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Conceptos básicos
Diseño de
Instrumentos
Aplicaciones
Consejos y
Sugerencias
Verificación
del rendimiento
Espectrofotometría UV/VIS
Fundamentos y Aplicaciones
1. Introducción 3
Contenido
2. Espectroscopía UV / VIS 4
2.1 ¿Qué es la espectroscopia UV / VIS? 4
2.2 Principio de medición 6
2.3 Transmitancia y absorbancia 7
2.4 Ley de Lambert-Beer 9
5. Aplicaciones 21
5.1 Longitud de onda fija 21
5.2 Determinación de la concentración mediante la cuantificación 22
5.3 Barrido 25
5.4 Cinética 27
5.5 Aplicaciones en química biológica 32
Durante muchos años METTLER TOLEDO ha proporcionado soluciones con instrumentos innovadores para la
caracterización de muestras (por ejemplo, valores térmicos, pH, conductividad, índice de refracción, densidad),
así como para la determinación del contenido por valoración. Con la introducción de una nueva técnica analítica
y las posibilidades de los instrumentos de METTLER TOLEDO, el nuevo espectrofotómetro UV / VIS Excellence apo-
yará, adicionalmente, el flujo de trabajo del cliente con sus rápidos y confiables resultados. Esta guía proporciona
al lector los conocimientos fundamentales sobre esta técnica, así como consejos y sugerencias de aplicación
para obtener resultados exactos y precisos en el uso diario.
La espectroscopia óptica se basa en la interacción de la luz con la materia. La siguiente figura ilustra lo que
sucede cuando la luz brilla sobre un objeto:
e
ja
rd
ro
ve
z
Lu
z
Lu
Superficie roja Superficie verde
Figura 1 y 2: La luz que no es absorbida por el objeto se refleja y puede ser vista por el ojo
Ambos objetos son iluminados por la luz visible o blanca, que está representado por un arco iris: los diferentes
colores representan los diferentes componentes de la luz visible. Cuando los rayos de luz están brillando sobre un
objeto, ellos pueden ser absorbidos por el objeto - en particular, uno o más componentes de la luz (es decir,
sus colores) son específicamente absorbidos.
Los colores que no son absorbidas por los objetos se reflejan. En nuestro ejemplo, la luz roja se refleja en la piel roja
del tomate (Fig. 1), mientras que la luz verde se refleja en la piel verde del calabacín (Fig. 2). Todos los otros colores
son absorbidos por los dos objetos. La luz reflejada entonces es vista por los ojos: tomate es visto en rojo mientras el
calabacín en color verde.
En términos físicos, la luz es un tipo de energía se propaga en el espacio a una velocidad muy alta. Más específica-
mente, la luz se entiende como una onda electromagnética que viaja en el espacio - es energía radiante. La energía
de la luz oscila periódicamente entre un mínimo y un máximo en función del tiempo - como una onda. La distancia
entre dos máximos o dos mínimos, respectivamente, de la onda electromagnética se define como la longitud de
onda, dada en nanómetros (nm).
Aumento de energía
Longitud de onda
Figura 3: La energía de una onda electromagnética aumenta al disminuir la longitud de onda y viceversa
Figura 4: El espectro visible (390 - 780 nm) representa sólo una pequeña parte de todo el espectro electromagnético
Tenga en cuenta que la energía de las ondas electromagnéticas se relaciona con sus longitudes de onda; a más
corta la longitud de onda, mayor es la energía. Por ejemplo, la luz violeta tiene una longitud de onda más corta
que la luz roja y, por tanto, un mayor nivel de energía, mientras que la luz infrarroja tiene menos energía que la luz
visible debido a su mayor longitud de onda.
Figura 5: La luz que pasa a través de una solución de muestra es parcialmente absorbida por los componentes
La espectroscopía es una técnica de medición en el que el registro de los espectros de absorción de las diferentes
muestras utilizando luz visible (VIS) y ultravioleta (UV) se obtiene mediante un espectrofotómetro, es decir, un ins-
trumento capaz de medir el espectro de una muestra en el rango UV/VIS.
Un espectrofotómetro UV/VIS mide la intensidad de la luz que pasa a través de una solución de muestra en una
cubeta, y la compara con la intensidad de la luz antes de que pase a través de la muestra. Los principales
componentes de un espectrofotómetro UV/VIS son una fuente de luz, un soporte de muestras, un dispositivo de
dispersión para separar las diferentes longitudes de onda de la luz (por ejemplo, un monocromador), y un
detector adecuado.
Determinación de la muestra:
1. Una muestra es disuelta en el solvente y añadida a la cubeta.
2. Un haz de luz emitido por la fuente de luz pasa a través de la cubeta con la muestra.
3. Al pasar por la cubeta, la luz es parcialmente absorbida por las moléculas de la muestra en la solución.
4. La luz transmitida es luego medida por el detector.
5. El cambio de intensidad de luz en diferentes longitudes de onda es calculado dividiendo la intensidad
transmitida de la muestra por los valores correspondientes del blanco. Esta relación se almacena
finalmente por un registrador.
El detector en un espectrofotómetro UV / VIS mide la intensidad de la luz después de pasar por la solución de
muestra. Esta fracción de luz recogida por el detector es llamada la intensidad transmitida, I. La intensidad
de la luz transmitida es atenuada por la solución de muestra debido a, por ejemplo, la absorción de la luz
a específicas longitudes de onda. Por lo tanto, su valor es inferior a la intensidad original I0 de la fuente de luz.
I
T=
I0
Figura 8: Transmitancia es la relación entre la intensidad transmitida I y la intensidad original I0
La transmitancia es el principal valor determinado por espectroscopia UV/VIS, pero no es el único. De hecho, la
absorbancia A representa un resultado adicional ampliamente utilizado durante el registro de espectros UV/VIS.
Se define como el logaritmo negativo de la transmitancia y tiene una gran ventaja, que veremos en el próximo
capítulo.
A = −log(T)
Figura 9: La absorbancia es el logaritmo negativo del valor de la transmitancia
Tenga en cuenta que la absorbancia A no tiene ninguna unidad de medida. En otras palabras, es un valor
adimensional. Sin embargo, a menudo se representa mediante la letra “A” o como UA para unidades de
absorbancia. Por ejemplo, 0,3 A o 0,3 unidades de absorbancia, respectivamente.
100.0
90.0
80.0
70.0
Transmitancia
60.0
50.0
40.0
30.0
10.0
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100
Figura 10: Espectro de transmitancia de solución de holmio como una función de la longitud de onda.
