CAPITULO 8 139 Enzimas Existem dus condigoes fundamentals para a vida. Una delas & {que o organismo vive deve ser capar de se auto-eplica (topico {que ser visto na Parte IV deste livro). A segunde € que 0 orga nismo deve ser capex de catalisar reages quimicas eficiente e seletivemente, A importancia fundamental da catilise pode sur preender alguns estudantesiniciantes em bioguimica, mas € fi cil Hastsi-la, Come descrito no Capitulo 1, 08 sistemas vivos utilizam energia do meio ambiente, Os seres humanos, por exem- plo, consomem quantidades substancials de sacarose — 0 agt- ‘ar comunente usedo — como uma especie de combustivel at forma de alimentos acucarades, bebidas, ou comoagicar. A con- versio ca sacarnse em CO, © H-O na presenga de oxigenio ¢ um processo akamente exergénico, que libera energia livre que pode ser utilizada para o ato de pensar, mover, sentir e ver. Pntretan- te,um saco de agticar pede ser armazenaclo cirante varios sem ser transformatio em CO, € HO. Embora esse processo qu mmico se termodinamnicamente favordvelsele érmuito lento! Con: tudo, quande a sacarose ¢ consumida por uma pessoa (ou qual ‘quer outro orgenismo), ela libera sua energia quimica em se- gundos. A cllferenca & a catilise. Sem a catélise, as reagGes ‘quimicts necessivias para sustentar a vida nio ocorrem em ume. scala de tempo ati, Voltaremos, agora, nossa atengao para os catalisadores das reagoes que ocorzem nos sisters biologics: 2s enzimas, as mais notives e altamente especializadas proteinas. As enzimas apre sntaim uma eficiénca cataltica extraordindria, em geral muito rior quea dos catalisadores sintéticos ou inorgamicos. Elastém um alto grau de especificidade por seus substratos, aceleram as, reagoes quimicas de uma maneira formidvel e funcionam em sligdes aquosas sob condigdes muito suaves de temperatura € DH. Poucos catalisedores nio-biolégicos apresentam tals pro- Prisdades. As enaimas sio fundamentais para qualquer processo bio: quimico, Agindo em seqiléncias organizadas, clas catalisarn as centenas de reagdes sucessivas pelas quais as mokéculas autrien- tes séo degradadas, a energia quimica € conservada ¢ transfor~ mada ¢ as macromelsculas biol6gicas sa0 sintetizadas a partir de moléculas precursoras simples. Devido & ago das enzimas teguladoras, a8 vias metabvilcas slo altamente coorckenadas de forma a produzir uma atuario harmoniosa des muita diferen: tes atividades neceasirias pare manter a vida ‘Oestudo das enzimas tem uma grande importancia pritica Em algumas doengas, especialmente nas desorderss genéticas hecdadas, pode ovorter uma deficigncia ou mesmo a auséncia total de uma ou mais enzimes, Outras condigdes anormsis tam- bbém podem ser causadas pela excessiva atividade de uma enti ‘ma, Medias da atividade de enzimas no plasma sangOtneo, er trdcitos ou amostras de tecido sio importantes no diagnéstico de virias doengas, Muitas drogas exerosm seu efeto bioldgico por meio de interagbes com as enzimas, As enzimas tornaram= se importantes ferramentas priticas ndo apenas na medicina, ‘mas também na indistria quimica, no processamento de ali mentos ¢ na agricultu Iniciaremos este capitulo com a descrigao das propriedades das ergimas e dos prineipios fundamentais de seu poder cali tico, Em scguida, faremos uma introdueio a cinética encima ‘cena disciplina que fornece a maior parte dos furdamentos ‘para qualquer discussao sobre enzimas, Fxemplos especificns de ecanismos enzimaticos sera entdo mostrados, ilustrando os principios intradurides anteriormente, Finalmente, diseutie ‘mos as enzimas reguladoras. Uma Introdugao as Enzimas A maior parte da istéria da bioguimiea é hist6ria da pesquisa sobre enzias. A catdlse biol6gica foi ineial mente reconhecida ‘eceserita no final de 1700, em estudos sobre a digestao da carne por secrecoes do estOmago, Em 1800 as pesquissscontinuaram cam o estuda da conversto do amido em agticares simples pela salivae por varios extratos vegetais, Fm 1850, Louis Pasteur con- cluiu que a fermentacio do agiicar em slcool pela levedura ¢ ci talisada por”fermentos’, Ele postulou que esses fermentos eram inceparaveis da estrurura das células vivas de levedura, uma hi potese chamada vitalismo, que prevaleceu por muitos anos. Em 1897, Eduard Buchner descobriu que os extratos de levedura podiam fermentar 0 agdear até doo), provando que a fermen tagao era promovida por moléculas que continuuavam funcio~ nando mesmo quand rerovidas das celulas. Frederick W. Kub- ne cenominou ais moléeulas ce enzimas, A medida que as no: ‘gbesdovitalismo da vida foram refutadas,o isolamento de novas fnzimas e ¢ investigacao das suas propriedades propiciaram © progress da ciencia da bioguimics Er Buchner 360-1917), Oiisolamento ea crstalizngan da urease, em 1925, por James ‘Sumner, propiciaram um significante avango nos estudos ini: ciais acerca das enzimas. Sumner demonstrou que 0s crstais de ‘urease consistiam inteiramente de proteina ¢ postulou que to ‘dae as enzimas s20 proteinas. Devido falta de outros exemplos, ‘ssi premissa permaneceu controvertida por algum tempo. So:190 James Surmet 1887-1955) 185, Haldane (1862-1964) mente em 1930, apds John Northrop e Moses Kini terem cris- talizado a pepsina, a tripsina e outras enzimas digestivas ¢ con- uid que elas também eram proteinas, € que a conclusio de Sumner foi completamente ace'ta, Durante esse perfodo, LBS. Haldane escreveu um tratado intitulade “Enaimas” Bs natureza molecular das enzimas ndo estivesse completamente tlucidado, Heldane fez a extraordindria sugestao de que as inte ragGes fracas que se estabelecem entre a enzima e 0 seu substra to poderiam ser usadas para distorcer a molécula do substrato & catalisara reagto, Ese conhecimento representa o cerne da com- preensao atual da catalise enzimatica, NNo final do século XX, a pesquisa com enzimas que catali sam as reagoes do metabolism celular foi intensa, Esse favo le- vou’ purificagao de milhares ie enzimas,a elucidacao da strat imolecular edo mecanisme quimico da aca de centenas delas © uma eompreensio geral de como as enzimas fu bora a ‘A maioria das enzimas so proteinas Com excecio de um pequeno grapo de moléculas de RNA que apresentam propriedades catalitica (Capitulo 25), todes as en ima s30 proteinas. A sua atividade catalitica depende da inte fridade da sua conformayao prottica nativs. Se uma enzima ¢ desnaturada ou dissocioda em subunidaces, a acvidade cata ca gpralmente¢ destruca, Se uma enzims € guebrada em seus aminodcidos constitutes, 2 sua atiidace cataltica & sempre dlestruida, Asim, as estrus proteicas primar, secundaria, terciriae quatermiria das enzimas so essencias pa a sua ai Vidade catalitica ‘As enzimas, como outeas proteins, tém pesos moleculares «que variam de cerca de 12.000 até mais ce 1 milhio. Algumas ceimas no requerem nenhum outro grupo quimieo, além de scusresiduvos de aminodcidos, Outas requerem um componente P também catalseareacéo P > S.O papel das enzi- mes 6eeerara intetconversio de Se P. enzima nao ¢gasta no proceiio ¢ 0 ponto de equilbrio néo ¢ afetado, Entretanto, a reagao atinge o equiibrio muito mais rapidamente quando a envima apropriada ests presente, uma vez que a velocidade da reagdo¢ aumentada Esse principio geral pode ser ilustrado considerando-se a conversi da sacaroxee oxigdnio em COs € H,0: CHO), + 20, = 12C0, + 11,0 Esta conversao, que ocorre por meio de uma sétie de reagoes isoladas, tem um AG" elevado e negative, e, no equilibrio, a quantidade ce sacarose 6 desprezivel, A sacarose & um composto, ‘Coorcenadas de eagt0 Figura 8-3 -Diagrama de coordenadas de reagto comparanda uma reagio catalisada enzimaticamente com uma nio-. estavel porque barreira de energia deativagan que deveser supe rada para que ela resia com 0 oxigénio é muito grande. Fla pode serarmazenada em um recipiente contenco O, indefinidamente, sem reagit. Entretanto, nas células, a sacarose rapicamente transformada em CO, e H,0 por meio de uma série de reagoes cxtalisades por enzimas. Esses enzimas mio apenas aceleram as reagbes, mas as organizam e as controlam de tal forma que a ‘maior parte da energialberada € conservada jquirnicas, cando assim disponivel pura a célula executar outras Laefas. © caminho reacianal pelo qual a sacurose (# outeos agi= cares) € dagradadaé a via prinsria de Liberagio de energia (Capt tulos 15 e 19], as enzimas dessa via permitem que a seq reagies ocorra em Una escla de tempo biologicamente itil, Na pratica, qualquer reagao pode ter varios pessos (ctapas) emvolvendo a formagdo € o consume de espécies quimices tran sientes, chamacos de imtermediarios da reaglio*. Quando a rea io S== P & catalisada por uma enzima, os complexos ES ¢ FF Si0 0s intermedirios (Eq. 8:1). Fes ocupam os vales no diagra ma decoorderadas da reagao (Fig. 8-3). Quando ocorrem virios ppassos em uma reagde, a velocidade total ¢ determinada pelo ‘Passo (0U passos) com & maior energia de ativagto, Esse passo é chamado "passo limitante da velocidade’, Para 03 casos simples, © passo limitante da velocidade & © ponte de mais ata energie ‘no diagrama para as intereonversies deS e P. Na praia, o passe limitante da velocidade pode variar com as condigoes da r2aga0, ara muitas enzimas, varios passos tem energia de ativagzo si: mils, 0 gue signifies que todos eles sao parcialmente limitantes a velocidace ‘Como descrito no Capitulo 1, as enengias de ativacao sae barteiras energsticas pata as reagoes quimicas. Essas barrcitas sao cruciais para a existencia da propria vida, A estabilidade de ‘oma molécula aumenta com o aumento da altura de sua barre. ra de ativacao, Sem tais barreiras enengeticas, a macromolécu las complexas podleriam reverter espantaneamente para as for 1 cutras Formas ‘mas maleculates m imple, € as estruturas complenas # alta Deere que oe termos pastor" “intemedisios” neste capt se ferern és exptcies quimieas que ovortem no caminhwo rational de ua simples reagaocatasnds enzimaticamente, No context dat vise met balsas que ervelvem rity ensimas (Parte TM deste ize) exes ter sto usados de uma maneia diferente, Umi rasio evimtcagealmerte conskerada comno um “av” em vana vit metas, eo produto de ‘uma reap enioatica (que ¢o substrate para a procima enim a vt) comsderado come i “iatennediia‘mente orcenadas, her como as processos metabslicos das él las, poderiam nao exis selesivamente as énergias de ativagio de reagdes necessaries & sobrevivéncia das clus, FAs enzimas evoluiram A velocidade ¢ 0 equilibrio das reagées tem definigbes termodinamicamente precisas (© quire de uma reagao esta intrinsecamente ligado a0 AG", ‘enquanto a elocidade da reagao esta ligada a0 AG". Uma intro- dduyao basica a essasrelagbes termodinamicas€ 0 préximo pas- toa compreensio de como as enrimas trabalham ‘Um equioria como S== P édescrito por uma constante de equiltbrio,K., ou simplesmente K (Capitulo 4). Sob cond «oes-padeao, empregacas para comparar processes bioguimi Cos, 1ima constante de equilibrio &expeessa por K,, (ou KY: Ir 5 a termodindrnica, a relagdo entre Key € AG™ pode ser deserita pela expresso: (e2) K& Pin Re, co) onde R ¢ constante dos gases, 8,315}/mol “K,e Téa tempera- tura absoluta, 298K (25°C), A Equacao 8-3 serd