Metode de fixare si fixatori utilizati in microscopia optica syarea este etapa decisiva In obtinerea unui preparat microscopic permanent. Este un tek id procesele vitale celuiare, pastrandu-se cu ite cat mal :himic prin care sunt opri proces fzic sau c 1, raporturile spatiale si moleculare. alterari minim Prin fixare urmarim cfm 1. a 2 sri de constituenti celulari a antierii optice a structurilor celulare ms rlorin scopul de a facilita trecerea lor prin celelalte etape ale tehnicl ai ales pentru sectionare Clasificara fixatortior: 2, Dupa natura lor: 1. fizici 2. chimici b. Dupe reactia pe care o au cu proteinele solubile: 1. coagulanti 2. necogulanti Fixatorii chimici simpli: acetona , acid tricloracetic , formol , acid osmic, alcool metilic 1 2, _amestecuri fixatoare: introduse in practica datorita afinitatii inegale pentru diversele elemente structurale Mecanismul fixarii: 1, _insolubilizarea prin precipitare a unor constituenti celulari: proteine , glucide , saruri minerale, lipide 2. formarea de compusi de aditie intre fixator si unii constituenti celulari 3. coagularea proteinelor Calitatile unui bun fixator: 1. patrunde bine in tesuturi 2. stabilizeaza tesuturile pastrand nealterate caracterul si distributia constituentilor celulari 3. nu provoaca artefacte 4. nu deformeaza tesutul 5. nudizolva constituenti 6. distruge microorganismele 7. extrage enzimele autolitice inactivate 8. confera consistenta 9. produce diferentiere optica 10. nu-si modifica compozitia 11, ieftin, netoxic, neinflamabil, neiritant 42. Incluzia si masele de incluziune in microscopia optica incluziunea este procedeul prin care se realizeaza conditil optime care sa permita talerea pieselor in sectiunisubtir de ordinul um, transparente si cu fete plane astelincat sa poataf examinate la microscop. ‘Mase de incluziune : Ey I de realizar luderii: a. Penetreaza celula b. Ramane in spatiul intercelular 2. Dupa solubilitatea in apa: a. anhidre: parafina , celoidina , paraplastul b. _apoase: gelatina , polietilenglicol Incluziunea la parafina etape premergatoare: a Incepand cu 50° fiecare in 3 bai successive; * _clarificare —indepartarea alcoolului din piesa cu ajutorul unor reactivi numiticlarifcatori miseibil cu parafina, care fac.ca piesa sa devina translucida. Se efectueaza cu alcool anilc sau cu hidrocarburi benzenice (xileni); * impregnarea-patrundere a piesei cu parafina topita si soldificarea in bloc prin racire pentru a oferi o consistenta omogena; = © turnarea blocurilor — blocul inglobat se monteaza pe un port-obiect. 3. Criteriile unuei bune fixari in microsopia electronic 4, Puterea de rezolutie a microscopului optic Microscopul optic este un dispozitiv cu ajutorul cdruia se pot examina structuri cu dimensiuni mult sub puterea tie a ochiului uman. Performantele microscopului optic sunt puterea de marire si puterea de rezolutie. Puterea de rezolutie: * de eadepinde aaa * depinde de lentila obiectivul * FORMULA LUI ABBE : d=h/n sina = lungimea de unda a radiatiei electromagnetice ( 0,55 pm)indicele de refractie al mediului dintre preparat siobiectiv ‘a= ¥ din apertura unghiulara a obiectivulul ‘Limitarile puterii de rezolutie a microscopului optic in practica 4 este o constanta naturala ce nu poate fi influentata (0,55) ‘mediul dintre preparat si obiectiv este de obicei aer (n = 1) In obiectiut eu imersie— intr obiectiv si preparat se interpune o picatura de lchd cu un Indice de refractie supraunitar, cum este uleiul de cedru (n=1,51) ‘apertura unghiulara maxima teoretica este 