El espectro de transmitancia de una muestra es registrado como una función de la longitud de onda. En este
ejemplo en particular, la muestra absorbe la luz en principalmente cuatro diferentes longitudes de onda, es
decir, a aprox. 370, 450, 480 y 540 nm. La absorción de la luz está marcada por una fuerte disminución de la
transmitancia en estas longitudes de onda
En la siguiente figura, el espectro de absorbancia de la misma muestra es dado como una función de la longi-
tud de onda. Note que los picos de absorción se encuentran en las mismas longitudes de onda. En este caso,
el grado de absorción de la luz se indica mediante los valores de absorbancia más altos.
0.8
Absorbancia
0.6
0.4
0.2
0.0
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100
Longitud de onda (nm)
Figura 11: Espectro de absorbancia de una solución de holmio como función de la longitud de onda.
En general, un espectro UV / VIS se representa gráficamente como la absorbancia como una función de longitud
de onda. La ventaja de esta representación es obvia; la altura de los picos de absorción es directamente propor-
cional a la concentración de la especie.
Al pasar por una cubeta transparente llena de solución de la muestra, la intensidad de la luz se atenúa propor-
cionalmente con la concentración de la muestra. En otras palabras, una solución de muestra más concentrada
va a absorber más luz. Además, la atenuación es también proporcional a la longitud de la cubeta; una cubeta
más larga conducirá a una mayor absorción de la luz.
Figura 12: la atenuación de la intensidad de luz es proporcional a la concentración de la muestra así como de la longitud de la cubeta.
Ambos factores se pueden resumir mediante la expresión de la absorbancia A como una función de la con-
centración y de la longitud de la cubeta. En particular, la absorbancia A es igual al producto del coeficiente de
extinción ε, la concentración c y el recorrido del camino d :
La ley de Lambert-Beer permite la determinación de la concentración de la muestra a partir del valor absorban-
cia medida. Si se conocen el coeficiente de extinción ε y la longitud del camino d, a continuación, la concentra-
ción de c puede calcularse a partir de absorbancia A como se indica a continuación:
Figura 13: No linealidad: Los valores medidos en rojo fuera del rango lineal se desvían de la línea de calibración teórica verde.
La resolución del instrumento, la relación señal-ruido y la interferencia luz difusa son las principales
contribuciones que pueden limitar la linealidad del instrumento. Por otra parte, las limitaciones se
pueden derivar de la propia muestra como sigue:
• Los espectros UV/VIS permiten identificar los componentes presentes en la solución de la muestra. Más
precisamente, la posición y en cierta medida el perfil de los picos de absorción permiten a los compuestos
específicos a ser identificados. Por ejemplo, los compuestos orgánicos pueden ser identificados por sus
espectros, o la pureza disolvente puede verificarse fácilmente mediante espectroscopía de UV/VIS.
• Los picos de absorción pueden usarse para cuantificar la muestra investigada. Por ejemplo, la concen-
tración de la muestra puede calcularse a partir del valor de la absorbancia del pico:
c5 > c4 > c3 > c2 > c1
c = concentración
1.0
c5
c4
0.5 c3
A
c2
c1
0.0 λ/nm
Figura 14: Una mayor concentración conduce a un mayor valor de la absorbancia.
En el análisis cualitativo, la espectroscopia UV / VIS se puede utilizar como una herramienta para identificar si el
analito es puro y no se sometió a descomposición. Por ejemplo, esta técnica se utiliza para el control de calidad
de la materia prima entrante, y para el control de pureza de los compuestos biológicamente relevantes tales
como los ácidos nucleicos, ADN y ARN. Además, el punto de fusión del ADN se puede determinar mediante el
registro de su espectro UV/VIS a diferentes temperaturas. Finalmente, por medio de UV / VIS, es posible diferen-
ciar entre ácidos grasos saturados e insaturados presentes en el aceite de oliva, y de esta forma, monitorear su
calidad.
El análisis cualitativo se basa en la especificidad de la espectroscopía UV/VIS. De hecho, las muestras absorben
la luz de una o más longitudes de onda distintas, con valores de absorbancia máximos específicos. Por esta
razón, cada muestra tiene un espectro UV/VIS característico y único que se puede utilizar para su identificación.
En particular, esto se logra mediante la comparación del espectro de la muestra con espectros de compuestos
puros conocidos. Como un ejemplo del espectro UV/VIS, se muestra a continuación el espectro de la clorofila.
Esta molécula, responsable del color verde de las hojas y la hierba, característicamente tiene bandas de absor-
ción fuertes en las regiones del violeta, azul y rojo de su espectro UV/VIS.
Molécula
de Clorofila
CHLOROPHYLL MeasureSample1
Absorbancia
Molécula de Caroteno
Figura 16: Espectro UV/VIS del beta caroteno –un compuesto presente en zanahorias
Por último, los espectros UV/VIS de tres compuestos diferentes se dan en la siguiente figura. Todos ellos tienen
un espectro característico debido a que en estas moléculas todos tienen una estructura química diferente. Esto
permite la identificación de las muestras mediante espectroscopía UV / VIS.
Figura 17: Cada muestra tiene un espectro específico UV/VIS. Esta relación única permite la caracterización de la muestra. En este caso, los
compuestos malvidina, clorofila a y clorofila b pueden ser fácilmente reconocidos por sus espectros individuales.
Figura 18: La atenuación del rayo de luz permite la determinación de la concentración de la muestra.
La relación lineal entre la absorbancia y la concentración de una muestra abre la puerta para una variedad de
análisis cuantitativo. En la siguiente tabla, se dan tres aplicaciones principales de la ley de Lambert-Beer:
Figura 19: La etapa de calibración y la lista de estándar para determinar la recta de calibración se indican en la pantalla del instrumento.
Una recta de calibración se obtuvo representando gráficamente los valores de absorbancia en función de
la concentración. Por último, una regresión lineal de los valores medidos da la recta de calibración:
Absorbancia
concentración (mg/L)
Figura 20: Los valores de absorbancia de las soluciones estándar son determinados. Una regresión lineal de los puntos de datos da la
línea de calibración.
concentración (mg/L)
Figura 21: Determinación de la Concentración: La absorbancia de una solución de muestra desconocida se mide y se compara con la recta
de calibración para determinar su concentración.
1. Una fuente de luz adecuada que cubre el espectro UV/VIS de intereses. En general, se utiliza una lám-
para que contiene un gas tal como xenón, o una combinación de dos lámparas diferentes, tales como de
tungsteno / deuterio.
2. Es necesario un soporte de muestra adecuado para sostener la muestra.
– Las muestras líquidas se colocan en cubetas, que pueden ser de cuarzo, vidrio de borosilicato o
plástico acrílico. Sin embargo, el vidrio y plástico acrílico no transmiten la luz UV y sólo deben usarse
para mediciones en el rango de la luz visible
– Las muestras sólidas se pueden montar en un soporte adecuado para ser posicionado en el trayecto
óptico del espectrofotómetro para la medición de la luz transmitida.