desenvolviea e discutida com maiores detalhes ne Capitulo [4 O ponto im- portante aqui é que a constante de equilibrio esta dite relacionacla com a variagio global da energia livre padrio da reagio (Tabela 8-4). Um grande valor negativo para AG" reflete tum equiliorio de eagdo favorvel mas, como ja foi salientado, isso ndo significa que a reagio ocorreri com uma velocidade consider vel inte [bela #4 ~ A ralagio entre Kig @ AG” (veja Eg. 8-3) «quena fragdo de segunda, Se @ vlocidade da reagio depende da concentragio de dois compestos diferentes, ou se duas mokécolas cdo mesmo composto reagem entre sya reagao & de segunda or dem ¢ k ¢ uma constante de velocdade de segunda ordem, com ‘nidade M's, Nese caso, equagio da velocidadetorna-se: VAS) os) ‘partir da tooria do estado de transigae, pode se dervar uma ‘expressdo que relaciona a magnitude da constante de velocidade yma energia de atvagao: fa i wo) onde k € a constante de Boltzmann ¢ h €a constante de Planck, O ponto importante a salientar aqui ¢ que arelagdo entrea cons: tante de velocidad, &, ¢ a energia de ativagio, AG’, € inversa & cexponencial. Em outras palavras, ssa ¢ a base para a afirmayio. de que uma energia de ativagdo menor significa uma velocidade de reagao maior e vice-versa. ‘Agora vamos mudar © assunto de o gue as enzimas fazem, para come elas o fazer. Alguns principios explicam o poder catalitico ea especificidade das enzimas As enzimas slo catalisadores extraordinérios. Os aumentes da velocidade provocados pelas encimas variam entte 517 ordens, de magnitude (Tabela 8-5). As enzimes tamixm sio muito es jas, discriminando entre substratos com estruturas muito similares. Como esses aumentos, enormes e altamente seletivos, 1na velocidade das reagdes podem ser explicades? De onde vem a ‘energia que diminui dramaticamente a energia de ativagae para reagoes especificas? Tabela 8-5 — Alguns valores do aumento da velocidade produzido Ki ‘36 Guymon or enzimas. na 342 Cilofiina 10° w0* 785 é e, arvarase carbonica 10 10? a Tas fasate isomerase ow 10? M4 Caroepeptidase A 10" wt 5a Foslogleomutae 10" 1 oo 5 i a Succi. transferase 10 0 ay Urease 10" 10! 174 rotisina monotostat descarbeilase 10! A velocidade de qualquer reagio & determinada pela con centragio do reagente (ou dos reagentes) ¢ pela constante de velocidade, getalmente representada pelo simbole k. Para a rea «lo unimolecular $ > P,a velocidade da reaggo V, que represen ta quantidade de $ que reage por unidade de tempo, ¢ expressa pela equagao da velocidade: v-us) wy [Nesta reagto, velocidad depende apenas de conceniragio deS. Else chamaca de taco ce primeira order. O fator K€ ura eons- tunte de proporcioneldade que reflete a probabildade de a rea- «fo ocorrer em un dado conjunto de condiges (pH, temperat rac.) Aqusk € uma constante de velocidade de primeira ordem ¢ sua tnidade € 0 reciproco do tempo, por exemple $. Se uma reagio de primeira ordem tem uma constants ke velocidade de (43, so pode ser interpretado (qualitativamente) que 3% do S disponivel se convertdo a P em |. Uma teagdo com uma constante de vlocidade de 2.0005 estar terminada em uma pe- AA resposta para essas questOes apresenta duas partes distin tas, mas interligadas. A primeira diz respeito aos rearranjos das ligag@es covalentes durante a reagao enzimitica, Reagoes quimi- cas dos mais variados tipos ocorrem entre 0 substrato e os gr os funcionais da enzima (cadeias laterais de aminoicidos espe cificos, fons metélicas ¢ coenzimas). Os grupos funcionais cata- liticos das enzimes podem formar uma ligagao covalente transitéria com um éubstrato e ativi-lo para a reagao ou, entao, algum grupo pode ser transferido transientemente do substrato, para um grupo da enzima. Em muitos casos, essas reagbes 60 ‘mente ocorrem no centro tivo da enzima. Hlas diminuema ener. gia de ativasao (e, portanto, aceleram 2 reasa0), propiciando um, ‘carninho reacional alternativo de energia mais baixa. ‘A segunda parte da resposta diz respeito as interagoes nao. covalentes entre a enzima eo substrato. A maior parte da ener- fia necessiria para diminuir a energia de ativagzo é derivada e interagoes fracas, nap-covalentes, entre o substratoe a enzi rma. O fator que de fato distingue as enzimas da maioria dos 193194 catalisadores mio-enzimiticos @ a formagao de wm complexo ES especifco, A imteragao entre 0 substeato e a enzima nesse complezo € mesliada pelas mesma forgas que estailizam a esteutura protéca, inchuindo as pontes de hidogenio, ime es hidrofobieas e idnieas (Capitulo 6) interagio fraca no complexo 15 € aeompanhada por uma pe- -O terme [AGw representa e eietenca enlve a6 energar dos estador de transqao da reagio nao-catalsace e da catalsada 8 prowery das rages magnaticasente-o bas e a “bastonase", Quendo erama & complement 20 subsrato(b), 0 complexo £5 € mals duel em mores enetga Ive ro estado fundamental cue 9 pldpne siesta © resitado @ um aurmenio‘naenergia de vec2o. Alingir o estado de transica0, Assim, o aumento em energia li re necessirio para dobar o bastio ¢ quebrar parcialmente a sua conformacae ¢ compensado ou “pego” pelas interagoes, -mgnéticas (energia de ligaedo) que se formam entre aenzimae fo substrato no estado de transicéo. Muitas dessas interagaes ‘envolvem partes do bastdo que estao longe do ponto de rompi- ‘mento. Assitn sendo, as interacoes entre "bastonase” eas regioes into -reativas do basizo fornecem parte da energia necessria para o rompimento do bastzo, Esse" pagamento de energia”€ tradu- tido.em uma menor enerpia de ativagio real e uma maior velo~ Energi ies, © 195 cidade de reagao. ‘Asentims reais crabalham segundo um principio andlogo. Algamas interagdes fracas io formacas:no complexe ES, mas e toalidade das interayies fracas cue se estabelecer entre o subs trata e« enzimna éestabelecida apenas quando o substrato atin gro estado de transicio. A energia livre (energia de ligagso} li berada pela formagio desses interagdes supre parcialmente a cenergia requeria para se atingir 0 topo da colina de energia. 0 somatorio da energia de ligagto desfavorivel (positiva), AG, € favorivel (negativa), AGp, resulta em uma energia de ativagao liquide menor (Fig. 8-6), Mesmo para enzima,estado de tran- sega mao é uma especie estivel, mas um breve instante que © ‘Coordenadas de reagio Figura 8-6-0 papel da energia de igacio na catalise. Pare divinue 2 energia de atvagao ce Uma Teaco, 9 shterra precisd adguint uma ‘auanidade de energia equivaiente a drninuicso de AG* A macr pata ‘dessa nara proven da energa de Igacdo (Gy) © € dsparibizada pela formacio de interayoas reo-covalentes racasenive o Subsiratoe a fenaima no estado de Wansgso 0 sigrvicada de AGy € andlooo 20 de SSGy m3 Fgura BS196 substrata gasta pare atingiro topo da barreira de energia, A rea (Qo catal’sada enzimaticamente ¢ muito mais rapida que 0 pro- cessn ndo-catalisado, porque a barreira ¢ muito menor. O prin- cipio importante é que as interagaes de Higapaes fracas enere a encima eo substrate fornecern a maior parte di forge que dirige a catdlise enzimduiea. Os grupos no substrato que sio envolvidos nesas intetagbes fraces podem estar a uma ceria distancia das. ligagdes que sio quebradasou mudades. As interagies fracas que se formam apenas no estade de transicio sio as que contribuem fumdamentalmente para a catilise. A necessidade de milltiplas interogées fracas para dirigit a catilise & uma das eazdes por que as enzimas (ealgumas coenzi- ‘mas) sto moléculas to grandes. A enzima deve fornecer os ge pos funcionais para a formagao de interagoes ionicas, pontes de hridrogénio e outras interagdes, bem como posicionar precisa- mente esses grupos de tal forma que a energia de Haga seja ootimizada no estado de transigao, A energia de ligacio contribui para «a especificidade da reago e a catalise F porsivel demonstrar quantitaivamente que a energia de iga- do € responsive pela enorme aceleragao da velocidade das rea~ 64s catalisdas pelas envimas? Sim. Come um pooto de ree- Fencia, a Equagdo 8-6 permite cakular que AGT deve diminuit aproximadamente 5,74] /mol para aceerarcercade des veres uma reagio de primeira order, sob as condigdes comumente encon= tradas nas células. A energia disponivel devide & formacio de lama kinica interagao fraca geralmente & da ordem de 4 a 30K] ‘mol. A energia toal disponivel, devide & formagio de um certo rnumerosdesses interayoes, provavelmente ¢ suficiente para di rminuira energia de ativacao de cerca de 60 a 1OUk/mol, reque rida para explicar os grandes aumentos na velocidade observa dos para muitas enzimas ‘A mesma energa de ligagdo. que formece a energia para a catalise também é cesponsdvel pela especificidade, a habilidade da encima em discriminar entre o substrato e urna outra molé- cula competidora. Conceituelmente, « especificade ¢ facil de ser ciferenciada da catilise, mas essa distingdo é muito mais di- fei de ser fitaexperimentalmente, porcue a cate ea expect ficidade sa0 originarias do mesmo fenémeno, Se 0 centro ative de uma enzima tem grupos funciona artanjados de forme ot mizedla para formar uma variedsde de interagoes fracas com um dado substrato no estado de transigdo, a enzima nao serécapaz deinteragicdo mesmo modo com qualquer outra molécula, Por cxemplo, seo substrato tem um grupo hiéroxila que forma uma ponte de hidrogénio especifica com um residuo de dcido gluts- ‘ico ne cazima, qualquer melécula que nao possuiraquele gru- pohidroxila espectfico ser de maneita geval, um substrate mais pobre paraa mesma enzima Além disso, qualquer molécula com 1um grupo funcional extra, para'© qual a enzima nao aprescnta uma cavidade ou um sitio de ligagao, muito provavelmente serd excluida da enzima. Geralmente, a especifcidade & derivada da formagao de multiplasinteraybes fracas entre a enzima e « mo- Icula de seu substrato especifco. Os prineipios geraisj4 descritos podem ser ilustrados por uma grande variedade de mecanismos cataiticos conhecidos Esses mecanismos nao sto mutuamente exclusives ¢ uma dada «envima pode incorporar vies deles em seu mecanismo de ac. Geralmente é dificil quantificar a contribuigao de um dado me- «anismo catalitico para a velocidad e/ou espesificdade de uma determinada reagio caalisada enzimaticamente. ‘A energia de ligecdo & a forga impulsionadora dominante «em yrios mecanismos ela pode seo principal, se n40.0Gnico, contribuinte pars a catélise. Vamos considerar o que € necessi rio acontecer para que a reacio ocorra. Os fatores Fsicos ¢ tr ‘modinamicos importantes que contribuem para o AG, a bar reira energética, inclueny (1) a mucanga na entropia, na forms de movimento de liberdade de duas moléculas em solugaos (2) camada de solvatasao de molécalas de agua ligadas por pontes de hidrogenio que envolvem e ajudam a estabilizar a maiorie. das biomoléculas em solugae aquosa; (3) a distorcae dos subs- tratos que precisa ocorrer em mulitas reagdes,e(4) a necesidade de se obter um alinhamento adequado dos grupes cataiticos funcionais na enzima, A energia de ligagdo pode ser usadla para vencer todas essas barreiras. A vantagem mais evidente da ligacio dos substratos & enzi- ma € uma grande reducéo nos movimentos relatives, ov redu= ‘lo da