distribucije molekulskih masa u organskim otapalima topivih polimera

4. Nedostatak SEC pri određivanju molekulske mase?

Što su analiti bliže po veličini veća je vjerovatnoća da će biti u istoj frakciji i neće se detektovati
odvojeno.

5. Šta je elucijski volumen i kako se ponaša?

Elucijski volumen je volumen potreban da bi se tekućina ispirala od vrha do dna stupca i
karakteristika ponašanja molekule u nosaču gela. Elucijski volumen (Ve) linearno opada sa
logaritmom molekularnog hidrodinamskog volumena.

6. Primjer komercijalno dostupne kolone

Tipična kolona je promjera 7.5–8mm za analitičke kolone i 22–25mm za (semi)preparativne
kolone; obično su dužine 25, 30, 50, i 60 cm
Pakovanje je zasnovano na poroznom silika ili semirigid organsom gelu (visoko umrežen), u
većini slučajeva to su kopolimeri stirena i divinilbenzena.
Primjer je Superdex 200 ili Superdex 200 prep grade – posebno pogodan za separaciju
monoklonskih antitijela iz dimera ili od kontaminanata niže molekulske mase.
 7. Šta je apsolutna SEC?

To je tehnika koja predstavlja spregnuti sistem Dynamic Light Scattering (DLS) i SEC za
određivanje apsolutne veličine proteina i makromolekula.Apsolutna veličina - nije potrebna
kalibracija kako bi se dobila hidrodinamička veličina (izražena kao hidrodinamički diametar DH
[nm]).Veličine makromolekula mjere se kako iz SEC sistema eluiraju u protočnu ćeliju DLS
instrumenta.Prema Mark-Houwink-ovoj kalkulaciji iz hidrodinamske veličine može se izvesti
molekulska masa.

8. Prednosti SEC u odnosu na druge metode

Prednosti:
 Za razliku od ionoizmjenjivačke ili afinitetne hromatografije analit se ne vezuje za medij
tako da pufer nema uticaja na rezultat
 Pogodna za biomolekule osjetljive na promjene pH, koncentracije metalnih iona, uslova
sredine i sl.
 Uslovi se mogu prilagođavati tipu uzorka ali i zahtjevima daljih postupaka.
 Može se prijeniti nakon bilo koje hromatografske metode.

Mapiranje proteina:
1. MALDI-MS, skraćenica i ukratko objasniti.

MALDI-MS (engl. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization)

Ukratko:
 Direktne MALDI-MS analize koriste se pri analizi pojedinačnih proteina.
 Kod kompleksnijih smjesa prvo se izvede separacija nekom od tečnih hromatografija a
zatim MALDI-MS analizi.
 Vizualizacija masenom spektroskopijom
 Najčešće se koristi za tkivne sekcije
 Prednost MALDI-MS je mjerenje distribucije većeg broja analita odjednom bez
uništavanja uzorka.
 Značajna primjena u istraživanjima karcinoma, distribucije lijekova i neuronauke.

2. 8 koraka za određivanje AK sekvence

1. razdvajanje polipeptidnih lanaca

2. cijepanje disulfidnih mostova
3. utvrđivanje aminokiselinskog sastava svakog polipeptidnog lanca
4. identifikacija N- i C-terminalnih krajeva
5. fragmentiranja polipeptidnog lanca i određivanja aminokiselinskog sastava svakog fragmenta
6. ponavljanja koraka 5. korišćenjem druge procedure za sečenje polipeptidnog lanca. Ovim
postupkom se dobija preklopljena aminokiselinska sekvenca.
7. rekonstrukcije aminokiselinske sekvence cijelog polipeptida
8. određivanje pozicije disulfidnih mostova između dva cisteina
 9. Kidanje disulfidnih mostova (ne trebaju strukture)

Kidanje disulfidnih mostova se vrši:

 Oksidacijom permravljom kiselinom pri čemu nastaju dva ekvivalentna cisteinske

kiseline.
 Redukcijom disulfidnih mostova 2-merkaptoetanolom.

 Nakon redukcije se dodaju jodoacetat ili 3-bromopropilamin, da ne bi došlo do

rekombinacije S-S veza. Jodoacetat i 3-bromopropilamin modifikuju SH grupe koje više
ne mogu da grade disulfidne veze.