180 deci 5. Etapele de obtinere a preparatului microscopic permanen: microscopia optica LFSC 1. Recoltare: operatia prin care obiectul de examinat este prelevat de la omul sau animatul viv (bioptica) sau dupa sacrificarea animalului sau de la cadavru (necroptica) Condit . SMR ecient sects Pentrua evita procesele de autoliza, ¢ dimensiunea pieselor sa nu depaseasca 5 mm_ 5 cabeientnperter- bine ascutite pentru a evita zdrentuirea si pierderea paralelismului dintre planuri . ea ates tpl organ; Se vor evita modificarile de volum, forma si relief 2. Fixare: etapa decisiva in obtinerea unui preparat microscopic permanent; un proces fiic sau chimic prin care sunt oprite cat mai rapid procesele vitale celulare, pastrandu-se cu alterari minime volumul , forma , relieful si raporturile spatiale si molecular. 3. Tratamente postfixare: decalcifierea, disocierea pieselor, mordansarea 4. Spalare S. Includere: procedeul prin care se realizeaza conditii optime care sa permita taierea pieselor in sectiuni subtiri de ordinul jim , transparente si cu fete plane astfel incat sa poata fi examinate la microscop. Sectionare: mecanismul prin care piesa inclusa sau inghetata se taie in felii subtiri de ordinul micronilor cu ajutorul unui aparat numit microtom. 7, Colorare sau impregnare: prin acest proces se urmareste cresterea contrastului intre prin modificarea indicilor de refractie ai substratului morfologic cu ajutorul colorantilor; tehnica de colorare depinde de natura fixatorului si de tesutul pe care se aplica. y Ca $7: Stveaideare cm ache ceelale groke (celeb oke Ur, cakes ok £6 Montare: pentru sie tee I vale de eventualele deteriorari, conservarea 76) coloratiei si nt necesar examinarit hy) sau anhidre (balsam microscopice; mediile de Boe pot fi ict) 9 Cae: pre ofc 9. Etichetare: pe fiecare lama se noteaza tipul cellular, sursa de recoltare, fixatorul, metoda dele if |, microscopic permanent in microscopia - 6. Etal electronica 1, Recoltare 2. Fixare 3. Deshidratare 4, Clarificare 5, Impregnare 6. Incluzie 7. Sectionare 8. Diferentierea structurilor prin contrastare 9, Montare pe grila 7. Principiul si rolul fixarii in obtinerea preparatului microsco) ermanent Mecanismul fixarit: 4. _insolubilzarea prin preciptare a unor consttuenti celular proteine, glucide, saruri mineral, | lipide 2, sess Prin fixare urmarirh = 1, Conservarea tesuturilor 2. Prevenirea pierderii de constituent celulari 3. Cresterea diferentierii optice a structurilor celulare 4, Marirea consistentei tesuturilor in scopul de a facilita trecerea lor prin celelalte etape ale tehnicii intre fixator si unii constituenti celulari jai ales pentru sectionare 8. Principiul imunofluorescent: Imunofluorescenta se refera la punerea in evidenta a diferitilor antigeni cu ajutorul unor anticorpi specifici marcati cu un compus fluorescent IZOTIOCIANAT DE FLUORESCEINA (FITC), ‘Aceasta este de 2 tipuri: directa (Ag + Ac specific marcat) si indirecta (Ag + Ac specific + Ac ‘sec. marcat; are sensibilitate mai mare; se foloseste in cazul in care antigenele se gasesc in cantitate mica in tesut).. 