entropia, desses substratos. A energia de ligacio mantém (0s substratos orientados adequadamente para reagi. Iso repre Senta uma importante contribuigao a cataise, uma ver que as colisGes produtivas entre as moléculas em solugio podem ser muito raras. Bssealinhament preciso do substrato sobee a su perficie da enzima & devido a grande quantidade de interacoes fracas entre cada molécula le substratoe grupos estrateyicamente localizados na encima que fixam as molécilas de substrata va Posigio adequada. Estudos tém demonstrado que 2 restrigao do movimento de dois reagentes pode produzit aumentos de velo cidade da ordem de 10°M (Fig. 8-7), 3 , cmon om yl ‘Oo oO i i Longe eo ¢ t 4 1 1 on Il Figura 8-7 - Aumento da velocidade por meio da reduce de en- ‘ropa. Sdo represertadas reacties de ur ester corn umn grupo cartcl= co bax former um anidrda, © grupo Reo mesma em cada cao ia) Para ‘sta roagio brmalecul, a corstante de veloadade ¢ ce sequnds order ‘com undade M's. fb} Quand 0s ds runes reapers esta0 nae ‘ma molecu, 2 reacao @ multe mas pida, Pra eta teacio uniiolecs- lay a unidade de K'¢ s'. Dnidiido-se a constate de veacidade de) pela consent de veloctace dela), tome um aumento ca velocidad Ge cerca de 10'M (a unidace molardade € resutante do foto que fo: ‘ormoareda ume reacdo uninokcular com ourra bimolecla) Colca tose de outs movi, 0 raagarts em (b)extvesre provente om uma concentragio 1M, 05 grupes reagentes se comportariam corns se ext ‘vesser presenes ern uma conceiagao ICM. Embara © reagente ert ( aprsente live rotacac om 1s IgagbesImestiadas com set curs) io anda representa una substance reducaa da enacts erm rlacac a (a). Se as lgaches que gram em (b} fam impecida como om fe, 3 centropa @ eduzida mais anda ea reacbo exbe um aurrerto de veloce dade de 10°M er relacaa a a)A formacao de ligagoes fracas ente 0 substrate e 8 enzima também resulta na dessolvatagao do subsiato. As interagdes en- zima-substrato substituem a maior parte (ow até mesmo todas} das pontes de hidrogénio existent entre 0 substrato ea Sau. ‘Aenergia de ligagio envolvendo as inieragoes fracas formadas apenas no estado de transit da regio ajuda a compensariermo- éinamicameate qualquer cistorgio (Fardamentalmente uma se- disrbuigao de déttons) que o substrato deva softer para reagit Finalmente, a propria enzima pode sofrer magangas com formacionais induzides pelas miltplasinteracoes fracas com 0 substrato, quando da ligagao como subsrato. Fssefato &deno- rminaco de ajuste induzido, um mecanismo postulado por Di- niel Koshland, em 1958, O ajuste induzido serve para colocar s1upos funcionais especificos da enaima em uma posigao apro. nds pore eatalisar a teacio. A rmudanga conformacional iam bbém permite a formagao de interagoes adicionais por ligages fracas no estado de transigao, Fin quaisquer desses casos. a nova conformasao apresenta propriedades cataliticas aumentedas ‘Como vimos o juste induzido & urna caracteristica cormum da Ligacdoreversivel dos lgantes a proteinas (Capitulo 7).O ajuste indurido também ¢ impostante na interayao de quase tras as, enzimas corns seus substratos. W I con + HH sti eh on an eeofeo kak Figura #8 - Detenvolvimento destavoravel de cargas durante a {os 197 Grupos cataliticos especificos contribuem para a catalise ‘Uma vez que 0 substrato se liga & enzima, os grupos cataliticos funcionais,adequadamente posicionados,avsiiam a quebra ea formagao ée ligagoes por meio ée uma variedade de mecanis- ‘mos, incluindo a eatisecio-base geval, a catdie covalente 4 catdlse por fons metalicos. Fses slo mecanismos distintos dlagucles basal na energie de liga, uma ver que geralmente envolver urna interagio covtemte transient como substato 02 uma transferencia de grupos do substrato ou para o subsrato Katélise acido-base geral, MuitesreagSes bioquimicas envol- vem a formagio de intermediarios carzegades instiveis que ten- deny a se transformar rapidamente em suas espécies reagentes constituintes,impedindo assim a reacao (Fig 6). Esesinterme- didvios corregadas freqiientemente podem ser estabilizados pela ‘ransferéncia (retirada ou adigao) de protons do substrato ou de um intermediario, para formar especies que se quebram er produtos mais rapidamente que 0s reagentes, Para as reagnes nao-enrimaticas.a transferéneia de protons pode envolver ape nas os constituintes da agua ou também outtos dondores ou aceptoresfracos de protons. A catdliseque envolveapenasos ions . ssp rye \ b Non iM 8 Na Qusode a anaes de protons da ‘ou para 1,0 € mais lent do que a ss ‘eocaiade de quebea dos ein Daas whe Lg dowd Mormados srk ‘stbiizad. A prseng de dosdores Produtos quebra de uma ligagdo amida que pode ser evitado pela catilise. £ rmosrada 3 hdiGlee de uma igagdo ama, 2 mesmo renga Cstalsada pela quimotiesna e o.tas proteases. © desenvolvimento da Carga 6 destavo- rhrele pode 32" ewtace pela doacia ce um proton gel HO" ative Seid espectical ou HA (ataise oes aera), em quo HA representa um Sedo fuaquer Simlarene, a carga pave ser reuvalzada pela capiute de um préton pelo OH (case bisa especfca) ou B: cataise bésce geval, em que B representa uma base quelque198 HF (H,0") ou OF, presentes na Agua, ¢ denominada catélise fcido-base especifice. Se a transferéncia de protons entre o in- termedidio ea égua é mais répida que a transiormayi do in- termediirio nos reagentes, o intermediario sera efetivamente extabilizado todas as veres que se formar. Desse modo, nenhu- ‘ma catilise adicional, mediada por outros recepores ou doado= tes de prétons, ovorrers. Entreianto, em muitos casos, apenas a participagao da 4gua nao é suficiente, O termo eatélise écido- ‘base geral refere-se a transferéncias de protons medisdas por ‘outras classes de moléculas. Para reagdes ndo-enrimaticas em solugbes aquosas, isso ocorre apenas quando o intermedirio instavel da teacdo se transforma nos reagentes com uma veloci- daile maior corn que os protons sto teansferides da dgua ou para 4 gua, Nessas siiuagiks, varios dcides orgtnicos fracos poder suplementara gua come doadores de prétons, ou, ainda, bases, ‘orginicas fracas podem servir como aceptoras de prétons, [No centroativo de umaenzima, um certo niimero de cadeias laterais de aminoscicos pode atuar tanto como coador quanto, = el mesmo qusraa (5) desta Corna peauere ou reotivamente peavena, As unicedes so tpicas para Faacooseataluadas arvimaticanente e apresertadas apenas para iter fo sianticade Vise [Sots que a curva vescreve parte ce uma hiparbol> Tetangitar cor uma das assntotas 2m Vay. Se 8 cuNe contnuasse para Concentracoer abaie ce [S} = 0) la se eroxmara de una asiniota Seri quando [S| = Ki) Leonor tichaots (1875-1949) Naud Mester (1873-1960), cde mais PS, medida que a [S| aumenta, A velocidade inicial iméwima da reagdo (Vou) S016 atingida quando praticamente todas as moléculas da enzima estiverem na forms do complexo ES.ca concentrasio da enzima livre E for sigpificativamente pe ‘quiena, Nessas condigdes,a enzima est “saturada” com seu subs. trato €a yelocidade da reagao nao sumenta mais com novos 2 imentos da [S]. Essa condiggo existird sempre que a [S] for sufi- entemente alta para manter todas as moléculas de enzima na forma combinada com o substrato, BS. Em seguida, o complex0, FS transforma-se no produto P ea enzima élibereda para cate lisar a transformagao de outra molécula de substrate. O eteito de saturagdo € uma caracteristica que distingue os cataisadores, encimaticos ¢ €0 responsével pelo patamar observado na Figura 8-11, Essa condigao de saturagao existira sempre que [S] for su- ficientemente alta, ‘Quando @ enainna ¢ misturada com um grande excesso de substrato, existe um periodo inicial, o estado pré-estacionsrio, rng qual a concentracio de FS aumenta. Esse periods € muito ‘curio para poder ser faciimente ebservado. A reagae atinge api damente oestade estacionario,em que a [ES] (ea concentracio 199200 de quaicquer outros intermediaries) permaneceré praticamente constante durante 0 decorter de certo tempo. O conceito ce os {ado estacionario foi introduzido por G.E. Briggs & 3.8, Halda neem 1925. velocidade medida V, geralmente rfleteo estado cestaciondrio (mesmo considerando-se que V, estejalimitada aos tempos inciais da reagao) e a anilise dessas velocidadesiniciais chamada de cinética de estado estacionsrio, A relagio entre a concentracao do substrate © velocidade da reacdo pode ser expressa quantitativamente A-curva que expressa a relagio entre [8] ¢ Vo (Fig, @11) tem a ‘mesma forma geral para a maioria das enzimas (ela se aproxima cde uma hipérbole retangular) que pode ser expressa algebrica mente pela equagao de Michaelis: Menten, Michaelis e Menten Cerivaram essa equacao partindo de sua hipotese basica de que ‘6 passo limitante da velocidade nas reacoes enzimaticas seria a ‘quebra do complexo ES para formar 0 proctuta e « enzima livre Aequacio€ 9) Os termos importantes so [S], Vin Vac € uma constante cha- mada de constante de Michaelis, Kr. Todos esses termos so fa Aus ee) Resolvendo esta equacio em funcio da |ES| AE ISL (es}= Ts +h +k 6 Simplifcando esta dltima expressio e combinando-se todas as constantes de velocidede em um Ginico termo: LEIS) BT + CO termo (k, +k, /ky € definido come a constante de Michaelis, Koy. A substituigao desse valor na Equagao 8: 8 simplifica a ex pressao para bos) (ey lest wy) a) Pusso 4. Yo agora pode ser expressaem termosda [PS], Subst indo-se a [ES| da Equagio 8-11 pelo lado diteto da Equagio 8- 19 obtém-se 820) Esta equagao ainda pode ser simplificada, 4 vimos que a veloc dade atingird 0 ponto maximo quando a enzima estiversatura- daisto 6, quando [5] = [E,-Assim Vy pode ser definida coro 4 [F, |. Substivuindo este valor na Equagao 8-20 obtem-se: Vas | Ke ST sia éa equayio de Michaclis-Menten, 3 equagio da velocidade paca uma reagao catalisca enzimaticamente e com am tinico substrato, Fla é uma expressio da relagao quantitativa ene a velocigade inicial Vs, a velocidad inicial maxima Vig © ‘entracdo inicial de substrato [S|, todas relacionadas pela cons- tante de Michaelis, Kn» Note que o Ke, tem unidade de concen- traglo. Essa equa¢do estd realmente de acordo com resultados experimentais reais? Sim. Confirmaremos essa afirmacdo consi- derando situagoes Limites em que a [S] & muito alta ou muito baixa, como mostrace na Figura 8-12. ‘Uma importante rolacao numerica emerge da equagio de Michaelis-Menten no cise especial em que Vy € exatamente a Ws metade de V4, (Pig. 8-12). Entao: Yaa. ¥ fem 2 Ka + (5) ~ Dividindo por Yau. obtém-se \w2) Resolvendo em fungio de se Kx + [8] =2{S}.00 Ky=15h— guindy ¥4={ Van 62) Isto representa uma definigao pritica muito url de Kyt @ Ky € equivalemte 3 concentragao de substrata onde V, &igual a meta- dede Vins.Vo isto) Kn Isl tants Figura 6-12 — Efeito da concentragéo do substrate na velocidade Inioal da reagao. 