Extracción, análisis y caracterización de dos péptidos antimicrobianos en secreciones de

Rana grahami. (Xu et al., 2006)

Métodos y materiales:
1. Recolección de secreciones de piel de ranas.
Los individuos seleccionados fueron especímenes adultos de ambos de sexos de
R. grahami, recolectados en la provincia de Yunnan-China. Las secreciones de
piel se extrajeron por medio de un cilindro contener recubierto con algodón
bañando en alcohol éter etílico donde se introdujeron a los especímenes los cuales
por estimulación con el alcohol éter etílico empezaron a exudar copiosas
cantidades de secreción las cuales fueron recolectadas con solución de NaCl 0.1
M. Seguidamente las soluciones fueron centrifugadas y el supernadante fue
liofilizado (Xu et al., 2006).
2. Purificación de los péptidos:
La secreción liofilizada de R. grahami fue disuelta en 10 ml 0.1 M de Buffer
(fosfato), pH 6.0, a continuación, se realizó una elución con un gel de
biomoléculas [Sephadex G-50] utilizado para filtrar proteínas obteniéndose un
“elute” al cual se le midió su absorbancia a 280 nm. El péptido que contiene la
actividad antimicrobiana fue liofilizado y vuelto a suspender en Buffer [fosfato]
0.1 M, pH 6.0, para ser purificado por medio de SPE [solid phase extraction] con
discos de C18.
3. Análisis estructural de los péptidos
La secuenciación de los péptidos fue realizada aplicando la degradación de
Edman, a continuación, los aminoácidos obtenidos de la degradación fueron
separados por cromatografía liquida de fase inversa [RP-HPLC] y se midieron sus
absorbancias con un espectrofotómetro de masas para su identificación.
4. Construcción de una genoteca de cDNA [ADN complementario]
Una genoteca es una colección de clones cada uno de los cuales contiene un vector
clonador al cual se le ha asignado un fragmento de DNA o RNA total o parcial.
Una genoteca de cDNA contiene secuencias específicas de mDNA las cuales
pueden ser utilizadas para sintetizar proteínas específicas. La genoteca construida
en el presente estudio se la realizo con técnicas estándares de DNA recombinante.
Ensayos antimicrobianos:
Para estos ensayos se utilizaron cultivos de bacterias y hongos estándares;
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus dysenteriae y fungus Candida
albicans.
De estos cultivos se extrajo una alícuota de 10 μl sobre una caja Petri con 1.5%
de agar la cual se procedió a inocular con una alícuota 20 μl procedente de la
sustancia de prueba [péptido antimicrobiano] para evaluar su inhibición en el
crecimiento de las bacterias y hongos.
Resultados:
1. Purificación de péptidos antimicrobianos:
El supernadante obtenido de la centrifugación de las secreciones de piel de rana
fueron elucionadas en 5 “peaks” de las cuales la actividad antimicrobiana fue
detectada en la alícuota señalada con una flecha en el siguiente gráfico:
 (Xu et al., 2006)

El “peak” que mostraba la actividad antimicrobiana fue fraccionado por una

columna de RP-HPLC obteniéndose 20 “peaks” de los cuales un solo peak que
mostraba la actividad antimicrobiana fue purificado con C18 RP-HPLC.
2. Caracterización estructural de los péptidos:
3. Se identificaron dos péptidos purificados con aplicaciones antimicrobianas los
cuales se nombraron como grahamin 1 y grahamin 2, respectivamente, a estos
péptidos se les realizo una secuenciación de sus aminoácidos aplicando la
degradación de Edman, se concluyó que están formados por una secuencia de 21
aminoácidos: GLLSGILGAGKNIVCGLSGLC y
GLLSGILGAGKHIVCGLSGLC, respectivamente.
4. Actividad antimicrobiana:
Grahaminas presentaron actividad antimicrobiana contra las bacterias y hongos
de prueba. No hubo diferencias significativas en la potencia de las Grahaminas
sobre las diferentes cepas de prueba, sin embargo, se observó que B dysenteriae
era significativamente más sensible a la acción de las Grahaminas. A
continuación, se elaboró una tabla con las dosis mínimas péptidos para las
diferentes cepas testeadas:

(Xu et al., 2006)

Xu, X., Li, J., Han, Y., Yang, H., Liang, J., Lu, Q. and Lai, R. (2006). Two
antimicrobial peptides from skin secretions of Rana grahami. Toxicon, 47(4),
pp.459-464.