3. Es necesario un elemento de dispersión para distribuir la luz en longitudes de onda separadas.
Puede ser un prisma de cuarzo o una rejilla de difracción, es decir, un componente óptico con
una estructura periódica capaz de difractar la luz.
4. Por último, la intensidad de la luz transmitida es registrada por un detector adecuado, tal como fotomulti-
plicador, una matriz multicanal (por ejemplo, una matriz de fotodiodos, o PDA), o un dispositivo acoplado
de carga (CCD), de manera similar a una cámara digital. Ambos detectores PDA y CCD utilizan un material
semiconductor fotosensibles para convertir la luz en una señal electrónica que luego es registrada por el
instrumento.
Los espectrofotómetros UV/VIS pueden ser clasificados de acuerdo a la geometría de los componentes de la
construcción del sistema óptico para el registro de espectros. Las dos configuraciones siguientes son utilizadas
generalmente en la espectroscopia UV/VIS:
• Espectrofotómetro de barrido
• Espectrofotómetro de matriz
Rejilla de salida
Lámpara de descarga
de Xenón Cubeta
CPU
Sensor CCD
Terminal tacto-sensible
Figura 22: Espectrofotómetro de barrido: Los rayos de luz de longitudes de onda específicas son dirigidos a la cubeta.
Tenga en cuenta que los espectrofotómetros de barrido toman algún tiempo para una exploración de espectro
completo, porque la rejilla tiene que ser rotada mecánicamente por un motor. El proceso de exploración también
puede conducir a la disminución de la precisión y de la reproducibilidad en la selección de longitud de onda,
dependiendo de la velocidad de exploración del espectrofotómetro.
Rejilla de entrada
Cubeta
Figura 23: Espectrofotómetro de Matriz: Luz de todo el rango espectral es dirigida sobre la cubeta de muestra.
Este diseño también es conocido como “óptica inversa”; sólo después de pasar a través de la muestra de la
luz es difractada por la rejilla. Posteriormente, la luz difractada de varias longitudes de onda se dirige sobre el
detector. El detector, con su larga gama de material semiconductores fotosensibles, permite la medición simultá-
nea de todas las longitudes de onda del haz de luz transmitida. Con esta configuración, la medición de la
totalidad espectro UV/VIS es generalmente más rápida que usando un espectrofotómetro de barrido convencio-
nal ya que el espectro se registra simultáneamente en todas las longitudes de onda. Por otra parte, un detector
de matriz tiene una función integradora que acumula mediciones individuales para mejorar la señal, lo que lleva
a un aumento de la fuerza de relación señal a ruido, y por lo tanto, a una mejor calidad de señal del espectro
medido. Los espectrofotómetros de matriz presentan un enfoque innovador para acelerar la exploración del
espectro completo basado en tecnología de óptica inversa. El diseño robusto sin partes ópticas móviles asegura
un rendimiento óptico muy bueno.
– Simultánea en el tiempo :
El haz de luz de la lámpara se divide en dos haces de intensidades iguales. Cada haz pasa a través
de una cubeta diferente; la cubeta de referencia, que se llena con único solvente, mientras que
la segunda cubeta contiene la solución de muestra. Las intensidades de ambos haces se miden
simultáneamente por dos detectores.
– Alternada en el tiempo:
Cette Esta configuración se consigue mediante el direccionamiento de la trayectoria de la luz con
1.
un divisor óptico (DO), que es un espejo sección giratoria. La luz se dirige alternativamente a través
de una muestra y una celda de referencia. Un único detector mide dos haces de luz, uno tras otro.
1.
2.
DO
Figura 25: Vía óptica de doble haz: 1. simultánea en el tiempo, y 2. alternada en el tiempo con un divisor óptica (DO).
2.
DO
18 METTLER TOLEDO GmbH, Analytical UV/VIS Fundamentos y Aplicaciones
4.2 Espectroscopía UV/VIS basada en cubeta
Mettler-Toledo desarrolló un espectrofotómetro de matriz de haz simple que permite realizar mediciones rápidas
y precisas en el rango UV/VIS. La fuente de luz consiste en una lámpara de destellos de xenón para el ultra-
violeta (UV), así como para las regiones de longitud de onda del visible (VIS) y el infrarrojo cercano cubriendo
rango espectral de 190 hasta 1100 nm. Los destellos de la lámpara se centran en una fibra de vidrio que con-
duce el rayo de luz a una cubeta que contiene la muestra de la solución. El haz pasa a través de la muestra y
las longitudes de onda específicas son absorbidas por los componentes de la muestra.
Reejo
Emparrillado
Haz de luz
policromático
Haz de luz
dispersado CPU
Rendija de
entrada Sensor
CCD
Terminal
Lámpara Xenon Lentes
de descarga
Cubeta
conteniendo
la muestra
La luz remanente se recoge después de la cubeta por una fibra de vidrio y es conducida a un espectrógrafo.
El espectrógrafo consiste en una rejilla de difracción que separa la luz en las diferentes longitudes de onda, y un
sensor CCD para registrar los espectros, respectivamente. Todo el espectro es entonces simultáneamente medido,
lo que permite un registro rápido.
Mettler-Toledo ofrece un espectrofotómetro capaz de realizar medición UV/VIS en micro-volumen. Este instrumento
es capaz de medir volúmenes muy pequeños y muestras altamente concentradas. El método es bastante senci-
llo. La muestra se pipetea directamente sobre la plataforma de medición, sin dilución adicional. Por lo tanto, se
evitan los errores de manipulación. Por otra parte, la selección de una longitud de trayectoria específica permite
la medición sobre un gran rango de concentración con tan poco como 1 µL de muestra. Las mediciones se
llevan a cabo en la plataforma de micro-volumen cubierta por un brazo móvil montado en la parte superior del
instrumento. Posee tanto una plataforma de micro-volumen, así como un soporte de cubeta.
Espejo
Ajuste de la distancia
de muestreo
MAN o AUTO
Muestra
(gota) Reejo
Emparrillado
Fibra de vidrio
Haz de luz
policromático
Haz de luz
dispersado
Rendija de
entrada Sensor
CCD CPU
Obturador Lentes
Terminal
Lámpara Xenon Separador
Cubeta
de descarga
conteniendo
la muestra
Cuando el brazo está en posición abierta, a la plataforma de micro-volumen se puede acceder fácilmente del
lado izquierdo o derecho con una pipeta. La tapa curvada en la parte superior del instrumento permite la coloca-
ción conveniente de la mano del operador para guiar con seguridad la punta de la pipeta. Durante la medición,
el brazo está bloqueado de forma segura a una longitud de trayectoria definida con precisión y no se puede abrir
hasta que se complete la medición.