0 grace mosis aw arretios cetces qe delinem {95 lites da cura em bateas © ates |S] Erm bagas [S} Kn >> BS] 0 tena [5] no denorrinacor da equato de Michasis-Merten (fa &-9) torro-e inagrvicance. A quac30 pace ser smaeada para Ve = nx ‘Ve € Ve passa a er uma cependéncia linear em Furgao 43 [5 co™e pode er oservan nesta iguta rn [S]elevadas, ond= 15) >> Ke. 0 er mo. 79 denominader da equagae de Michaols-Manten tora seinsig- infcerte ea equacao pode ser simplficada para V; = Vn. B50 6 consis tente com opatarar otserado as [s] elevaas. Portarta #equayao de Michael Menten & cansstente com 2 depencéncia observada de ¥, om feiacaoa [5] fost da curva @ dein pos ferris Ve, quero AIS} pequena, apenas por Yaw, quand 2 (S| 6 aka ‘A equacio de Michaelis-Menten (Bq. 8-9) pode ser trans- formada algebricamente em formas que si0 mais ites para a dleterminagio pratica de Ke Vie (Adendo 8) como descre- ‘yeremos posteriormente, na andlise da agio de inibidozes (veja Adendo 9-2) Os parametros cinéticos so usados ara comparar as atividades das enzimas E importante distinguir entre a equagao ce Michaelis-Menten & «© mecanismo cinético especifico er que ele se baseia. A equagao descreve o comportamento cinetico da grande maioria dasenzi- -mas, e todas as enzimas que enibem ume depenidénciahiperbx- Tica de Ve em relagaoa(S] so denominadasenzimasqueseguer> a cinética de Michaelis-Menten. A regro prética de que Ki= [S] ‘quand Vy=4 Vi (Eg. 8-23) € vila para todas asenzimes que seguer a cinetica de Michaelis-Menten (a maioria das excegdes 4 cinetica de Michaelis-Menten sio as enzimas reguladoras, dis- cutidas no final deste capitulo). Entretanto, a equagdo de Mi- chaclis-Menten nao depende do mecanismo de reaga relativs- ‘mente simples, de duasetapas, proposto por Michaelis e Menten (Eg. 8-10), Muitas enzimas que seguem 2 equacao de Michaels- Menten tém mecanismos de reagio muito diferentes entre si, € enaimas que catalisam reacdes com seis ou oito etapas identifi civeisfreqientemente exibem 0 mesmo comportamento ciné- rica de estado estaciondrio, Mesmo considerando que a Equa | Adendo 8-1 ‘Transformacées da equacao de Michaelis-Menten: © grafico dos duplos reciprocos A equagio de Michaelie-Menten v= Vaal ‘mitir uma determinagao mais acureda dé Vu Que pode ser obtida apenas aproximadamente pelo gr Fico Vo versus (5) (veja Fig. 8-12]. ‘Outras transformagdes da equasio de Michae pode ser transformada algebricamente em equagses ‘que sio mais tis no teatamente grafico dos dados cxperimentais, Une transformacdo comum € obti 4a simplesmente invertendo-se os dois lados da cequagae de Michaclis- Menten 1 KeAlSh V5 7 Veal Separando-se os componentes do nurnctador do lado dircito da equacio obtémse He Rp yy 181 Va Vind] Vaal] (que pode ser simplificada para: Ne M cp Vo Vinal S| Vina tsa forma da eguagao de Michaelis-Menten @cha- ‘mada de equacto de Lineweaver-Burk Pata as en- times que obedecem a equagio de MichactiMen- ten,o grfica de 1/¥, versus [8] (geiticn des “du los reciprocos” de Vy versus (S) que wsarnos ate gota) representado por tums Tinh cea (Fig. 1). So Haha tems uma inlinagd0 de Ky/Vinaw um in tercepto de L/Vina no eixo de 1/Vj € um intercepto de -V/Kqno exo de VS]. representagio dos ds los reciprocos,sambém chamada representaan de Tineweaver-Burk, tem a grande vantager de pet- lis- Menten tem sido deduzidas, cada uma apresen- tando alguma vantagem particular na andlise de tacos de cinética envimstica (veja problema 11, pau. 223), (© gerifico dos duplos seefprocos para velocida des de reagoes envimticas ¢ rico wil na diferen- cacao de diferentes mecanismas de reagae enzions tica (veia Fig. 8-14) € na anise de inibidores de cenzimas (veja Adendo 8-2), Figura 1 ~ 0 gttico dos cuplos reciprocos de Uinewes wer Burk202 40 8-23 € verdadeira para muitas enzimas,a magnitude e 0 sig nificado real de Vig ¢ Ke poder variar Ge uma enzima para outea so € una limitacdo imporante do modelo do estado estaciondrio para a cinética enzimntics. Vig ¢ Ky $40 parkme- ines que poder ser abtidos experimentalmente para qualquer enti, mas mesmo asi eles Farnecem pai informa oe bre o nimera, velocidade ou a natureza quimnica das ecapas dliseretas da reagdo, Nao obstante, a cinética de estado esta- cionario representa aTinguagem-padeo peda qual as eficigncias > K, centao Kn = kl Em autos casos, ks eK slo comparsveis ¢ Kx per rmoneee como uma fungi mas complexa das ts constantes de velocidade (Eq 8-24). Netse caso, a equncio de Michaelis Menten e o comportamento caracterstico da saturecao da en ima ainds sa@ vélidos, mas 0 Kj, nao pode ser considerado como uma medida di afnidade da encima pelo substiato, Ain- dda mais comuns s40 0s casos em que a reagao ocorre por meio de etapas multipfas apis a farmagao do campers ES. O K,, entio se orma ura Fungo muito complesa de muitas constan- tesde velocidad ‘Tebela 86 ~ Velores de Kn iguiras enzimas e substratos Enema Substrate eto) Catal WO: 2 Mecogunase cere] ATP oa Doglicose 05 irutose 15 devdiae carica HCO; Fo Qumatiesna Giettvosivigicna 108 banzotresinamida 25 galactosidase buactose a0 Teonea deseatese ——_Lteonine 50 A Vy também varia muito de uma engima para outra. Se tuma enzima reage de acordo com o mecanismo de duas etapas Michaelis-Menten, Vs, & equivalence a hy(F,, onde k; &a etapa limitante da velocidade. Eniretanto,o ndimero de etapas de rea- sao € a identidade da(s) etapais) imitante(s) da velocidade pode uma situagie muito comum ne qual e liberagio do produto, variar de enzima para encima. Por exermplo, considere EP +E 4B, ¢ limitante da velocidade, Nos instantes iniciais de reagao (quando a |P| & baixa), a reasio global pode ser deserts pelo esquema ww Neste caso,a maior parte da enzima etd na forma EP em conde es de saturaja0 € Viuy = KC & iil definir uma constant Iai geval, as para descrever a yelocdade limi quer reago catalisada por ma encima em cond G0. Se exstirem viris eapas na reagdo enzimaticae uma das for vsivelmentelimitante da veloidade; kia Gequivalente cons tante de velocidad da etapa imitante. Para a eugao da Equagio 8-10, fay = ks Para a reagdo da Equagdo 8-25, ky = ky. Quando varias tapes so pazcialmentelmitantes da velocidade, ky pode se transformar em uma fungio complexa de vias das constantes de velocidade que deiner cada etapa individual da teacio. Np cequagto de Michaelis: Menten, ky = Vau!(E,] €4 Equacao 8-8 forma ex Bs 26) 15) A constante kay &u 4 constante de velocidade de primeira or mcuja unidade €0 reciproco do tempo, Ela tambem échama dda de nimero de renovacio c €equivalente ao ruimero cle mole culas do substrato convertidas em produto por uma dnica mo- Ieeula da enzima, em uma dada unidede de tempo, quando a enzima esti saturada pelo substrato, Os miimeros de renovagae de wirias enzimas sio apresentados na labela 8-7 Tabela 8.7 — Numero de renovagdo (Kun) de algumas enzimas Enzima Substrate a Caielase 1.0: “40. 600.000 Anctase cerbvice HCO; 400.000 Acetlcolnesetase ‘Acetcalina 140.00 Flactamase Berallenicina 2.000 Fomaeave Fumarate 00 Frotana Recs mi ATPate) ATP oe Os parimettos cinétcos kay ¢ Ky geralmente so \iteis para © estudo e a comparagao de diferentes envimas independente ‘mente de seus mecanismos de reacao serer staples ou comple x05, Cada enzima apresenta valores btimos de ky € Ky que rele tem 0 ambiente celular, a concentragao do substrate norma: ‘mente encontrado i vive pela enrims ea guimica da reagao que est sendo catalisada, Os pardmeitos Kus € Koy permiiem avaliar a efieéneta cata litca das envimas, mas esses pardinetros isoladamente sio in suficientes para essa tarela, Duas enzimas que «8es diferentes podem tera mesma kas (miimero de ren0vagio), embore as velocidades das reages néo-catalistdlas possam set diferentes. Dessa forme, 0 aumento da velocidade provocade pela enzima pode ser muito diferente, Experimentalmente, © Ky,de uma enzima tende a ser similar & concentragio celular do seu substrato, Uma engima que atus sobre um substrato pre sente em uma concentragao muito baixs no interior da eélula tenderd a ter um Ky muito menor que aquela que atua sabre lum substrato que & mais abundanie A melhor maneira de se comparar a eficiéncia caalitca de dlferentesenzimas ou o mimeo de renovagao de diferentes subs- tratos para uma mesma eneima € analisara relagdo Aa/K para asduas reagoes. Esse pordmetro, que algumas vezesé denomido constante especifica, £4 constante de velocidade para acon- versio de E + Sem E +P. Quando (5) << Kya Equayio 8-26 se reduz forma 27) Neste caso, como V, depende da concentracéo de dois reagen: tes, [Fj] € [ela é uma equagio de velocidace de segunda or- dem € a constante fy! € ima constante de velocidade de reagao de segunda ordem com unidades Ms, Existe um li rite superior para KK, imposto pela velocidade com que E Sse difundem ery uma solugo aquosa. #sve limite, controla do pela difusio,€ da orcem de 10 a 10° M15", em ras apresentam 0 valor de Kay prdximo a esse intervalo (Tabela 8-8), Tais enzimes sio consideradas cataliticamente pereites. Note que diferentes valoves dle Ky € Kn poder produ- zirrelagdes maxims Muitas enzimas catalisam reacbes que envolvern dois ou mais substratos Jivimos como a [S]afetaa velocidad de uma reacao enzimati- ‘a simples (5 P) ma qual participa apenas uma molécula de suistrato. Enietanto, em muitas reagdes enzimatica, cuas (a -gumas veres maisde dias) moléculas de substeates diferentes se ligam 3 exvima e participam da reagdo, Por exemple, na teagie ‘atalisada pela hesoguinase, 0 ATP ea de substeato co ADP ca glicose-6-fosfato si0 0s produtos ATW-+ icone —+ ADP + glcose-6-fosato 1 as molécalas ‘As velocidades dessas reacdes com dois substratos também po dem ser dnalisadas pela abordagem de Michaelis-Menten. A he- soquinase tem um K,, caracterstico para cada um dos seus dois substratos (Tabela 8-6}. ‘As reagoes enzimiticas com dois substratos usualmente en- volvm a transferéncia de um étomo ou um grupo funcional de um substrato para o out. Tals reagies ocorrem por meio de ‘um ou vérios caminhos diferentes. Eun alguns casos, ambos os substratos esta Tigados 2 encima so mesma tempo, em algun, insante da reagdo, formando um complexe ternstio nao-cova- lente (Fig. 8-134). Esse complexo pode ser formado pela ligagie dos substratos em uma seqiiéncia ao acaso ou em uma ordem ‘especiica. Nenhum complexo temiério € formado se 0 primeire substrato ¢ convertide em produto e se dissocia antes ¢a ligagio do segunde substrate. Lim exemplo ¢ © mecanisme chamade pingue-pongue ou de dupla-troca (Fig, 8-135). A cinstica do estado estacionsrio frequentemente pode ajudar na distingzo entre essas possbilidades (Fig. 8-L4) 203 engi ensimitica Order 4 esto , ® BRB 4 ‘ Bs Ordenado Histo) BS 2 BS, SBS EER ‘) i. no RID 4 Aa BS Bs en ee es Ee, ® Figura 8.13 - Mecanismos comuns para reagées com dois subs- tratos cetalisados enzimaticamente. Err (a) erzima e ambos 0s Sulsiatos se unter para Teumar urn comploe® tenave Em uma ae gio ordonsas, 0 substato 1 deve ser igado antes, para que o 30> trata 2 posse se gar piedutvamente. Em uma essocaclo 30 aa%0, 0S ‘substrate poiern se ligar em quaiquor orem, Em bl, um comolexe enna substrato se forma, um produte éfermado, a enerna mecifca ta fora in segundo complexo com uma molecula de un auto subs trata, € um segurde produto e Farmaco, regenerando a enzimaIvte. © Substata | pode transfer um grape funcenal para a enzia (argh nando @ fori mecificada tovaientemente, F, que subeequarte. mente transterda para 0 substato 2 Esse 6 0 mecanismo chamedo pingue-pongue