10. Edmanova degradacija (šta je, koji se reagens koristi, analizator)

Analizom N- i C-terminalnih krajeva određujemo koliko je peptidnih lanaca prisutno (jedan N- i

C-kraj znači da je prisutan samo jedan peptidni lanac). N-terminalni kraj se
identifikuje Edmanovom degradacijom. Ovom metodom se određuje aminokiselinska sekvenca,
tako što se odvaja po jedna aminokiselina sa N-kraja i identifikuje.
Edmanov reagens (fenilizoticijanat, PITC) u slabo baznom rastvoru, reaguje sa slobodnim
aminokiselinskim ostatkom na N-kraju i nastaje feniltiokarbamil derivat (PTC-protein).
Dodatkom trifluroacetatne kiseline formira se tiazolinonski derivat koji se odvaja od peptidnog
niza (peptidni niz je sada kraći za jednu aminokiselinu). Kada se doda slaba kiselina ovaj derivat
postaje PTH (feniltiohidantoin) koji se identifikuje hromatografski. Za identifikaciju HPLC-om,
snimi se hromatogram svih standardnih aminokiselina sa kojima se porede aminokiseline
dobijene Edmanovom degradacijom. Pri Edmanovoj degradaciji C-terminalni kraj se obično veže
za nerastvoran nosač.
Instrument koji se koristi je Edmanov sekvenator (engl. Edman sequenator).
Edmanova degradacija:
 Sukcesivno otcijepljuje po jedna aminokiselina sa N kraja
 Moguće je odrediti više od 20 aminokiselina
 Metoda može biti automatizovana
 Dovoljno je 10-10 g uzorka.

11. Identifikacija C terminalnih AK

C-terminalni kraj se identifikuje korištenjem karboksipeptidaze, koja cijepa peptidne veze između
dvije aminokiseline počevši od C-terminusa. Karboksipeptidaza A (iz goveđeg pankreasa)
hidrolizira sve peptidne veze osim prolina, arginina i lizina. Karboksipeptidaza B (iz svinjskog
pankreasa) hidrolizuje samo arginin i lizin, kada su na C-kraju, dok su karboksipeptidaze C i Y
efikasne za sve aminokiseline.

12. Proteinske baze podataka- šta su

Proteinska banka podataka, (eng. Protein Data Bank – PDB), je kolekcija 3D podataka o strukturi
velikih bioloških molekula, kao što su proteini i nukleinske kiseline.
Tehnike:
1. Kolone za tečni hromatogram
Kolone(nose oznaku po vrsti stacionarne faze):
C18, C8, C4, NH2, Ph-NH2, CN, Grafitna, SiO2, Gel propusna

2. Detektori u tečnoj hromatografiji

Detektori koji se koriste u LC
 UV/Vis - od jedne do četiri talasne dužine ili multidiodni (DAD, PDA),
 Fluorescentni
 Indeks refrakcije (RI)
 Elektrohemijski
 Amperometrijski
 Maseni spektrometar (MS)

3. Šta određuje položaj hromatografskog pika, a što površina ispod pika?

Položaj hromatografskog pika na vremenskoj osi može služiti za identifikaciju analita.

Površina ispod pika omogućava izračunavanje količine svakog pojedinog sastojka.

4. Vrste MS na osnovu načina snimanja

Način snimanja spektara:
a) Kontinuirani spektar masa prikazuje stvarnu spektrometrijsku širinu masenog vrha.
b) Centroidni spektar masa, mase masenih vrhova prikazuje kao stupce, bez stvarne širine.
Pogodan je za rutinske analize.

5. Uloga interfejsa u sistemu LC MS

6. Način jonizacije u spregnutom sistemu LC MS

 ESI (engl. Electrospray ionization)

Najzastupljeniji način ionizacije koji je komaptibilan sa svim analizatorima.
 APCI (engl. Atmospheric Pressure Chemical Ionization) - hemijska ionizacija
 PB (engl. Particle Beam)
 CFFAB (engl. Continuous Flow Fast Atom Bombardment)

7. Vrste analizatora LC MS (jonski izvor i načinrazdvajanja)

 8. Karakteristike tipičnog proteinskog spectra masa dobijenog sa ESI/MS?
Zbog svoje blage ionizacije ESI je prikladan za proučavanje nekovalentnih veza protein-ligand,
protein-ligand-inhibitor ili protein-protein interakcija.