1. Izolarea antigenul de cercetat fluores ‘Anticorp marcat fluorescent a 4 tigen —— a hs ent9, Principul de functionare al microscopulul cu contrast de faza Lumina care trece prin medii cu indici de refractie diferi ‘mieroscopul cu contrast de faza transforma aceste diferente in 10. Clasificarea colorantilor Dupa natura lor: Natural : vegetall : hematoxilina safranina, orceina , turnesolul -animali: carminul Ba f oe Sintetici: albastru de metil, comic » vocid Yricric »fuvius Dupa caracterele chimice: ‘Real Sunt de oblee| sarin de acl organie!, gruparea auxocrom& principal find incircats electric hnegatly (se atayeazd pe un substrat morfologic incarcat electric pozitiv), Bazie: rupetea/aliyocramys principal incfrcatd electric portly, deci se va atasa pe un substat ‘incarcat negativ. Newt: grupari auxocrome principale incircate electric poctv si negati, find solti apoase de coloranti bazici si acizi intr-o anumita proportie. {@hookid de cowie Y 11. Coloratia hemalaun ~ eozina Implica 2 coloranti: * hemalaunut - colorant bazic * eozina - colorant acid REZULTATE - nuclei —albastru violet - citoplasma~roz rosu 12. Principiile colorarii Substratul molecular la nivelul cdrora se fixeaza colorantii prin legaturi electrochimice si de hidrogen este reprezentat de proteine. In functie de tipul gruparilor ionizabile din structurs , proteinele sunt 1. acide 2. bazice 3. neutre Colorant bazic - substrat (=proteina) acid (ex: hemalaunul) Nucleul - caracter bazofil: albastru-inchis / violet Colorant acid - substrat bazic (ex: eozina) Citoplasma - caracter acidofil: roz/rogua is a MTEL - 13. Coloratia topografica: definitie, exemple, rezultate / COLORATIA HEMALAUN EOZINA * hemalaunul - colorant bazic * eozina - colorant acid REZULTATE - nuclei - albastru - violet = citoplasma -.roz- rosu a COLORATIA HEMALAUN - EOZINA CU ALBASTRU DE METIL Paogoorvs re Coo wil whats * hemalaun © eozina * albastru de metil REZULTATE - Nuclei - violet - Citoplasma - albastru - cenusiu - Fibrele de colagen - albastru intens = sllexonaties Whicrsts) — quale pallog es us COLORATIA VAN GIESON: © hematoxilina ferica © acidul picric © fuxina acid’ REZULTATE Nuclei - negri = Citoplasma - galben - Fibre de colagen - rosu intens COLORATIA MASSON. ~ C.(erumauentor * hematoxilin’ ferica * solugia colorant’ A ce contine fuxina acidé ® _solutia colorant B ce contine albastru de anilin’ REZULTATE - Nuclei - negru Citoplasma - rosu - violet deschis ~ Fibrele de colagen - albastru intens COLORATIA MALLORY * fuxind acida * _albastru Mallory ( contine albastru de anilina si orange G ) REZULTATE ~ _Nuclei- rosu intens ~ Citoplasma - rosie > Fibre de colagen si reticulin’ - albastru ~ Jesut muscular neted - violet > Tesut muscular striat - rosu - portocaliu/SOLORATIA AZAN * azocarmin C ‘ albastru Heidenhein , cu anilina si orange G REZULTATE. = Nuclei - rosu ~ viu Citoplasma - rosu Fibre de colagen si reticulina - albastru deschis, Tesut muscular striat ~ rosu , orange sau galben 14. Coloratiile citologica: definitie, exemple, rezultate Coloratille citologice sunt utilizate pentru evidentierea anumitor organite celulare ! METODA CAJAL DA FANO. - evidentierea complexului Golgi REZULTATE - Nuclei - necolorati - Aparatul Golgi - retea perinuclear de culoare neagra - Citoplasma - aurie UMETODA HEMATOXILINA FERICA REGAUD. - evidentierea mitocondrillor REZULTATE - Nucleu - necolorat - Nucleol ~ negru ~ Mitocondrii -puncte negre 45. Tehnici de evidentiere la microscopul optic pentru fibrele conjunctive v1. Fibrele de reticulins (+. ~ se examineazé folosind o metoda electiva - IMPREGNAREA ARGENTICA ~ _apar colorate in negru 2, Fibrele elastice = se poate utiliza coloratia cu © Rezorcin fuxina - albastre © Orceina - cafeniu - roscate 3, Tesutul conjunctiv - coloratia cu albastru de toluidina = granulatiile din mastocite prin coloratie metacromatica in rosu - violet 16. Metode de evidentiere a organitelor celulare la microscopul coloratiile