ou de dupa-roca {A cinética de estado pré-estacionario pode fornecer evidéncias para etapas especificas da reagao |Acinética enzimitica foi introduzida como um métedo impor: tante para estudars etapas de ma reagao enaimatica, bem come foram mencionadas as limitaybes dos pardmetros cinéticos mais = fornecem tal invormasao, Os dei parkmetros ex importantes fornecids pela cinética de esta to estacionsrio s40 0 kg € 0 KK. AS varies destes pard- imetroscom a variagio do pH eda temperatura podem fornecer informagies adicionais a reapeito das etapas de uma reagio, No caso de rages com dois substratosacinética do estado estacio~ nirio pode eiudar a determinar se durante a eagio € formado tum complexe ternario (Fig. 6-14). Um guadro mais completo geralmente requer métodos cinéticos mais sofisticados, que v80 alem dos objetivos de um texto introdutério, Assim, sera intro duzida, de forma muito breve, uma das mais importantes abor dagens para se estudar 0 mecanismo de uma reagio, 3 cinstica de estado pré-estacionicio, Enzima ‘Substrate tay eaticolnesterase ‘Acaticoina ex 1 arias cabonica co, sax Heo: 15x10 Catalase Ho, ant roconase rotanicoa, 2am Fumaese Fumarato rsx 08 Malato| 36x10 rtactamase Beralpriciina 20-10 210° Tete Fonte: Fest, A (1993), Svactue and Mecanini roti Scene, 166, Freee and Company, Newer204 La © lan Figura 8-14 - Andis cindtica do estado estaionério para rea- (es com dot substrator. Nests gro don hin recipe ea Reendo8-D,aconcentiacio do sbstato | évativel enquantoa cor Ceritaio do subsea 2 € manila cnstante, bs € repel pata tc valores oe [grand varas feiss sapa-adas A nts Cesas ‘ees nea» fermagéo de um compte Tendo na eae (al tas Barallas mica qe a Teaco ece por na a do tbe niger fue 04 cupl-rca te) ‘Uma descrigao completa de ume reagao catalisada por eni- mas requer medidas diets ds velocidades das etapas indivi- luais da reagao, como por exemplo a medida da associagzo da cenzima e com 0 substrate para formar o complexe BS. E duran= lee estado pré-estacionirio que as velocidades de muitas etapas dda reagdo pociem ser medidas independentemente. Ascondigoes, dda reagto sio ajustadas pata faciltar @ medida dos eventos que ‘ocorrem durante a transformagio de uma tiniea molécula de ssubstrato, Uma vez que a fase de estado pré-estacionsrio em ge. ra € muito curta,frequentemente sie necessirias tScnicas espe- cializadas para efetuar uma mistura muito rapida dos reagentes, e aamostragem que se segue. Um dos objetivos ¢a obtencso de tum quadro completo e quantitative das mudangas de energia urunte a reagao. Conforme mencionado anteriormente, 2 velo= cidade das rezaes eo equiltbrio esto relacionados com as mu ‘éangas de energia livre que acorrem durante. reagao, A medida a velocidad das etapas individuais de uma reagae revela como. a energia € usada por uma enzimna especifca, o que representa ‘um componente importante do mecanismo global da reagio. Em um grande niimero de casos j é possivel medir a velocidad de cada uma das etapas individuais de uma reagio enzimética ‘que apresenta varias ctapas. Alguns exempls da aplicagio da cinetica de estado pré-estacionatio estio incluidos nas descr ‘oes de enaimas especificas, ainda neste capitulo, ‘As enzimas slo sujeitas a inibigo (Os inibidores das envimas to agentes molecules que interfe- rem com a catilise, diminuindo ou interrompendo as reacdes enzimaticas. As enzimas catalsam virtualmente todos 0s pro- cesios celulares endo é surpreendente que os inibidores das en- rimas estjem entre 08 mas impaftantes agents farmactuticos cohecidos For exernplo, ¢aspirina (csi) inibe a en- zima que catalisa o primero passo na sintese da prosagandi- 1a, compestos envolvidos em muitos proceiosincuindo al guns que produzem a sensagao de dor. © estudo dos nibidores das enzimas tem Forncido valiosasinformagoes a respeito dos, inecanismos envimiicese tem stdad a defn algumas vas mmetabslicas.Existem dus grandes classes de Inibidores enz- initicos: reverts ireeversivcis A inibicao reversivel pode ser competitiva, incompetitiva ou mista Um tipo comum de inibidor reversivel & chamado competitive (Fig, 8-152). Um inibidor competitive compete com o substra- to pelo sitio ativo da enzima. Enquante o inibidor (1) ocupar 0 | vw Q (1) Tibigi competiviva () Inbigto incomperiiva | I C° ~ G Qe (6) Iaibigho mista Figura 8-15 ~ Trés tipos de inibicso reversivel. a} Os inbidores com paltvas se fgam a0 centro atva de enema (bl Os inbxres incompel- {wor s0 gam er 1)005 Gterentes Go Sto atxe, mas ee igam 2pens a0 complero ES. Ké a constant de equlibvio para a lgacéo 69 iniodor ‘encima, enauenta &' € 3 consianie de ecuifora para a Iigagan do Inibdor a6 comple ES (| Os Inbisoras mistos se hgam en regée= diferentes do sito atvo, mas poser se liga’ tanto w E como aS,centro ativo da enzima, ee impediré a ligagan do substrato. Os inibideres competitivos so compastos cujas estruturas mole~ culatesfreqientemente embram ado substrato € que se combi ma para formar um complexe El, sem contudo propiciar a catilise, ACE mesmo associagdes répidas desse tipo afetario negativamente a eficifneia da enzima, Levando-se em considerasao a geometria molecular ée inibidor, que é parecida coma do substeato,é possivel obter conclusdes sobre quais par tes do substeato normal s ligam & enzima. 8 inibigio competi- tiva pode ser analisada quantitativamente pela cinetica de este ddoestacionério, Na presenca de um inibider competitivo,a equa sho de Michaelis-Menten (Eg. 8-28) fica: ‘ake + [3] te) onde isticas importantes da inibi ‘observado na preseage do inibidor), determinado experimentalmente, € freqlientemente denominado &, “sparemte” Come o inibicor se liga reversivelmente & enzima, a com: petigdo pode se corn favordvel ao substrato pelaadigio de mais, Ssabstrato, Quando a [S] € muito maior que e [1], a probabilida, Ge de wma molécula do inibidor se igar & enzima ser minima e a reayio exibirk uma Vny. normal, Entretanto, a [S| em que Vo=! Vac © Knaparente,estara cumentada de um fator ama presenga do inibidor. Esse efeito no K,aparente, combinado ‘com a cuséncia de um efeito em Vaac€ diagndstico da inibieao ‘competitive ¢ faciimente revelado no grifico dos duplos recf- procos (Adendo 8-2), A constante de equilibrio para a ligaeao do inibidor, Ky pode ser obtida a partir do mesmo grafico, ‘Uma terapeutica baseada na competiio pelo centro ativo & \wada para tratar pacientes que ingeriram metanol, um solvente ‘encontrado em misturas anticongelantes. A desidrogenase alco~ ‘lca do figado converte 0 metanol em formaldeide, que é prejt~ dicial a maioria dos tecidos. cogueira é um resultado freqden~ te da intoxicagzo pelo metanol, porque os olhes sto particular- ‘mente sensiveis a0 formaldeido. 0 etanol compete eietivamiente ‘om © metanol como tum substrate alternative para a desidro= genase sleodlica. O efeivo do etanol é muito parecido com o de ‘im inibidor competitive, com a ressalva ce que 0 etanol tam= bbém é ur substrato e a sua concentragao dimmu com 0 decor rer do tempo, a medida que enzima o converte em acetaldeido. Assim, terapia para o envenenamento com metanol 4 infusao endovenosa gradual de etanol, em uma velocidade que mante: nha uma concentragio controlada na corrente sangiinca durante varias horas, Iso diminui a formagio do formaldeido, reduzin ido o perign, enquanto os rins excretam 0 metanol pela urina sem maiores dans. As duas outras formas de inibigao reversivel, incompetitiva ‘emista,sdofreqentementedefinicas em termos de enzimas.com tum dnico substrato, mas na pratica tém sido observades apenas ‘com enzimes que tém dois ou mais substratos. Um inibidor in competitive (Fig, 8-15) se liga em um sitio diferente do sitio. ativo do substrato, porém, diferentemente do inibidor competi tivo, liga-se apenas ao complexo ES. 205 Na presenca de um inibidor incompetitiv, a equagao de Michaelis-Menten se alters para ai sn ConJorme deserito pela Equasio 8-29, em altas concentragdes do substrato, Vise aproxima de Vp Assim, um inibidor in competitivo diminui a Vue O valor do Ky, aporente também diminui porque a [S] requerida para aleangar a metade dV, diminui de um fator a Un inibidor misto (Fig. 8-152) também se liga a um sitio diferente do sitio ativo do substrate, mas ele pode se ligar tanto, AE como a ES. A equacae que desereve a inibigio mista € Via (1 ws (e-30) ey a5) onde o. © a sio definidas como anteriormente. Um inibidor isto geralmenteafeta tanto 0 Ky, como 2 Vij.O caso especial em qued.~ a’, raramente encontrado na pratica,édefiniioclas- sicamente como inibigaa nao-competitiva. Analise 2 Equagao 19-30 para perceber por que um inibider nao competitive afta a Vay mas nao 0 K, 'Na pratica, a inibicdes incompetitiva ¢ mista sio cbserva- thas somente para enrimas com dois ou mais substrates (por exemplo, 8) € 2), € esses substrates sio muito importantes ne analise experimental de tais enzimas, Se um inibidor se liga 20 sitio ocupado por §, ele pode atuar como um inibidor compe titivo em experimentos nos quais a[S,| € variavel. Se um inibi- dot se liga go sitio normalmente ocupado por S, ele pode atuar ‘como um inibidor misto ou como um inibidar incompetitivo de §;, Os modelos de inibiga0 atuslmente observados depen dem do fato de as ligagses de Se S;serem ordenadas ou a0 aca 59, Desse moda, pexle-sedeterminar aordem com que esses subs: tratos se ligim ao sitio ative os produtos sao liberados. Fre= ‘qhentemente, 0 uso de umm das produtos da reagio como um inibidor € particularmente informative. Se somente um dos dois produtos da reagio estiver presente, entao a reac ‘ocorrerd Contude, um produto geralmente se ligaré em alguma perte do sitio ativa atuando como um inibidor. Os estudos de {nibigio geralmente sio elaborados e podem proporcionar uma descrigao detalhada do mecanismo de uma reagao bssubstrato. {A Inibicdo irreversivel 6 uma ferramenta importante na pesquisa das enzimas e em farmacologia Inibidores ireversveiss40 agueles que se combinam com um grupo funcional na molécula daenzima ou dstroer ou ainda formam uma assaciacdo covalente bastante esivel. A Josmagao dle una ligagdo covalente entre o inibidore a enzima é mito ‘omum. Os indore ireversiveis representa uma ferramen ta muito tl no estudo do mecanismo das reagdes. Os am nos- «dos essencais do sitio tivo cue apresentam funsbes cal ‘ts importantes feqientemente sto ideatificados por meio da determinagio do aminoacido que esta ligado covalenterente 20 inibidor depois que a enzima ¢ inativeda. Um exernplo est smostrado na Figura 8-16. {Uma classe especial de inibidores irreversveis dos inibi- ores sucidas. Esse compostos so relaivamente pouco ceai- vos ate se ligarern ao sitio ativo de um e206 q Hi w ° Hs I . 3" | eeepc le, 25 meso le we , wcP en, ca burp Figura 8-16 —nibigso ineversivel. 