Forma de gota
aprox. 1 – 5 µL
La medición de longitud de onda fija (FW, por sus siglas en inglés) fija es la aplicación más simple de un
espectrofotómetro. Es una medida de longitud de onda única o múltiple y, como para todos los demás tipos
de medición, el resultado puede ser reportado en absorbancia o transmitancia. Cálculos posteriores pueden
realizarse para obtener el resultado final, por ejemplo, una concentración de una sustancia.
Los estándares de aceite de oliva del Comité Oleícola Internacional (COI) especifica exactamente el umbral de
medición que tiene que cumplir para los aceites con el fin de ser calificado como virgen extra, virgen, y así
sucesivamente. La calidad del aceite se determina observando el comportamiento absorbancia de una solución
al 1% en isopropanol entre 200 y 400 nm. Los niveles elevados de absorbancia en el rango espectral de 200 a
400 nm indican aceite oxidado (peor calidad). La absorbancia a K232 nm, K270 nm y ΔK se correlaciona con
el estado de oxidación mediante la detección de compuestos oxidados específicos y también detectar posible
adulteración con aceites refinados. En la siguiente figura podemos ver el espectro ultravioleta del Aceite de Oliva
Extra Virgen de buena calidad que no muestran picos, en comparación con los picos evidentes de un aceite de
oliva la calidad pobre, presentada como muestra de aceite de oliva 4 y 5.
Extra virgin
Virgin
Absorbancia
Valores bajos correlacionan con aceite de alta calidad, la absorbancia UV detecta estados tempranos y tardíos
de la oxidación. Esto se puede observar según la siguiente tabla, que está regulada según las normas CEE
(Comunidad Económica Europea, el Consejo de las Comunidades Europeas):
K232 K270 ΔK
Extra virgen ≤2.5 ≤0.22 ≤0.01
Virgen ≤2.6 ≤0.25 ≤0.01
El primer paso en un análisis cuantitativo es seleccionar una longitud de onda adecuada. La longitud de onda se
elige normalmente en un máximo de pico, es decir, en el pico de la banda de absorción, debido a que el cambio
en la absorbancia para un cambio dado de concentración es máximo, lo que lleva a una mayor sensibilidad y
precisión en las mediciones. El efecto relativo de otras sustancias o impurezas es, pues, más pequeño. Además,
la velocidad de cambio de absorbancia con la longitud de onda es más pequeña, y la medición no es tan seve-
ramente afectada por los pequeños errores en el ajuste de longitud de onda.
Una muestra de una concentración desconocida puede ser determinada utilizando la curva de calibración..
La espectroscopia UV/VIS ha sido utilizada efectivamente en la ciencia médica para el análisis de rutina de
muestras de sangre y orina. Las diferencias espectrales entre la sangre saludable y de enfermos se pueden
comparar fácilmente. La cuantificación de la hemoglobina en sangre ha sido un parámetro de diagnóstico clave
para diversas enfermedades tales como anemia, policitemia y la deshidratación. La hemoglobina está com-
puesta de cuatro cadenas peptídicas y cada una lleva un grupo hemo. Es transportada por los glóbulos rojos
de la sangre y lleva el oxígeno desde los pulmones a los tejidos periféricos para mantener la viabilidad de las
células.
Absorbancia
400 nm
Con el fin de comprobar el contenido total de hemoglobina en la sangre, el plasma es removido de la sangre
anticoagulada y los eritrocitos se suspenden en solución isotónica de sodio. La eritrosis se realiza antes para
que la absorbancia se pueda medir a una longitud de onda de 400 nm. La hemoglobina también se controla en
muestras de orina.
1.4
1.2
1.0
Absorbancia
0.8
0.6
0.4
0.2 ppm
0.2
0.4 ppm
0.6 ppm
0.0
0.8 ppm
1.0 ppm
−0.2
880 nm
concentración (ppm)
Figura 34: Valores de absorbancia a 880 nm versus la concentración de cada solución estándar que conduce a la curva de calibración.
La concentración desconocida de fosfato en la muestra puede determinarse a partir de la curva de regresión lineal.
En contraste con la medición de longitud de onda fija, las mediciones espectrales de barrido determinan la ab-
sorbancia o transmitancia de una muestra en un rango de longitud de onda específico o en el rango del espectro
completo, típicamente de 190 a 1100 nm. Luego de la medición del barrido, el análisis que más a menudo se
aplica es la detección de picos y valles en el espectro. Un pico es donde la absorbancia alcanza un máximo y
un valle es donde la absorbancia es lo menor entre dos picos. La altura y la ubicación de los picos y valles es de
interés ya que dan una indicación de la composición de la muestra y de la pureza. Por ejemplo, por la ubicación
de los picos y la combinación de picos, puede deducirse si el compuesto está saturado o insaturado. Además,
la identificación de un compuesto puede ser asegurado por comparación de su espectro con el espectro de un
compuesto conocido a partir de una base de datos. El barrido de métodos UV/VIS se pueden utilizar para la
caracterización de compuestos aromáticos y olefinas aromáticas.
= 260 nm
Absorbancia
Figura 35: Espectro de NAD+ que muestra el máximo de absorbancia a 260 nm y la absorbancia resultante de aproximadamente uno.
Figura 36: Barrido espectral de protector solar. Formulación A (azul) con mayor absorbancia de luz UV comparada con la formulación B
(verde) en el rango de 280 nm hasta 350 nm.
La primera formulación, visualizada en azul, absorbe la mayor parte de la radiación UV entre 280 y 350 nm, lo
que indicaría que esta formulación de filtro solar sería una fuerte protector. En contraste, la segunda, represen-
tada en verde en el espectro, absorbe sólo alrededor del 60% de la radiación entre 280 y 350 nm. La formula-
ción final de protección solar puede medirse directamente utilizando dos placas de vidrio transparente UV entre
las cuales se extiende una capa delgada del producto. Las placas de vidrio apretadas se colocan en un soporte
de muestra sólida en el compartimento de la muestra antes de la medición del espectro.
Absorbancia
Figura 37: El espectro de 3 mg / 100 ml cianocobalamina es presentado. Tres máximos de absorción a 278,5 nm, 361,5 nm y 550,9 nm
pueden ser observados.