citologice -17. Impregnarea argentica: principiu, rezultate rua. aucl aor hie - evidentierea interstitiului dintre celulele epiteliului din seroase = limitele intercelulare apar net in culoarea neagr’ = auld ofoir ds eriuhd atol( conics du wLudsorao oi 48. Tehnici de evidentiere la microscopul optic pentru organitele anne neuronale - pentru evidentierea tesutului nervos = metoda Niss - impregnare argenticd - evidentierea tecii de mielina prin fixare cu tetraoxid de osmiv 19. Metode de evidentiere a miofibrilelor la microscopul optic METODA HEIDENHEIN (cu hematoxilina ferica) evidentiaza structura periodica a miofibrilelor se remarcé alternanta de zone clare si intunecate. 20. Evidentierea la microscopul optic a limitelor intercelulare - _prinimpregnare argentica - evidentierea interstitiului dintre celulele epiteliului din seroase -_ limitele intercelulare apar net in culoarea neagr 21. Evidentierea la microscopul optic a acizilor nucleici - prin fluorescenta secundara - dup marcare cu compusi fluorescenti : ‘© Acridin orange ~ ADN-verde/ ARN-rosu © Quinacrina - cromozomi = bandare 22. Tehnica de evidentiere la microscopul optic pentru glicoproteine Metoda PAS ( per-iodic acid Schiff): evidentierea glicogenului, GAG, glicoproteinelor si Blicolipidelor ; grupari glicol, prin oxidare cu acid per —iodic, se transforma in grupari aldehidice care dau cu reactivul Schiff un precipitat rosu violaceu vizibil la M.O. (Metoda PAS - GLICOGEN specificitatea metodei depinde de pretratamentul cu enzime glicogenolitice de tipul amilazei salivare Se considera cd structurile colorate PAS care dispar in urma pretratamentului cu amilazé contin glicogen) Metoda cu carmin amolacal BEST: evidentiazé glicogenul, polimer cu solubilitate redusd in p4, Daca fixarea lui nu este prompt, enzimele hidrolitice fl descompun in glucozé care este foarte solubild in apa si difuzeaza (granule rosii fn citoplasma) Bazofilia: proprietatea substantelor glucidice de a se colora cu colorant bazici de tipu! albastru alcian $1 albastru de metil; poate fi utilizat’ si pentru evidentierea lipidelor si proteinelor cu caracter acidMetacromazia: Copactaten unulsubstrat de 2 se olorant-o al culoare decay éolorantuul existenta unor gruparanionice aflate lao distant foarte mic} una ge aga co"? agregate cu proprietati de absorbyfe a luminii vizibile diferite de a moleculelo, ferric 23. Metacromazia ‘Metacromazia: Capacitatea unui substrat de a se colora intr-o alt culoare decat colorantului (existenta unor gruparianionice aflate la o distant§ foarte micd una de ai Ee cd ian ‘agregate cu proprietati de absorbtie a lumi labile diferte de a moleculelor neagregate) 24, Tehnica de fixare a frotiului sangv! se realizeazé intinderea celulelor in monostrat pe o lamelé de sticls Pot fi examinat 1. recoltare 2. intindere: se folosesc doua lame de sticla © ° 3.uscare 25. Coloratia panoptica May — Grunwald — Giemsa METODA PANOPTICA PAPPENHEIM pentru colorarea frotiului sangvin. Solutia May-Grunwald ~ contine EOZINAT DE ALBASTRU DE METILEN solubilizat in amestec de alcool metilic si glicerina neutra 2, solutia Giemsa —contine EOZINAT DE AZUR DE METILEN solubilizat in amestec de alcool metilic siglicerina neutra Frotiul trebuie sa fie : subtire cu un singur strat de celule intins uniform ambele margini pe lama f, . fesuturi sau organe parenchimat k Cea pe care se efectueazé frotiul le Cu care se intinde frotiul , prin glisare la un unghi de 45° © se termina in franjuri pe lama, ocupand cca, 2/3 din aceasta la margine se