4 reacae da quimotmpsna com o dizopropitiuorfotato (DIP mite rrever Sivemante 3 enama, Isa levou 8 conclasdo de que o Ser" € a resduorchave de serina 0 Sto atwo ds quinn ‘ipsr Adendo 8-2 " Testes cinéticos para a determinacao dos mecanismos de 0 grifico dos duplos reciprocos (veia Adenclo 8-1) ‘oferece uma forma fie de determinat se um inibi or enzimatico 8 competitive, incompetitivo ou isto, Dois conjuntos de experimentos de determi nacio de velocidade devem ser realizzdos e, em ambos os conjunios, a concentragao da enzitma € ‘mantida constante. No primeiro conjunto,a[S]ta~ ‘bem & mantida constante, permitindo a medida do feta do aumento da concentzagae do inibidor [I] na velocidade inicial Va(nao mostrad). No segun= do conjunto,a J] € mantida constante, mas @ [SI varia, Os resultados sto langados em grfco na for- sma de 1/¥, versus 1S} ‘A Figura | mostra um conjunto de graficos dos uplos reciprocos, um deles ebtido naa auséncia da Inibidor ¢ deis outros ebtidas em duss concentra ‘oes diferentes de um inibidor compettiva, O au mento da [T] resulta ev uma femilia de retas com incereepto cemum no eixe 1/¥y mas com inclina- ‘es diferentes. Como o intercepto no cine V/Vo€ igual 1/Vjyqobserya-sequea Vina permaneee inal terada na presenga de um inibidar competitive, Ito & inependentemence da concentragao de um in biidor competitive, uma concentragio sufciente mente alta do substrate sempre ceslocaré 0 inibi lor competitive do sitio ativo ds enzioa, Acima do irifico estd mosttida o rearranjo da Equace0 8-28, fa qual o grfico € baseado. O valor de a pede ser Figura 1 ribcso competiiva, bigéo Rentio um antigo que ‘liga forsemente a0 andlogo do estado de transi 4a pade catalina S—> POs anticorpos munoglo- bulinas: wei Fg, 7-23) soos principas partcipan- tes da resposta imunoldgica, Quando um anélogo doexado do transiczo € empregado como uma pro- teina fgante de epitope pata estimular a produyio de amticorpos os anticorpos que se ligam a ee sio catalsadores potencias da regio correspondent. Exido de teamgto K Ne i os Andlogo (storato) 0 use de“unticorpos catalitices”iicielmente suge- ‘ida por William B Jencks, em 1969, tomnou-se pri tien com 0 desenvolvimento de técnicas de labors ‘oro para produzir anticorpos idénticos que se i gam 4 um dinico antigeno especifico (anticorpos monoclonals, veja Capitulo 7). “Trabalhos pioneiros nos aborstorlos de Richard Lerner Peter Schultz resultaram no isolamenta de alguns enticorpos monoclonais que caalisann ahi sdrobise de ésteres ou carbonstos (Fig, 2). Ness re: 408, 0 ataque da gua (OH) a0 catbono da carbo: hil proxiuz um estado de transigao tetraédrico, no ‘qual uma carga parcial negativa se deserwolve no ‘oxigénio da carbonila. Os fosfonatos mimetizam 2 estrutura ea distribuigao de cargas dese estado de ‘ansigao durante a hidrsise de ésteres, comando- 05 bons antlogos do estado de transicao, Por isso, 05 fostonatos so usados nas reagdes de hidrélise de carbonatos. Os anticorpos que ligam fortemente 0 fosfonato ou 0 fesfato acsleram as reagoes de hi- Urélise do éster ou carbonate correspondents, a fordem de 10! a 10% Anilises estruturais de alguns esses anticorpos cataliticos mostratam que as «3 deiaslateras de alguns aminoacidas caralitcos es- {Go arranjadas ce tal medo que interagem cam © substrato, principalmente quando cle se encontra no estado de transiio, (Os anticorpos cataliticos goralmente nao apre- semam a mesma eficigncia catalitics das eraimas: ‘enuretanto, eles estio comegandlo a ser utiliza na inddstriae em medicina. Por exempl, os anticorpos ‘ataliticos desenvolvidos para degradar a cocina es 10 sendo pesguisidos como ausiio importante no ‘ratamento da dependéncia de cocaina. Figura 2 ~ Estas de wansiga exporaeos para a6 ve (Ges de hile de estres ov carbonates, Detvados de {osfonato eiosfato representem bons arlogos do eae ode transi destasreardes, espectnamerte, + + Produtos estado de transgao o APTA Sno, Analogo (osfato)210 Quimotripsina, 4 quimotripsina {M, 25.000) & uma protease, uma enzima que eatalss a hidrolise de ligagoes peptidicas, Essa protease ¢ especifica para quebear igagoes peptidicas adjacentes 2 residuos de aminodcidos aromiticos (veja Tabela 5-7). A es- trututa tridimensional da quimotripsina & mostrada na Figara 2-18, na qual estzo enfatizados os grapos funcionais do sitio tivo. A reagie cataliseda por essa enzima ilusita © principio da ‘abilizagao do estado de transigao etarnbér fornece um exem= plo clissico de catilise dcido-base geval ¢ catdise covalente. A quimotripsina aumenta a velocidad de hidrélise da liga «fo peptidica de um fator de pelo mencs 10°. A enzima no ea talsa 6 ataque dircto da agua sobre a ligacao peptidica, Em vez disso, ocorte a formagao de urn intermedisrio covalente ente, acil-enaima, Desse modo, essa reagao tem cua fase prin cipais (Fig. 8-19). Na fase de acilagao, a ligaeao peptidica & que- brada e uma ligacao éster 6 formada entre o carbono da carbo- nilae aenzima, Na fasededesacilacto,aligage der éhidrolisads ceaenzima miowacilada € regenerada. Na fase acilagao0 nucles- filo € 0 exigénia da Ser", Normalmente, a hidroxila dt serina ‘std protonada em pH neutra, masa Ser" est ligada por ponte dd hidrogénio a His”, que também ests ligade por ponte de hi- drogénio ao Agp™:. Esscs trés aminovicidos sio frequientemente Cadeia A Cadeia 8 © Figura #18 Estrutura da quimotripaina. (a) Represortacio da estutura priatia mosttando as igacbes cissueto& os resis Catilse. A prota conaste de trés codes poiepticicas igadas por pores disullelo. A numeragio dos rescues 14, 15.1 nbo mostedos) eta exaliaa na Fite 8-31, Os trino¥ cos do saat ex eg apis indo ua sper, A fence om que a cadets llera da arinaacca aromatico Co substato eet do certo tivo, incuneo a Ser", His © Aso, sio mestiados em verelho, O abel desses rescuas ra calse esta stad na Fig cruciate renovagao da encima & Trmtads pela velocdade co fase de desaciacéo, mais ena, Mexoquinase. Este é ume enzime bissubsteato (M, 100.000) que catalisaainterconversio de picose e ATP em glcose--fo fato € ADP.O ATP eo ADP ligam:se as enzimas como comple 10s do ion metlico Mg’. A hidronila do carbono 6 da glicose (para aqualofosfato ydo ATP € wansferido) ésimilar gua em reatividade quiica,e2 gua entra livremente no sto ativo da cenzima, Mesmo assim, a hexoquinase diserimina a glicase da gua, send a plicosefavorecida por um fator de 107 gs AID 4 Gr0roF 4 4 it HOH Mgsape + 7 Givore wn no obn Glicose 6: fofata A hexoquinase pode discriminar entre gli vido as mudangas conformacionais que ocorren do 0 substrato correto se liga ao sitio ative (Pig. 8-21). Assim. hexoquinase representa um excelente exemple de ajusteinduzido. see a gua de- na enzimaquan- Figura 8-21 ~ Ajuste Induzido na hexoquinase, As exremidases 62 hnexoquinase, um enzma em forma de U (a), tam como pra devo a uma mudanca conformeciona indueie pela igagdo da Dglcase er inet (.Quando a glicose nao esta presente, a enzima est em uma con- formagao inativa, com as cadeias laterais dos aminadcides em lama posigio inadequada para a reagio, Quando a glicose (mas rndo a Sigua) e 0 ATP + Mg se ligam ao sitio ativo, a energia de ligagao derivada dessa interagto induz uma mudanga conforms- onal para a forma eataliticamnente ativa da hexoquinsse. ssa conclusio tem sido reforgada por estudos cinéticos. A xilose, um agiicar de cinco estbones estereoquimicamente s- milar 2 glicase mas com um carbono a menes, ligase & hexo- quinase may ern uma poxigio onde nao pode ser fosforilada, Desse modo, a adicio de xilose & mistura de reagio aumenta a velocidade de hidrolise do ATP Evidentemente, a ligagao da xi- lose ésufciente para induzir uma mudanga na hesoquinase para 41a conformasao ativa e, desse modo, a enzima &“enganada’, fesforilando a sgua. \P ef I spon HO-C—H HOH Ht onl u—ton CH.0K Hoon HOH Xilose licose A teagi da hexoquinase tambem iustra ue a especie de da enzima nao 6 apenas um simples caso de lzagio de um composo ov outro. No caso da hexoquinass a especifcidade nto €ciervada na formasao de complexo ES, mas sim nas ve lecdades relativas das tapas cataltcas subseqdentes. 4 dgua nao ¢ excluida do centro ativo, mas @ velocidade da reagdo au- sents considersvelmente na pretenga de um grupo eceptor de fesfto (glcose). © ajusteindaido € apenas um aspecto do aecanisme cataltico da hexoquinase: do mesmo modo que & quimotripsina,« hexoquinasestilia vris estates catalt- Ces. Por exemplo, 0% residuos de aminoicides do centro avo (aquelesposiciorados pelas madanyas conformacionas rs. tants da igaéo do substrato)partcipam de uma cate dci- do-base geral ¢ da estabilizacdo do estado de transi¢ao. Enolase. Esta encima catalisa uma etapa da via glicolitica (Ca- pitulo 15), a desidratarao reversivel do 2-fesfoglicerato a fosto- ‘nolpiruvato: ap eG ¥ Lol sales I H-c—0-Ho 6-0-F0 +110 HOCH: O cH, 2 Fosfogliceato Fosfoenolpiresato A enolase de levedura (M, 96,000) & um dimero com 436 residuos de aminodcidos por subunidade. A reasao da enolase ‘iustta um tipo de catilise por fon metéico e proporciona um «xemplo adicionel de catilise écido-base gerale estabilizagao do éstado de transigio, A reacio ocorre em duas etapas Fig. 8-22). O residuo Lys" atua como um catalisador basico geral, retin. doum préton do carbone 2 do 2-fosfoglicerato na primeita eta- pa. 0 Gin atua como um catalisador dcido geral, doand um proton para 6 grupo —OH que é removido da molécula na se- sgunda etapa, 23 proton do carbono 2 do 2-fosfoglicerato nao é muito de doe, portanto, ele nso ¢ removido rapidamente, Entretanto, 10 sitio ativo da encima, 0 2-fosfoglicerato é submetid 2 fortes interagdes idnices com dois ions Mg™ ligados (Fig. 8-22b), 0 que torna o carbon 2 mais éeido (dimninuindo seu pK,) ¢ mais {cil de se abstrair, A formagac de pontes em outros residues do. centro ativo também contribu para @ mecanismo global. As vrias interacies estabilizam cfetivamente tanto © intermedié rio enolato como o estado de transigao que precede @ sua formacao, [Nao foi incluide nestas discusstes de mecanismes enzima ticos a contribuigéo especial des cocnzimas na atividade cal tica de muitas enzimas. A fungdo das coenzimas & quimicamen: te variads, e elas serao descritas 2 medida que constatadas na Parte II deste live, Enzimas Reguladoras \No metabolismo celular, grupos de enzimas trabalham em con. junto em vias seqUienciais para desenvolver um dado processo Imetabolico, tal como a conversio da glicose em lactato no mis: culo esqueltico por meio de varias reagdes ou a sintese de um aminodeido 2 partir de precursores mais simples em uma celula bacteriana, por meio de vérias reagdes. Nesses sisters enzima- ticos, 0 produto da reacdo da prinicita enzimna torna-se 0 subs- trato da proxima enzima, ¢ assim sucessivamente ‘A maioria das enzimas em cada sistema segue os padroes ineticos jf descritos. Entretanto, em cada via metabsica existe pelo menos uma enzima que determina a velocidade de toda a sequéncia, porque ela catalisa a reagao mais lenta ou a reagéo limitante da velocidade. Além disso, essas enzimas reguladoras tém sua atividade cataitica aumentada ou. diminuida er res posta a determinados sineis. Ajustes na velocidade das reagoes catalisadas pelas enzimas e conseqlientemente ne velocidade da sequéncia metabolica permite célula zcertaras mudangasssas nevessidades de energiae de biomoléculas requeridas para cres cimento e teparo, [Em muitos sistemas multienzimsticos, a primeirs encima da sequencia & uma enzima reguladora, Catalisat, ainda que so- mente algunas reagoes de uma via metabdlica que leva a um produto desnecessirio, desvia energia e metabdlitos de proces s0s mais importantes, Fortanto, um lugar excelente para regular lum via metabslica é no ponte de comprometimente da sequen cia metabolica. As outrasenzimas na seqUéncia esto usualmente presentes em quantidades que fornecem um excesso de ativida- de catalitica. Geralmente elas promovem suas reagbes tio rapi- damente quanto seus substratos so disponibilizados a partie das seagies precedentes. ‘AN atividade das enzimas reguladoras € modulada de virias ‘maneiras. Existem dvas grandes classes de enzimas reguladoras has vias metabélicas. As enzimas alostéricasfuncionam por meio da ligagio nao-covalente reversivel de compostos reguladores chamados moduladores alostéricos, que geralmente sio peque- ‘hos metabslitos ou co-fatores. Outras enzimas sie roguladas por meio de uma modificagao covalente reversivel. Ambas as classes de enzimnas reguladoras tendem a apresentar subunidades mil- tiplas e, em alguns casos, os sitios reguladores ¢ o sitio ative es- ‘a0 em subunidades separadas. xistem pelo menos outros dois mecanismos de regulagao da atividade erimitica, Algumas enzimas sto estimuladas ou inibidas quando estio ligadas por outras proteinas regulatrias, Outras sto ativadas quande segmentos peptidicos so removi dos por meio de uma clivagem proteolitica, Diferenterente da214 {LFouogiceratoligade & enolase (a) Figura 0-22 - As duas etapas da reacéo catalisade pela enola- se. a) Mecanismo Ge tensformacze co 2-festoglearate em testo ‘enojpiutato oda erclase. 