5.4 Cinética
NAD+
NADH
Absorbancia
Los hidratos de carbono pueden ser determinados por una reacción enzimática en un enfoque de cinética. Para
el análisis enzimático de glucosa, se utilizan típicamente dos enzimas del proceso de glucólisis. La glucólisis
es la degradación de la glucosa y un proceso importante en todos los seres vivos. La primera etapa de la glu-
cólisis es la fosforilación de la glucosa por la enzima hexoquinasa, donde el ATP es usado y convertido en ADP.
Hexokinasa
Glucose + ATP Glucose-6-phosphate + ADP
G6PDH
G6P + NAD+ 6-Phosphogluconate + NADH
Esta detección indirecta enzimática de la glucosa puede aplicarse igualmente para la detección de ATP.
Ambas sustancias se pueden determinar a través de esta reacción acoplada de la hexoquinasa y
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.
La fosfatasa alcalina cataliza la hidrólisis de ρ-nitrofenil fosfato (pNPP) a p-nitrofenol. Cuando la enzima fos-
fatasa alcalina reacciona con pNPP, se producen el fosfato inorgánico y ρ-nitrofenol. pNPP es incoloro, pero
ρ-nitrofenol tiene una fuerte absorbancia a 405 nm, presentando un color amarillo estable en solución alcalina.
En el máximo de absorción, la concentración de sustrato [S] y la velocidad [v] se pueden medir. La velocidad
de formación de ρ-nitrofenol se mide como un aumento en la absorbancia a 405 nm, que es proporcional a la
actividad de la enzima en la muestra.
El procedimiento es estandarizado bajo las condiciones especificadas por el coeficiente de extinción molar de
ρ-nitrofenol 18,75 mol / (L*cm) a 405 nm. Los resultados se basan en el cambio en la absorbancia por unidad
de tiempo. La Unidad Internacional UI / L se define como la cantidad de enzima que cataliza la transformación
de un micromol de sustrato por minuto bajo las condiciones especificadas.
Esta aplicación se utiliza principalmente en el diagnóstico médico. La fosfatasa alcalina se encuentra en altas
concentraciones en el hígado, en el epitelio de la vía biliar y en los huesos. Los niveles normales son depen-
dientes de la edad y el incremento durante el desarrollo de los huesos. Aumento de los niveles en comparación
con los niveles normales se asocian principalmente con el hígado y enfermedad ósea. Muestras típicas son
plasma heparinizado y suero, que está libre de hemólisis..
El objetivo de este estudio es determinar el orden de reacción de la oxidación del yoduro de peróxido de hidrógeno
en solución ácida. El curso de la reacción se controla a través de la formación de tri-yoduro (I3−):
4.50
4.00
3.50
3.00
Absorbancia
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
Figura 39: Valores de absorbancia a una longitud de onda fija de 353 nm como una función del tiempo para el aumento de concentraciones de peróxi-
do de: luz azul = 0,004 M, azul oscuro = 0,006 M, verde = 0,008 M y naranja = 0,01 M de peróxido.
Mediciones similares tienen que ser realizadas variando la cantidad de los otros dos reactivos, el yoduro y el
ácido. Los órdenes de reacción pueden ser determinados a partir de la medición de las velocidades de reacción
iniciales. Si la velocidad de reacción es proporcional a la concentración de la sustancia reaccionante, un gráfico
de la tasa inicial (V0) como una función de la concentración será lineal.
600
Vox10-9
400
200
0
1.000 2.000
Volumen
Peroxidedevolume
peróxido
800
600
Vox10-9
400
200
0
10.00 20.00
Volumen
Iodidede loduro
volume
800
600
Vox10-9
400
200
0
0.00 20.00 20.00 60.00
Volumen de ácido
Acid volume
Figura 40: Velocidades iniciales como una función del volumen de reactivo para los tres reactivos; peróxido (parte superior), yoduro (medio)
e iones hidronio para diversas concentraciones de ácido (inferior).
A partir de estas observaciones, la relación experimental entre la velocidad de reacción inicial y las concentra-
ciones de reactivos (concentración se expresa con los corchetes) se puede definir como sigue:
Esto también puede ser escrito en una forma química cinética más común:
La ley de velocidad en este caso consta de dos términos: El primer término es de primer orden con respecto
al peróxido de hidrógeno y la concentración de yoduro, mientras que es de orden cero con respecto a la
concentración de ácido y es por lo tanto de segundo orden general. El segundo término es de primer orden con
respecto a la concentración de todos los reactivos y por tanto es de tercer orden general. Por último, la ley de
velocidad indica que el ácido actúa como un catalizador en la oxidación de yoduro por peróxido de hidrógeno.
Sabiendo esta ley de velocidad, la correcta descripción ley de velocidad se puede aplicar para adaptarse a las
mediciones y determinar las constantes de velocidad de la reacción.
DNA
protein
Absorbancia
Figura 41: Espectro de absorción de ADN (azul) a 260 nm y la proteína BSA (verde) a 280 nm
Por lo tanto, se espera para los ácidos nucleicos tener una absorbancia mayor a 260 nm que a 280 nm, las
proteínas, por otra parte, muestran el comportamiento opuesto. Se espera para las muestras de ácido nucleico
puro tener una relación de 2,0, mientras que las proteínas tienen una relación de 0,57 respectivamente. Las
mezclas que contienen proteínas y ácidos nucleicos diferirán de estas relaciones. Teóricamente, la relación
260 / 280 de una solución que contiene proteínas y ácidos nucleicos se puede calcular de la siguiente manera:
La fórmula Crhristina Warburg se utiliza para muestras que contienen ambos, proteínas y ácidos nucleicos. En
el siguiente ejemplo, la cantidad total de concentración de ácido nucleico se determina restando la concentra-
ción de la interferencia de proteína:
Las constantes de 62.9 y 36.0 refieren a coeficientes de extinción específicas utilizadas por Warburg y
Christian. Para una mayor precisión, los factores deben ser determinados para la particular proteína afectando
el análisis.
Tryptophan
Tyrosine
Absorbancia
La composición química de la proteína afectará la absorción, el número, así como el tipo de aminoácidos cau-
sarán variación.
Si el coeficiente de extinción para la proteína de interés está disponible, la absorbancia de la solución de pro-
teína se puede medir directamente usando una medición de longitud de onda fija en la absorbcia a 280 nm.
Las ventajas de esta técnica son que no se requieren reactivos especiales, por lo tanto, la proteína no es mo-
dificada o inactivada durante el proceso. No se requiere período de incubación, por lo que las mediciones son
rápidas y altamente reproducibles, haciendo de esta una técnica muy simple.
La relación A260 / A280 se puede utilizar como una guía para la pureza de la muestra de proteína.
dsDNA
RNA
ssDNA
Absorbancia
Figura 43: Hipercromicidad para diferentes ácidos nucleicos; dsDNA en azul, ssDNA en naranja y el ARN en verde.