scrie numele pacientului sau un nr. de ordine REZULTATE nuclei—violet Branulatii: * citoplasmele agranulocitelor ~albastru citoplasmele granulocitelor ~ roz neutrofile~ rosu- violet bazofile —albastru inchis spre negru eozinofile ~ rosu —portocaliuia electronica 27. Citometria in flux Chteometria influx permite analiza si separarea celulelor pe bazs unorcaractere morfologce sibiochimice, Ofera informati somogenitatea Interns citoplasmatica) relativa masurarea Spaces celulei identificarea si separarea populatilor de celule sanguine (granulocite, monocite, limfocite) masurarea cantitatii d in celula 4, mésurarea cantitatii intracelulare de Ca 5. masurarea Membrana nuclear: ultrastructura, complexul por nuclear - _prezent doar in interfazs membranele nucleare interna si E2 eieineaceaty x a ua cu poste prezenta pe suprafata ribozomi atasati - _ structurd de bistrat fosfolipidic - _ enzime atasate: - _ambele membrane au dimensiuni sub limita de rezolutie a MO $i pot fi observat E membrana interné vine in raport cu o structruré fibrilara - lamina densa interna rf tl de auiouse 6 paw. ecogashtss ys pated, |, usech. jucleard: —7| polimeri de laminine ° ° blarea si dezasamblarea invelisului nuclear 7 I 1 perinucl - _membranele se.unesc la nivelul COMPLEXULU! POR, alcatuit din: © 8 subuni u | © _inelcitoplasmatic cu prelungiri fibrilare subtiri ° ic cu fibrile lungi, unite distal de inelul distal : ° sndomembrat : zona electronodensa, neregulaté, cu structura fibrilogranularé = 3 componente distincte: contine (2 zona granular’ contine 1030. Specializari membranare de pol apical 31. Ciclul secretor celular © intracelular ( ex: lizozomii) x: proteinele de export) ~ _ studiat pentru prima data de profesorul George Emil Palade, folosind autoradiografia, edininistiares inpetfuzle @ unor aminoaciz|tritiai, urmérindu-se localizarearadionctviti iferite intervale de timp: i ladi © dup 3 min,, emisia radioactiva era localizatd perinuclear (Re). © dupa 20 min. radioactivitatea era maxim’ th zona ap. Golgi, © ar dupa 90 min. - la polul apical al celulei_ 32. Reticul endoplasmatic: aspect si evidentiere la M.O. aspect electrono microscopic = enzima marker: Sikes ~ _ prin prezenta endomembranei are loc marirea suprafetei la nivelul cireia se desfisoard procesele metabolice are loc crearea unor micracompartimente cu particularitate enzimatica (identificarea Particularitatilor functionale prin determinarea enzimelor structurale specifice) 33.Mitocondria: aspect si evidentiere la M.O., aspect electrono microscopic METODA HEMATOXILINA FERICA REGAUD - evidentierea mitocondrillor la M.O. REZULTATE © Nucleu - necolorat © Nucleol - negru © Mitocondrii -puncte negre organit delimitat de endomembrane cu rol in producerea energiei structura tipica caracteristicile celulel in care flax, Prsserel SH frebulere cise Weastplaiakece abyDevenale oy oly y pe oF oso 34, Lizozomul: aspect electrono microscopic <— Fo paper.’ —) wey ous * Wap rentusl<). . 5 organit delimitat de endomembrana aspect electrono dens la M.E. COX: Cochaserta forma sferica eget 35. Peroxizomul: aspect electrono microscopic opus Ys om tae Ld cabal / bol implicati in digestia proteica complexe proteice 265, alcatuite, la mamifere, din: © subunitate de 20S - componenta majora a proteolizei © subunitate 19 $—rol adjuvant formatiuni cilindrice alcétuite din 3 discuri suprapuse 15nm inatime si 11 nm diametru structural - aprox. 28 subu organizata le active sunt situate la interior. distinete, ce formeaza o structur’cilindrics riguros