0 gupe carbonla do 2-ostcglcerato ¢ ‘vordenado par eis (ors magnesio no centro avo, Umm ror0n € remoyda por melo de ura catalen basics geral (ye) O terns dare endco restarts € esabiizado pelos dos ions Mg A elm: hagao subsectente do —OM e facade pay tma catalsa acida go Fol(Glv |, 0 supstato 2fostoghcerato er relaczo a0sions”nag néso, Lys! e Glu no centr avo da enolase. Os atomos de H hha S20 mostados. Todo os atoms do onigava no 2-losfog cer {a consam om azul dao; o festore en laana regulacao medida por um efetor a regulagao por meio de uma queba proteoltica ¢ irreversivel. Exernplos importantes desses lois mecanismos s20 encontracos era procestosfsiologicos, tas como a digestio, a eoagplagao sanghinea, a as20 hormonal ¢ 6 processo da vise. (© crescimento celular e a sobrevivencia dependem do use iiente dos recursos disponibilizados peas enzimas regulado ras, Nenfuma regra nica governa a ocorréncia dos diferentes tips regulagio nos diferentes sistemas. De um certo modo, a regulagdo alostéria (ndo-covalente) permite um ajuste fino das vias metabolicas que sio requeridas continuamente, mas em diferentes nivels de atividede, & medida que condigdee celilares ‘mudam. A regulayao por medificagao covalente pode ser tudo 0 nada — principalmente no caso de quebra proteolitica — ou. pode permitir mudancas tenues na atwvidede, Multiplos tipos de regulagio sao cbservados em um grande ntimero de enzimas reguladoras. © restante deste capitulo serd destinada & regula: «30 das enzimas, ‘As enzimas alostéricas sofrem mudangas contormacionais em resposta a ligago do modutador CConforme visto no Capitulo 7, as proteinas alostérias sio aque las que apresentam “outras formes” ou conformagdes induzidas pela ligasao dos modulsdores. O mesmo conceito se aplics para determinadas enzimas reguladoras, em gue mudangas confor Intermediteioenslico Fosfoenoipirusato (b) ‘macionais induzidas por um ou mais moduladoresinterconver- tem formas mais e menos ativas da enzima, Os moduladores das enzimas reguladoras podem ser tanto inibidores como estima adores. Geralmente o proprio substrato é um ativador da ena: ima. As enrimas reyuladoras cujos subsirato e modulador si0 identicos sto chamadas homorrépicas. 0 efeito¢ similar liga- io do O; 8 hemoglobina, uma proteima que no tem atividade enzimatica (Capitulo 7). 4 ligagao do substrato causa mudan- gas conformacionais que afetam a subseqiente atividade dos ‘outros sitios ne proteina. Quande o modulador € uma molécu tn diferente do substrato, a enzima é chamada heterotrpica, Eimportante que 0s moduladores alostéricos nao sejam con- fundidos com os inibidoresincompetitivose mistos. Embbora estes tltimos se liguem a um segundo sitio na enzima, eles iio pro- ‘move necessariamente mudangas conformacionais entre as for- ‘mas aiva e inativa. Além disso, 0s efeitos cineticos so distintos. Aspropriedades das enzimas aostéricas sto significanternen te diferentes das das meras enzimas nao-reguladoras. Algumas das diferencas s20 estruturais. Aléwn da sitio ative, as enzimas alestéricas apresentam um ou mais sitios reguadoes ou alas ricos para a ligagio da modulador (Fig, 8-23). Tal como 0 cen= tro ativo ¢ especifico para o seu substrate, cada sitio regulador especifico para seu modulador. Nas enzimas que apresentam vi tios moduladores geralmente existem sitios de ligagao especf «0s diferentes para cada um deles, Nas enzimas homotrépicas, 0 centro ative 0 sitio regulatério s40 0s mesmos.ubstrato a Compleno envimasubstrsto Figura 8-23~ InteragGes entre as subunidades em uma enaima alos {erica intaragbes com os inibidores @ ativadores. £0) ruta en2 ‘nas alesis, 0 so de igagdo do substrate © 08) sto) do bgacao on maduladoreseslao er subun dedes diferenes,e suburidade catal- ca ye a regulators (, respectuamente A loacza te urn morladr 1 posi (estimusdon ao 38. so especitce na suburdade requla sora € cornuncedia A siounidatle catalica por reo de uma muslance nformacenal essa mudanga alva a subunidads estaltica que passa 3 liga: o substrata (Scam ae afridade. Quando acorre a csseciacio do Modulator da subunirode regulacora, a era reverte pata sua ora Iratvo ou menos atv As eivimas alostéricas geralmente sd0 maiores ¢ mais com= ta das ‘ou mais eadeias polipeptidicas ou subunidades, A aspartate transcarbamilese, que cataisa a primeira reagio da biossintese e nucleotideos de pirimidina (Capitulo 22), apretenta 12 ca écias polipeptidicas organizadas ern subunidaces cataliticas ¢ reguladoras, A Figura 8-24 mostra a estrutura queternaria dessa ersima, deduzida de andlise de raios X. Ps ploxis ques encimas nio-alostéricas, A maioria apres 215 Acetapa requladora em muitas vias é ‘atalisada por uma enzima alosterica Em alguns sistemas multienziméticas, a encima reguladora é inibida especificamente pelo produto final da via sempre que a sua coneentragdo ex or as necestidades celulares, Quando a reacao catalisada pela enzima reguladora diminui, todas as ena ‘mas subsequentes operam em velocidades reduridas, uma vez que as concentragoes de seus substrates diminuem, A velocida- dds de produto do proce final da via 6, portanto, balanceada com as necessidads celulates. Esse tipo de regolagao & chamado Ade inibigao por retroslimentagao. O aumento da concentrasao do produto final da via basic Um dos primeiras exemplos de insbigdo alos nente desacelera tod a via a por re ttoalimentagio descrito foie sistema enzimatico de bactéria que catalisa a conversio de t-treonina em L-isoleucina (Fig. 8:25). primeira enzima desse sistema, a L-treonina desidratase,é in bida pels I-isoleucina, 0 produto da wltima reagio de via. Este é uum exemplo de inibigao alosterica heterctropica ea isoleucina € ‘um inibidor muito especifico. Nethum outro intermedisrio nes sa sequencia inibe a treonina desidratase, e nenhuma outta en: ‘da sequéncia¢ inibida pela isoleveina, A isoleucina nao se ao sitio ativo, mas 2 Um euro sft espectfico na molécula da ervina, 0 sitio regulador. Essa ligagio € do tipo nao-cova- lene e facilmente reversivel, Se a concentrasie de isolevcina dininui, # atividace da treonina desidratase aumenta, Desse modo, a atividade da treonina desidratase responce répida ¢ reversivelmente as variagdes da concentragao da isoleucina ne As propriedades cinéticas das enzimas alostéricas divergem do comportamento de Michaelis-Menten ‘As enzimas alostéricas apresentam relagdes entre Voe [S] que di- ferem da cinética de Michaelis-Menten. Elas apresentam satura fo pelo substrato quando [5] ésuficientemente grande mas, para algumas enzimas alestérieas, 0 rico de Vy versus [S] (Fig. 8-26 resulta em uma curva de saturasao sigmoidal em vez da curva hiperbolia tipica das enzimas nao-reguladoras, Embora sea pos = Figura 8-24 Duos vistas de enzima reguladora aspartato transcarbamilase.fta enzima roguladora altéica tem os otrarjos ‘alte ag-upades, cada urn com es cadelas polpeptiicascetalcas Gomrbreaces de cave purpura) ibs eran reguladares a up ‘es, cada um com 613s cade se potpapicss reguladerar (arma ¢ amarlo). Os aanjos aguladores ‘ora Pontos do um tnangule ‘Ue fodeia as saudades cetlticas, Ds sos de igacio oa7@ 0s moduladores alostencos este nas subunidedes regulagoras. A igacdo do Fodor provoea grandes mcificagons na ranfarmacaa © na ats ca snzima A fungan dessa enzima na srte ce nsectidecs © ot Cetahes da sua requacéo seo ciscubdos re Captu 22. (Cortsia de Ray steven, Universidade da Calfsens, Berkeley216 Figura 8:25 -Inibigao por etrealimentagse. A convesio da Lttcon- gemtsscleusine €catasada por ume sequncide cinco eraimas Ea Eo, A Lateonina dascratase (G) 8 nibs especiica e alostercarvence ae Lisolevcina, © produto Fal da sequéncia, mas por nenhum dos Dano inermediares v2 0) & incza por retroalirentacan esa ind ‘ada pelalirha taceada © palo simile) aseta da waco catalsada als tear desicratase, um esque que & usado neste hyo. shel encontrar um Yalor de |S] na curva de sturaggo sigmoidal paraa qual Véa metade da velocidade maxima, nao se pode rete Fir als como devignanco © Ky, pois enzima nao segue o com: portamento hiperbéico de Michaelis-Menten. Como substitu, sib [Ses ov Kase Feqdentemente usa para representara concentragao de substrat gue prod metade da velocidad mi ima da reagio catalisada por urna envima alostriea (Tig 826) 3) mn (a) Figura 8:26 ~ curv [st cant) (by © comportamento cinetico sigmoidal geralmente rete in teragoescooperativas entre miltiplas subunidades proteicas. Em outras palavras, mudangas na estrurura de uma subunidade 0 swaduzidas em mudangesesieuturais nas subunidades ajacen- ‘es.umefeit que medio porinteraybesmao-conalentesnais) inerface(s)subuniddade-subunidade. Os principios s20 muito bem ilustrades pela ligagao do O: 3 hemoglobina (Capitulo 7) © comportamento cinético sigmoidal €explicado pelos mode los da simetria ajustadee seqiencial paca interaydes de subuni- daces (voia Fig. 7-14). ‘As enzimas alosiricas homotrépicasgeralmente apresen- ‘am miltipls subunidades. Conforme salientado anteriormen- te, 0 mesmo sitio de igagao em cada subunidade pode funcio- nar tanto como sto ative quanto come sitio egulador. © subs- stato pode ser um modulador positivo (um ativador porque as sulunidades atuam cooperativamente’ a ligacao de wma mole- cult do substrato 2 un sitio de igagao altera a canformsacao da encima e favorece a ligagae de outtas moléculas do substrate Isso explca ¢ aumento sigmoidal © nao 0 hiperbilica, de Vo com o cumento da [5)- Uma caracteristiea da cinta sigmoidal é que pequenas mudangas na concentragio de um modulasor podem ser associadas a grandes mudaneas na atividade. Como fica evidente na Figura 8-26a, um aumento relativamente pe