Los ácidos nucleicos pueden ser determinadas por moléculas colorantes que se unen específicamente a la mo-
lécula de interés antes de la determinación, por ejemplo, la unión a dsDNA, pero no a ssDNA. Como ejemplo,
la cuantificación de ADN de doble cadena se puede realizar utilizando el tinte fluorescente PicoGreen. PicoGreen
detecta casi exclusivamente dsDNA.
La preparación de la muestra es muy simple; la solución de tinte PicoGreen se añade a la muestra y después
de un tiempo de espera de 5 minutos la muestra marcada se puede leer.
El reactivo de Bradford en sí mismo, conteniendo el colorante en una solución ácida, es marrón y cambia
a color azul cuando se une a una proteína.
El siguiente capítulo le proporcionará consejos y sugerencias desde el punto de vista aplicativo para asegurar
mediciones UV/VIS exactas y precisas.
Junto al rendimiento del instrumento que se discutirá en el capítulo 7, las mayores fuentes de error en espectro-
fotometría están relacionadas con el manejo de la muestra. El espectro de absorción de una sustancia puede
estar influenciado por el disolvente, el pH de la solución, la temperatura, las concentraciones altas de electro-
litos, y la presencia de sustancias interferentes. Los efectos de estas variables deben ser conocidas y las con-
diciones para el análisis elegidas de modo que la absorción no se verá afectada por pequeñas variaciones, no
controlados en sus magnitudes. Los efectos más importantes se describen en los siguientes párrafos.
La cubeta utilizada para medir una muestra es una parte del sistema óptico del espectrofotómetro. Por lo tanto,
la posición y la geometría de la cubeta pueden tener una influencia en la exactitud y precisión de las medicio-
nes de absorbancia y deben ser cuidadosamente controladas
Para las mejores prácticas de medición, la cubeta debe permanecer en el soporte entre las mediciones. Si es
removida, se debe tener cuidado para posicionar siempre la cubeta en la misma dirección en el soporte, es de-
cir, con la etiqueta hacia la fuente de luz. Esto asegura que los efectos ópticos son idénticos para la referencia y
para las mediciones de muestras.
Además, para obtener mejores resultados, las mediciones de referencia y de muestra se debe hacer utilizando
el mismo tipo de cubeta. Las cubetas deben tener ventanas fabricadas a partir de un material que es transpa-
rente en la región espectral de interés. Para obtener los mejores resultados de las mediciones en el rango UV,
vidrio transparente a UV necesita ser utilizado, tal como vidrio de cuarzo o vidrio Suprasil. Cubetas desechables,
hechas de poli-metil-metacrilato, absorben en el rango UV y actúan como un filtro de corte, haciendo medicio-
nes en el rango UV inexactas y sólo deben ser consideradas para mediciones en el rango visible.
En los sistemas ópticos, tales como espectroscopia de UV/VIS, la limpieza de las cubetas tiene un efecto impor-
tante sobre los resultados. Las ventanas de la cubeta, a través de la cual pasa la luz, tienen que ser limpiadas
antes de cada uso con tejidos sin pelusa (para evitar arañazos de pelusa en la superficie). Absorbancias su-
periores son medidas si los residuos, tales como marcas de dedos o grasa, se depositan en las ventanas de
las cubetas debido a que hay componentes adicionales que absorben. Esto se puede evitar con una limpieza a
fondo antes y después de su uso. Cuidado adicional se debe tomar para evitar tocar las ventanas después que
la limpieza se haya completado.
Por último, las partículas que flotan en la celda harán desviar el haz de luz y conducir a una absorbancia de
fondo. Esta desviación de la luz también se conoce como dispersión de la luz.
Un disolvente para espectroscopia UV/VIS debe ser transparente en toda la región aplicada y debería disolver
una cantidad suficiente de la muestra para dar picos bien definidos. Cada disolvente tiene una longitud de
onda de corte en absorbancia UV/VIS, que es la longitud de onda por debajo del cual el propio disolvente ab-
sorbe toda la luz. Así que cuando se elige un disolvente, es importante ser consciente de su absorbancia de
corte, así como de dónde se espera que absorba el compuesto bajo investigación. Si están cerca, un disolvente
diferente debería ser elegido.
Se debe tener cuidado cuando se trabaja por debajo de 300 nm donde la absorción del disolvente puede ser
tan alta que la absorción incremental debido a la muestra es pequeña en comparación con absorción total. La
siguiente tabla muestra los disolventes comunes y el límite inferior de su rango de longitudes de onda útiles.
En general, los disolventes no polares y las moléculas no polares tienen el menor efecto el uno sobre el otro.
Sin embargo, las moléculas polares exhiben diferencias bastante drásticas cuando interactúan con un disol-
vente polar tal como agua, alcoholes, ésteres y cetonas. Interacción entre soluto y disolvente conduce a la
ampliación de banda de absorción y a una consecuente reducción en la resolución estructural y máximo coefi-
ciente de extinción. Ellos tienden a destruir las estructuras de vibración y por lo tanto deben evitarse cuando el
detalle espectral es deseado. La siguiente figura ilustra el efecto de iso-octano y etanol en el espectro de fenol.
Al cambiar de un disolvente no polar (iso-octano) a uno polar (etanol), la estructura fina debido a las vibracio-
nes de fenol se atenúan. En general, los espectros registrados en disolventes no polares están más cerca de
los obtenidos a partir de muestras de gas.
Absorbancia
Longitud de onda
Figura 46: Espectro de fenol en iso-octano y etanol. Disolventes polares tales como etanol muestran una resolución espectral mucho menor.
Para obtener resultados óptimos de medición y para cumplir con la Ley de Lambert-Beer, la absorción se deter-
minará en el rango lineal del instrumento. Por lo tanto, es mejor evitar muy altos (> 2,5 UA) y muy bajos valores
de absorbancia (<0,3 UA) que pueden conducir a la no linealidad.
Sin embargo, a diferencia de otras técnicas de análisis, muestras con concentraciones bajas, tales como
0,01 mol / L, pueden ser medidas mediante UV/VIS. Un ejemplo común de esto se ve en la analítica del agua
donde concentraciones muy bajas necesitan ser determinados.
Cuando un analito interactúa (asociación, disociación) o reacciona con el disolvente, nuevas especies químicas
son creadas conduciendo a un cambio de comportamiento de absorción. Por tanto, se recomienda utilizar un
disolvente que no interactúe y una baja concentración de analito para evitar cualquier reacción secundaria.
