I.

Esterilización de materiales (autoclavado):

II. Preparación y sembrío de agar:
1. Objetivos:
 Preparar los agares TSA y sangre para el sembrío de las cepas
adecuadas.
2. Marco teórico:
 AGAR TSA:
El TSA Agar es un medio de uso general que permite el crecimiento tanto de
microorganismos exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias
y anaerobias. Permite visualizar reacciones hemolíticas que producen muchas
especies bacterianas. Tiene por base una fuente proteica (digeridos trípticos,
digeridos proteicos de soja) con una pequeña cantidad de hidratos de carbono
naturales, cloruro sódico y 5% de sangre. Es un medio recomendado para la
detección y recuento de una amplia gama de microorganismos. La presencia de
Lectina y Tween permite neutralizar la actividad antibacteriana, facilitando la
investigación de los gérmenes en productos o superficies que contengan:
Aldehídos, derivados fenólicos, o amonio cuaternario. La aportación de caseína
y peptonas de soja al Agar de Tripticasa-soja hace el medio muy nutritivo por el
suministro de nitrógeno orgánico, particularmente aminoácidos y péptidos de
cadena más larga. La presencia de estas peptonas en el medio permite el cultivo
de una gran variedad de gérmenes aerobios y anaerobios que crecen
rápidamente, así como los del género Candida. También permite el crecimiento
de algunos gérmenes exigentes como estreptococos, pneumococos, Brucella,
corinebacterias, Erysipelothrix y Pasteurella.

Formulación por litro:

  AGAR CHOCOLATE:
El agar chocolate se obtiene calentando la sangre antes de adicionarla al medio
base. Por esta razón el agar chocolate contiene hemoglobina, que aporta al
medio un importante elemento para el crecimiento: el factor X o hemina
termoestable. El agar chocolate es un medio destinado principalmente al
aislamiento de Neisserias (gonococos ymeningococos) y Haemophilus, pero en
él pueden crecer muchos otros microorganismos exigentes. El agar chocolate
puede convertirse quizás en uno de los medios más enriquecidos si añadimos
una mezcla de factores de crecimiento no contenidas en la sangre. Estas mezclas,
denominadas de forma diferente según las casas comerciales (Polivitex,
Isovitalex, etc.) contienen más de una docena de compuestos que confieren a
este medio unas cualidades nutritivas extraordinarias. Por adición de uno o
varios antibióticos pueden lograrse medios inhibidores o selectivos para el
crecimiento de determinados microorganismos.
Comúnmente se utiliza la sangre de carnero entre 5 - 10% como un medio de
enriquecimiento nutritivo en la preparación de medios de cultivo. Éste es
utilizado principalmente para el crecimiento, identificación y observación de las
reacciones hemolíticas causadas por algunas bacterias con importancia clínica.
El Agar chocolate lleva Hemoglobina que aporta al medio un importante
elemento para el crecimiento: el factor X o Hemina termoestable.
3. Materiales:
 Placas Petri
 Autoclave
 Cepas
 Asa
 Tubo con tapa color morado (EDTA)
 Liga
 Algodón
 Alcohol
 Estufa
4. Procedimiento:  E. coli ( A)
TSA método 1  Aureus ( B)
 Typhimurium ( C)

Preparación:
a. Realizar los cálculos respectivos:
1000…………..40gr
20……………….x
X = 4.8 gr
b. Pesar en una balanza analítica. Medir 20ml de agua destilada.
c. En un matraz colocar el agar, ya pesado, y los 20 ml de agua destilada.
 d. Llevar el matraz, junto con otros materiales (placas) a la autoclave.
e. Esperar un determinado tiempo, luego retirar de la autoclave y esperar a que
enfríe un poco.
f. Finalmente colocar el gar en 6 placas Petri y esperar a que solidifique.

Sembrado:
a. Separar 2 placas para cada cepa
b. En la placa A sembrar la cepa de E. coli , en el B la cepa de Aureus y en la placa
C sembrar typhimurium.
c. Colocar las placas ya sembradas en la estufa y esperar el crecimiento.

Agar chocolate :
a. Calcular la cantidad de agar chocolate:
1000………..40
40…………….x
X = 1.6 gr
b. Pesar el agar. Medir 40ml de agua destilada.
c. En un matraz colocar los 40ml de agua y los 1.6gr de agar.
d. Llevar a la autoclave
e. Mientras que el agar este en la autoclave. Sacar sangre 2ml en un tubo con
EDTA.
f. Sacar el agar de la autoclave y colocar la sangre
g. Llevar a calor, hasta que los colores cambien a un color chocolate.
h. Colocar en dos placas y esperar a que solidifique
i. Proceder con el sembrado de la cepa D ( neumoneae)
j. Una de las placas llevar a la estufa la otra dejar en un lugar sin oxígeno.
III. PREPARACION DE LA ESCALA DE MAC FARLAND.

1. OBJETIVOS:
 Preparar y observar la escala de mac farland.
2. MARCO TEORICO:

Escala de Mac farland:

La utilidad de la escala es poder realizar suspensiones bacterianas ajustadas

a un patrón, generalmente se suele usar el 0,5 Mc Farland, para esto se
toma una muestra de nuestra bacteria y la inoculamos en un tubo con
solución salina, en el momento en que se produzca un poco de turbidez ya
estamos en el 0,5 (de forma visual).
La finalidad, es establecer una relación entre una precipitación química y
una suspensión bacteriana. Creamos 10 estándares (en la tabla aparece la
composición de estos) y por espectrofotometría, creamos una recta patrón,
de forma que vamos a poder detectar la concentración de nuestras
 diluciones bacterianas (de manera aproximada, ya que depende de factores
como el tamaño de la bacteria, la formación de agregados,...). La escala se
basa en la capacidad de precipitación del cloruro de bario en presencia de
ácido sulfúrico.

3. MATERIALES:
 Pipetas
 Pro pipetas
 Vaso de precipitado
 Cloruro de bario
 Ácido sulfúrico
 Balanza analítica
4. PROCEDIMIENTO:
a. Preparar cloruro de bario al 1% y ácido sulfúrico al 1%
1gr BaCl………100ml 1ml H2SO4……..100ml
x………………….7ml x……………………99ml
x= 0.07gr x= 0.099ml
b. Colocar las cantidades que se muestran en el cuadro anterior.
IV. PREPARACION DE LA CEPA:
V. PREPARACION DE LA PEPTONA MAS TWEEN
VI. PREPARCION DEL AGAR MULLER – HINTON MAS TWEEN