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• John Adams

  

  From Everand

  John Adams

  David McCullough

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (2409)
• The Emperor of All Maladies: A Biography of Cancer

  

  From Everand

  The Emperor of All Maladies: A Biography of Cancer

  Siddhartha Mukherjee

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (271)
• The Woman in Cabin 10

  

  From Everand

  The Woman in Cabin 10

  Ruth Ware

  Rating: 3.5 out of 5 stars

  3.5/5 (2521)
• The Light Between Oceans: A Novel

  

  From Everand

  The Light Between Oceans: A Novel

  M.L. Stedman

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (789)
• The World Is Flat 3.0: A Brief History of the Twenty-first Century

  

  From Everand

  The World Is Flat 3.0: A Brief History of the Twenty-first Century

  Thomas L. Friedman

  Rating: 3.5 out of 5 stars

  3.5/5 (2259)
• The Little Book of Hygge: Danish Secrets to Happy Living

  

  From Everand

  The Little Book of Hygge: Danish Secrets to Happy Living

  Meik Wiking

  Rating: 3.5 out of 5 stars

  3.5/5 (401)
• Hidden Figures: The American Dream and the Untold Story of the Black Women Mathematicians Who Helped Win the Space Race

  

  From Everand

  Hidden Figures: The American Dream and the Untold Story of the Black Women Mathematicians Who Helped Win the Space Race

  Margot Lee Shetterly

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (897)
• Bad Feminist: Essays

  

  From Everand

  Bad Feminist: Essays

  Roxane Gay

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (1016)
• Yes Please

  

  From Everand

  Yes Please

  Amy Poehler

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (1898)
• Manhattan Beach: A Novel

  

  From Everand

  Manhattan Beach: A Novel

  Jennifer Egan

  Rating: 3.5 out of 5 stars

  3.5/5 (792)
• The Perks of Being a Wallflower

  

  From Everand

  The Perks of Being a Wallflower

  Stephen Chbosky

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (2104)
• The Yellow House: A Memoir (2019 National Book Award Winner)

  

  From Everand

  The Yellow House: A Memoir (2019 National Book Award Winner)

  Sarah M. Broom

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (98)
• The Art of Racing in the Rain: A Novel

  

  From Everand

  The Art of Racing in the Rain: A Novel

  Garth Stein

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (4203)
• Angela's Ashes: A Memoir

  

  From Everand

  Angela's Ashes: A Memoir

  Frank McCourt

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (440)
• On Fire: The (Burning) Case for a Green New Deal

  

  From Everand

  On Fire: The (Burning) Case for a Green New Deal

  Naomi Klein

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (74)
• The Constant Gardener: A Novel

  

  From Everand

  The Constant Gardener: A Novel

  John le Carré

  Rating: 3.5 out of 5 stars

  3.5/5 (104)
• Shoe Dog: A Memoir by the Creator of Nike

  

  From Everand

  Shoe Dog: A Memoir by the Creator of Nike

  Phil Knight

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (537)
• Grit: The Power of Passion and Perseverance

  

  From Everand

  Grit: The Power of Passion and Perseverance

  Angela Duckworth

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (590)
• Little Women

  

  From Everand

  Little Women

  Louisa May Alcott

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (104)
• Never Split the Difference: Negotiating As If Your Life Depended On It

  

  From Everand

  Never Split the Difference: Negotiating As If Your Life Depended On It

  Chris Voss

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (842)
• The Hard Thing About Hard Things: Building a Business When There Are No Easy Answers

  

  From Everand

  The Hard Thing About Hard Things: Building a Business When There Are No Easy Answers

  Ben Horowitz

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (346)
• The Glass Castle: A Memoir

  

  From Everand

  The Glass Castle: A Memoir

  Jeannette Walls

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (1716)
• The Subtle Art of Not Giving a F*ck: A Counterintuitive Approach to Living a Good Life

  

  From Everand

  The Subtle Art of Not Giving a F*ck: A Counterintuitive Approach to Living a Good Life

  Mark Manson

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (5807)
• Principles: Life and Work

  

  From Everand

  Principles: Life and Work

  Ray Dalio

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (608)
• The Gifts of Imperfection: Let Go of Who You Think You're Supposed to Be and Embrace Who You Are

  

  From Everand

  The Gifts of Imperfection: Let Go of Who You Think You're Supposed to Be and Embrace Who You Are

  Brene Brown

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (1091)
• Elon Musk: Tesla, SpaceX, and the Quest for a Fantastic Future

  

  From Everand

  Elon Musk: Tesla, SpaceX, and the Quest for a Fantastic Future

  Ashlee Vance

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (474)
• Steve Jobs

  

  From Everand

  Steve Jobs

  Walter Isaacson

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (806)