A fin de obtener la máxima sensibilidad, las mediciones de absorbancia espectrofotométrica se realizan a una
longitud de onda correspondiente a un pico de absorción. La importancia de medir la absorbancia de forma pre-
cisa en la longitud de onda situada en lambda max se demuestra en la figura siguiente. El ajuste de la longitud
de onda dentro de la banda estrecha indicado en el pico no tendría ningún efecto significativo en la absorbancia
medida en el pico. Sin embargo, una banda con el mismo ancho desplazado a menor longitud de onda intro-
duciría la posibilidad de error importante, dependiendo del punto preciso dentro de la banda a la que se toma
la medición. Errores debidos a tanto al ajuste de longitud de onda o la calibración del instrumento estarán al
mínimo, cuando las mediciones se hacen en la longitud de onda de máxima absorción..
Banda A
Banda A
Banda B
Absorbancia
Absorbancia
Banda B
Figura 47: Izquierda: Cambio en la absorbancia por el cambio de longitud de onda tiene un efecto significativo en la Banda B, mientras que en la Banda
A el cambio es muy pequeño y despreciable.
Derecha: El cambio afecta a la concentración calculada de una muestra en el caso B.
La absorbancia total de una solución en cualquier longitud de onda dada es igual a la suma de las absorban-
cias de los componentes individuales en la solución. Esta relación hace que sea posible, en principio, determi-
nar las concentraciones de los componentes individuales de una mezcla, incluso si existe superposición total
de en sus espectros. Para el análisis de la mezcla, los coeficientes de extinción molar de los componentes in-
dividuales tienen primero que ser determinados en longitudes de onda específicas, óptimamente las longitudes
de onda se seleccionan de manera que los coeficientes de los componentes difieren significativamente.
Por ejemplo, en una mezcla de dos componentes, el coeficiente de extinción del componente A en la longitud
de onda λ1 es mucho mayor que el coeficiente de extinción del componente B en la longitud de onda λ1.
Para una segunda longitud de onda λ2 esto debería ser todo lo contrario. Las concentraciones estándar de los
componentes A y B deberán abarcar el rango de absorbancia de la mezcla con el fin de cumplir con la ley de
Lambert-Beer y abarcan la mezcla de la muestra.
Para completar el análisis, la mezcla se mide a las longitudes de onda λ1 y λ2. Con los valores de absor-
bancia conocidos, coeficientes de extinción y la longitud del camino utilizado, la concentración puede ser
calculada.
En una plataforma de micro-volumen, las muestras con volúmenes muy pequeños, tales como microlitros,
pueden ser medidas. Muestras altamente concentradas también se pueden medir fácilmente sin ninguna dilu-
ción adicional debido a la disponibilidad longitud de la trayectoria en 0,1 o 1 mm. Esta técnica de medición se
aplica primariamente para las muestras de ADN y proteínas.
Una limpieza inicial de ambas superficies de medición con agua destilada se recomienda antes de realizar la
medición en blanco con el fin de evitar interferencias con las mediciones. NO utilice un pulverizador para aplicar
agua o cualquier otro líquido a la superficie del instrumento.
• Entre las medidas, se recomienda limpiar la muestra de las plataformas superior e inferior con un paño de
laboratorio limpio, seco y sin pelusa.
• Una limpieza final de ambas superficies de medición de la plataforma de micro-volumen con agua
destilada se recomienda después de la última medición de la muestra. Dependiendo de la muestra,
una solución de isopropanol 60%, etanol o agua ultrapura se puede utilizar para limpiar la plataforma
de micro-volumen. Si es necesario, el disolvente utilizado para disolver la muestra puede ser aplicado.
Cuando las muestras se secaron en la plataforma, limpieza adicional puede realizarse utilizando 3 µL de
• Para la descontaminación, una solución tal como hipoclorito de sodio 0,5% (lejía comercial 1:10 diluida) se
puede aplicar a la plataforma de micro-volumen. Una limpieza adicional con agua desionizada debe seguir.
Los requisitos de calidad se han vuelto más influyentes en los últimos años. Con el fin de obtener mediciones
precisas de calidad consistente, es crucial que los instrumentos de análisis midan de acuerdo a las especi-
ficaciones. Algunas industrias requieren aún un seguimiento regular y la documentación del desempeño del
instrumento. En diversos cuerpos normativos, se describen las pruebas de verificación de rendimiento para
espectrofotómetros UV/VIS. Especialmente dentro de las principales farmacopeas, que exigen la verificación de
calificación de los espectrofotómetros utilizados, así como las pruebas sobre la manera de llevarlas a cabo.
También recomiendan el uso de materiales de referencia certificados (CRM) de los proveedores acreditados.
Tales instrumentos calificados satisfacen entonces las demandas para el análisis de las sustancias químicas
farmacéuticas descritas en las monografías de las farmacopeas.
Las diferentes farmacopeas comparten muchas de las mismas pruebas, pero también contienen algunas dife-
rencias, al exigir pruebas y límites adicionales.
El cambio más importante en esa versión de la USP es un cambio fundamental de la prueba para medir la luz
difusa (energía radiante difusa).
Asimismo, la Organización Mundial de la Salud (OMS) emite una farmacopea que es la Farmacopea Internacional (Ph. Int.).
Las pruebas de verificación de rendimiento evalúan la calidad de las mediciones. Para las mediciones UV/VIS en
concreto, se trata del espectro. Las pruebas tienen que garantizar:
• que las posiciones de longitud de onda (eje x) son correctas (Exactitud de longitud de onda) y estables
(Repetitividad de longitud de onda)
• que las intensidades, absorbancias o transmitancias (eje y) son medidas correctamente (Precisión fotométrica)
y son estables (Repetitividad fotométrica)
• que la forma de medición del espectro es correcta y no distorsionada (Resolución de Tolueno, la luz perdida)
La diferencia entre el valor medido y certificado del CRM no debe exceder de ± 1 nm en la región UV
(200– 400 nm), y en la región visible (400–700 nm) no debe exceder de ± 2 nm.
La precisión de longitud de onda se define como la desviación de la lectura de longitud de onda leída de una
banda de absorción en comparación con la longitud de onda conocida de la banda. Una desviación de la longi-
tud de onda puede causar errores en los resultados cualitativos y cuantitativos de la medición UV/VIS.
Es bastante obvio que si el espectrofotómetro no es capaz de mantener una escala de longitud de onda precisa,
el espectro de la muestra medida por el instrumento será inexacto y el verdadero λmax del analito no se puede
caracterizar con precisión.