9. Kada se primjenjuje tandemska LC MS/MS i koji su tipovi?

LC-MS/MS predstavlja dodatnu mogućnost analize iona u vremenu i prostoru s ciljem da se unaprijedi
separacija ili izazove dodatna fragmentacija.Spektrometre masa s analizatorom MS/MS možemo
podijeliti u tri skupine:
a. spektrometri masa s jednim analizatorom kod kojih je moguća teoretski analiza do MS
(FTMS ili zamka za ione)
b. Spektrometri masa sa više analizatora (trostruki kvadripol QQQ) - analiza moguća do MS
c. Spektrometri masa s dva analizatora (hibridni spektrometri masa Q-TOF) - analiza
moguća do MS

Karakterizacija proteina:
1. Tipovi/vrste kapilarne elektroforeze u QC

a. CE SDS sa UV ili LIF (laser inducirana fluorescenca) detekcijom – veličina

heterogenosti proteinskog produkta
b. CIEF - naboj heterogenosti proteinskog produkta
c. CZE sa LIF ili MS detekcijom- za anlizu glikoproteinskih kompleksa

2. Značaj CE-SDS u odnosu na običnu SDS

CE-SDS se primjenjuje kao zamjena za SDS-PAGE u QC za određivanje molekulske mase

proteina, evaluiranja heterogenosti, čistoće i konzistentnosti biofarmaceutika.
CE-SDS za razliku od SDS-PAGE nudi direktnu UV ili fluorescentnu detekciju, automatizaciju,
poboljšanu rezoluciju, reproducibilnost, tačnu kvantifikaciju proteina i određivanje molekulske
mase.

3. CIEF- značaj i funkcije, primjena

CIEF (detekcija na koloni i detekcija slikom)

Visoko reproducibilna i brza metoda izbora biofarmaceutskih kompanija.CIEF se izvodi na
komercijalnom CE uređaju sa UV detekcijom na koloni.Proteinske zone u kapilarama detektuju
se pomoću hemijskih, elektroforetskih i hidrodinamskih strategija mobilnosti.

4. CZE-najznačajnija primjena
Kapilarana zonska elektroforeza (CZE) je odličan alat za profiliranje glikozilacija.
Ispitivanje:
1. Najvažniji faktori koji imaju ulogu u imunogenosti.
Najvažniji faktor koji ima ulogu u imunogenosti je prisustvo agregata.

2. Definicija agregata i kako se razlikuju

Agregati predstavljaju sklopove protenskih molekula drukčije od željenih. Mogu se razlikovati po

veličini, morfologiji, tipu intermolekulskih veza i reverzibilnosti.

3. Veličina agregata, kad i kako nastaje (slajd uzroci agregacije)

Uzroci agregacije proteina:

 Agregati prisutni u proteinskim proizvodima mogu varirati od malih (dimeri) do velikih
sklopova (slabo vidljive i vidljive čestice).
 Mogu nastati u procesu proizvodnje, skladištenja, transporta ili isporuke.
 Temperatura, fluktuacija, svjetlost, treskanje, pH podešavanja i sl. može inducirati
agregaciju proteina u bilo kojoj fazi.
 Agregacija se može javiti zbog izloženosti zrak-tečnost ili tečnost-čvrsta supstanca
međudjelovanja u toku mješanja, punjenja, transporta, rekonstituisanja liofiliziranih
proizvoda ili u kontaktu sa hromatografskim kolonama, pumpama, cijevima, filterima i
sl., takođe kontakt sa ledom u toku zamrzavanja može dovest do nastanka agregata.
 Agregacija takođe može biti inducirana stranim česticama, npr. nerđajući čelik i drugi
djelovi iz pumpe za punjenje, kristali soli, čestice stakla nastale u toku grijanja kontenera
za depirogenaciju, kapljica silikonskog ulja iz silikonskih šprica.
 Agregacija moće biti inducirana hemijskom degradacijom/modifikacijom (npr.
Oksidacija).

4. Izazov u analizi proteinskih agregata

Izazov u analizi proteinskih agregata je u nepoznatoj prirodi nastalih agregata kao i širok raspon
veličina od nekoliko nm do nekoliko mm diametra.
Obzirom da nijedna poznata tehnika ne pokriva ovoliki raspon veličina, neophodno je
kombinovati nekoliko metoda od kojih svaka ima svoje prednosti i nedostatke kao i razlike u
fizičko-hemijskim principima na kojima se zasniva kao i dobivenim rezultatima.

5. Nabrojati neke od metoda za detekciju i karakterizaciju vidljivih cestica (sve 4 grupe)

Vizualni pregled, Optička mikroskopija, Zamračenje svjetlosti,Protočno snimanje,Florescentna
mikroskopija,Brojač čestica zasnovan na el.,Provodljivosti,Laserska
difrakcija,DLS,MALLS,Turbidimetrija, nefelometrija.
 6. Vizuelni pregled

Metoda: Vizualni pregled

Princip: Vizualizacija (manuelna ili automatska)
Procjena: Procjena jasnoće, opalescencije, zamućenosti, prisustvo vidljivih čestica
Veličina : >50μm
Prednost: jednostavno izvođenje i podaci o veličini i obliku čestica
Nedostatci: Niska rezolucija, probabilistička priroda, subjektivnost, skupa oprema.

7. Zamračenje svjetlosti

Metoda: Zamračenje svjetlosti

Princip: Čestice blokiraju svjetlost
Procjena: Koncentracija i veličina mikronskih čestica
Veličina : 2-100 μm
Prednost: brzo izvođenje i brojanje i grupisanje čestica
Nedostatci: veliki volumen uzorka, nema podataka o morfologiji, mogu nedostajati prozirne
čestice, osjetljiva na kontaminaciju.

8. Koje su metode za analizu subvidljivih čestica upisane u EurPh

US i EU Pharmacipoea su harmonizirane i u osnovi opisuju dvije metode: zamračenje svjetlosti i
mikroskopija, a zajedno sa kriterijima za prihvaćanje koji definiraju maks. broj sub-vidljivih čestica
dopuštenih po pakovanju, ili po mL za velike volumene injektibilnih otopina.

9. AUC (prednosti, princip i nedostaci)

AUC se zasniva na brzini sedimentacije

Karakterizacija načina sedimentacije makromolekula i prisustva agregata u otopini.
Prednost AUC je u tome da terapeutski proteini mogu biti analizirani bez manipulacija
formulacijskim puferom uzorka (izuzev u nekim rijetkim slučajevima).
Nedostatci: niska reproducibilnost, teška kvanitifikacija agregata

10. Šta su ECM metode?

ECM (Extended Caracterization Methods)

Metode komplementarne QC metodama.Primjenjuju se u toku razvoja proizvoda da bi se
obezbijedila fizičko-hemijska karakterizacija proteina-terapeutika.Iako EC metode moraju biti
savremene ne moraju biti validirane u skladu sa ICH (International Council on Harmonisation of
Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) vodičem.
Konformacija i dinamika:
1. Studije izazvane degradacije-šta su?

Forsed Degradation Studies (FSD) Studije izazvane degradacije

Statičke analize
Analiza uzorka pod stresom u datoj vremenskoj tačci ( npr. Uzorak je 4 sedmice na temperaturi
od 40°C).
Dinamičke analize
Analiza uzorka pri različitim vremenskim tačkama da bi se pratila kinetika degradacije.

2. Osobine koje se ispituju u FDS

Atributi kvaliteta koji se ispituju u FDS:
a. Primarna struktura
b. Varijacije u veličini (agregati, nečistoće, fragmenti)
c. Varijacije naboja
d. Oligosaharidni profil
e. Glikacija
f. PEGilacija
g. Oksidacija
h. Potencijal

3. Uslovi stresnih stanja

Uslovi stresnih stanja i agensi:

• Povišena temperatura
• Zamrzavanje
• Niska ili visoka pH
• Stanja oksidacija (hemijski agensi poput H2O2)
• Svjetlost
• Agitacija
• Adicija metala
• Izlaganje UV svjetlosti
•
4. Koje metode se koriste za određivanje viših nivoa stukture

NMR i X ray kristalografija.

5. Nedostaci X-ray kristalografije

X-ray kristalografija zahtijeva da protein bude u kristaliziranom obliku prije analize što čini
nemogućim izvođenje direktne analize konformacije proteinskog produkta pod relevantnim
uvjetima proizvodnje/skladištenja ili pod fiziološkim uvjetima.
 6. Koje metode se koriste (tabela)

Iz dijela koji je predavala profesorica Aida:

1. Kalibracija pH-metra

2. Priprema pufera
3. Metode i granice osjetljivosti metoda za određivanje ukupne koncentracije proteina
4. Jednačina za određivanje koncentracije proteina u uzorku u kome se nalaze proteini i
nukleinske kiseline ( Cprot(mg/mI)=1.55*0.076*(A280 nm –A260nm)
5. Odnos DNA, A260/A280 = 1.8
6. Faktor selektivnosti, grafici, gdje je moguće razdvajanje, gdje ima/nema nečistoća, efekat
učinkovitosti (veća učinkovitostvisok i tanak pik) (prezentacija o HPLC I FPLC)