Absorción observada
2
6 (1% luz parásita)
Absorbancia
Absorbancia
4
0.1 % 1
2 0.3 %
1 2 3 4 5
Absorbancia (verdadera) Longitud de onda (nominal)
Figura 49A: Factor limitante luz parásita B: Efecto de luz parásita visualizada en el pico máximo
Para detectar la luz dispersa a longitudes de onda específicas, se aplican soluciones de nitrito de sodio (340 nm),
yoduro de sodio (220 nm) y cloruro de potasio (200 nm) en agua. Estas soluciones tienen un corte muy abrupto en la
región UV. Esto significa que si se detecta la luz en una longitud de onda donde se supone que la muestra debe ser com-
pletamente absorbente, esto es debido a la desviación de la luz que llega al detector de otra fuente sin pasar a través de
la muestra. Estos filtros se aplican principalmente en la gama ultravioleta debido al hecho de que la luz externa es más
intensiva en este rango.
7.2.4 Resolución
El rendimiento de un espectrofotómetro depende principalmente de la potencia de resolución del instrumento,
en otras palabras, de su resolución. La resolución es un factor crítico en la determinación de dos picos situados
cerca. Se requiere una resolución del instrumento suficiente para ser capaz de distinguir entre los diferentes pi-
cos de absorbancia en el espectro UV/VIS de una muestra. Si la resolución espectral no es suficiente, entonces
las bandas de absorción se convierten en “no resuelto” y no pueden distinguirse claramente uno de otro. Por lo
tanto, la identificación de los picos de absorbancia se hace muy difícil y el valor de la absorbancia será más
bajo que el valor verdadero. El efecto de la alta y baja resolución se ilustra en los siguientes dos gráficos:
1 o 2 picos ?
1 1
λ1 λ2 λ/nm λ/nm
Figura 50A: Instrumento de alta resolución con picos claramente resueltos B: Baja resolución donde los picos no pueden ser resueltos.
1.6 nm 4 nm 10 nm
Absorbancia
Absorbancia
Absorbancia
Figura 51: El mismo espectro es presentado utilizando un ancho de banda diferente. Izquierda: picos están claramente definidos, con un ancho de
banda bajo. Incrementado el ancho de banda la resolución se pierde y menos detalles espectrales son visibles. Derecha: Una gran ancho de banda de
10 nm presenta una sola banda de absorción de los 5 picos que eran visibles utilizando el ancho de banda 1.6nm.
Este ejemplo ilustra claramente la importancia de la selección correcta de la resolución del instrumento para la
medición precisa de un espectro de UV/VIS.
Por lo tanto, la resolución es un factor crítico en la determinación de la forma de los picos medidos. Si la reso-
lución no es suficiente, el valor de absorbancia será más bajo que el valor verdadero.
Las pruebas de resolución farmacopea US y UE consisten en la medición de una solución de tolueno en hexano
0,02% p/v. La relación de la absorbancia máxima alrededor de 269 nm a la de la mínima alrededor de 266
nm es calculada. Cuanto mayor sea la relación, mejor es la resolución. El siguiente cuadro muestra la relación
para una temperatura de 25 °C:
Relación 2.3 – 2.4 1.9 – 2.0 1.6 – 1.7 1.3 – 1.4 1.0 – 1.1
Ancho de banda 0.5 nm 1.0 nm 1.5 nm 2.0 nm 3.0 nm
Los materiales de referencia certificados o patrones de calibración cumplen con los requisitos de las principa-
les farmacopeas (EP, USP). Estos permiten realizar la calificación instrumento de acuerdo con los requisitos
reglamentarios y de garantizar que el instrumento cumple con las exigencias de calidad. Estos materiales están
certificados por el valor de la absorbancia a una serie de longitudes de onda en el UV y regiones espectrales
visibles. Los materiales de referencia son clasificados en líquidos y filtros (vidrio) sólidos.
Los filtros de vidrio pueden ser montados simplemente en un soporte de cubeta única. Tales filtros sólidos
permiten la calificación del espectrofotómetro para la exactitud fotométrica (absorbancia) y también para la
exactitud de longitud de onda.
Los filtros disponibles son filtro de vidrio de densidad neutra para comprobar la exactitud fotométrica,
como muestra el ejemplo anterior. El certificado de Starna, uno de los fabricantes acreditados de materiales
Estos filtros son trazables a los patrones primarios del National Institute of Standards and Technology (NIST).
Con un filtro líquido certificado, los siguientes parámetros del espectrofotómetro se pueden calificar de acuerdo
con los requisitos de la farmacopea:
• Precisión fotométrica
• Exactitud de longitud de onda
• Resolución
• Luz parásita
Los filtros para líquidos se insertan en el soporte de la cubeta del espectrofotómetro donde luego se mide la
absorbancia en la longitud de onda indicada en el certificado de calibración. Los valores de las mediciones
resultantes se compararon con cualquiera de los valores de referencia publicados en la Farmacopea o dados en
el correspondiente certificado del filtro. La prueba luego se considerará ya sea como pasada o no, de acuerdo
con los criterios de aceptación .Filtros líquidos son menos estables que los estándares sólidos: tienen ser recali-
brados con más frecuencia, lo que incrementa los costes de este tipo de material estándar.
CertiRef™ es un accesorio compatible EUP y USP Farmacopea, lo que permite una automática de pruebas de
calibración y de rendimiento de los instrumentos UV7, UV5 y UV5Bio de METTLER TOLEDO. El CertiRef con-
siste de un cambiador de cubeta de 8 posiciones que contienen materiales de referencia certificados (CRM)
en cubetas selladas. EUP Dos conjuntos diferentes de módulos se ofrecen para los usuarios que trabajan de
acuerdo tanto para la Farmacopea Europea EUP como la Farmacopea Americana USP. Todos los CRM son
fabricados y certificados por Starna Scientific Ltd (Inglaterra). Los datos de los certificados necesarios para las
pruebas son accesibles desde un chip en el módulo CertiRef.
Los datos en el chip contiene información sobre el tipo de CertiRef, es decir, si se trata de un CertiRef acuerdo
con EUP o USP, el CRM establece el número de serie para remontarlo al certificado, la fecha de certificación y
la fecha de caducidad e información de cada una de las pruebas CRM. El certificado expedido es válido por un
período de dos años a partir de la fecha de emisión. Aunque las referencias están cubiertos por una garantía
de por vida esto está sujeto a una recertificación periódica. Cuando los materiales CertiRef necesitan ser recer-
tificados o inspeccionados por cualquier motivo, después de 2 años de certificación a más tardar, por favor,
póngase en contacto con su representante local de Mettler-Toledo.
La siguiente lista muestra los CRM, junto con su posición en el módulo CertiRef:
• Calidad garantizada
• Cumplimiento con regulaciones, auditorías seguras
• Productividad incrementada, costos reducidos
• Profesional calificado y entrenado
www.mt.com/UV-VIS
Para más información