Mạc Văn Trọng

trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

MỞ ĐẦU
Ở mọi cơ thể sinh vật, vật chất sống được cấu tạo từ các đại phân tử sinh học,
trong đó quan trọng nhất là nucleic acid và protein. Các nucleic acid đóng vai trò
quan trọng trong sự lưu trữ và truyền đạt thông tin di truyền cho thế hệ sau. Hơn nữa,
các thông tin này sẽ được biểu hiện trên cơ thể thông qua sự tạo thành các phân tử
protein. Trong các quá trình sao chép cũng như tổng hợp protein luôn xuất hiện
nhiều biến đổi, đây chính là nguồn gốc của sự tiến hóa và tính đa dạng của sinh giới.
Vì vậy việc tìm hiểu, phân tích các phân tử DNA, RNA là rất cần thiết. Khi hiểu rõ
cấu trúc, đặc điểm của các đại phân tử này, chúng ta có thể kết hợp với sự phát triển
các kỹ thuật, các công nghệ hiện đại để tiến hành lai tạo, chọn giống mới, sản xuất
các hợp chất thứ cấp dùng trong y học, sản xuất các chất kháng sinh…..

Có rất nhiều kỹ thuật được ứng dụng trong công nghệ sinh học để nghiên cứu
vật chất sống, trong đó điện di là một kỹ thuật rất hữu ích sử dụng nhằm phân tích,
xác định và tinh sạch các đoạn DNA bằng cách dựa vào sự dịch chuyển của chúng
trong môi trường điện trường.

1
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

NỘI DUNG
I. NGUYÊN TẮC CHUNG

Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các phân tử tích điện dưới tác động
của điện trường, hay nói cách khác là kỹ thuật phân chia các phân tử DNA, RNA,
protein dựa trên các đặc điểm vật lý như khối lượng hay điện tích thực của chúng.

Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch
chuyển về các cực (+) hoặc (-) tùy theo điện tích của chúng. Protein có điện tích
thực hoặc dương hoặc âm, còn các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ
khung phosphate của mình và vì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực dương.

Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn
đỡ (support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc
polyacrylamide gel. Tuy nhiên, kỹ thuật điện di trên giá rắn (agarose hoặc
polyacrylamide) được sử dụng phổ biến nhất. Kỹ thuật này sử dụng một dung dịch
đệm để dẫn điện và tạo điện trường đều, một bản gel để phân tách các phân tử và
các chất nhuộm khác nhau để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di.
Trong đó, polyacrylamide gel được dùng để phân tách các phân tử protein và các
phân tử DNA có chiều dài <1 kb, còn agarose gel phân tách hiệu quả các phân tử
DNA hoặc RNA có kích thước từ 20 bp-20 kb.

II. ĐIỆN DI AGAROSE GEL

Agarose có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da, là một trong hai thành
phần chính của agar chiếm khoảng 70%, phần kia là agaropectin chiếm khoảng 30%.
Agarose là một polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốc xen kẽ
nhau là D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactose.
Agarose gel là một chất trong suốt hoặc trong mờ, tạo thành khi hỗn hợp
agarose và nước (hoặc đệm điện di) được đun nóng tới >100 oC và sau đó được làm
lạnh; dạng gel xuất hiện ở khoảng 40-45 oC. Bản chất quá trình đông lại của agarose
là phản ứng trùng hợp gắn nhiều gốc monomer tạo thành polymer nhờ nhiệt độ. Các

2
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

chuỗi polymer liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với kích
thước các mắt lưới tùy thuộc vào nồng độ agarose và phản ứng polymer hoá.

Hình 1. Cấu trúc hoá học của agarose và cấu trúc agarose gel

1. Nguyên tắc
Các phân t ử nucleic acid có khố i lươ ̣ng và điê ̣n tić h khác nhau đươ ̣c tách ra
khi di chuyể n từ cực âm sang cực dươn g của hê ̣ điê ̣n di trong mô ̣t điê ̣n trường có
điê ̣n thế và cường đô ̣ thích hơ ̣p . Tốc độ dịch chuyển của các phân tử trong gel phụ
thuộc vào kích thước, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điện trường... Điện di
agarose gel được xem là phương pháp tối ưu nhất dùng để phân tích, xác định và
tinh sạch các đoạn DNA
Vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp : các băng DNA trong gel
đươ ̣c nhuô ̣m ở nồ ng đô ̣ thấ p của thuố c nhuô ̣m huỳnh quang ethidium bromide (EtBr)
và có thể phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại.

2. Các yếu tố ảnh hưởng

2.1. Kích thước của phân tử

Các phân tử DNA có kích thước càng lớn (khối lượng phân tử lớn) thì tốc độ
dịch chuyển càng chậm. Các phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi đi qua bản gel ở các
tố c đô ̣ tỷ lệ nghịch với hàm log10 của khối lượng phân tử của chúng.

3
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

đệm: 0,5 x TBE – 0,5 μg/mL EtBr

điện di: 1 V/cm trong 16 giờ
5

Log10 của các cặp nucleotide

4

0,5%
0,7%
0,9%
3
1,2%

1,4%

1 2 3 4 5 6
2
Hình 2. Mố i quan hê ̣ giữa kích thước DNA và độ linh đô ̣ng điêṇ di của nó

2.2. Nồ ng độ agarose

Đoa ̣n DNA mang kić h thước khác nhau dich

̣ chuyể n ở các tố c đô ̣ khác nhau
qua các bản gel chứa các nồ ng đô ̣ agarose khác nhau .

Bảng 1. Các thông số điện di DNA bằng agarose gel

Hàm lượng agarose Kích thước DNA mạch

(%) trong gel thẳ ng (kb) sử du ̣ng có
hiêụ quả

0,3 60-5

0,6 20-1

0,7 10-0,8

0,9 7-0,5

1,2 6-0,4

1,5 4-0,2

2,0 3-0,1

4
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

A B C

1 2 1 2 1 2

Hình 3. Điện di các mẫu DNA giống nhau ở các nồng độ agarose khác nhau. A: 1%, B: 1,5%
và C: 2%.

Theo hình trên, sự dịch chuyển của tập hợp các đoạn DNA trong hai mẫu ở ba
nồng độ khác nhau của agarose, tất cả chúng ở trong một khay gel và được điện di ở
cùng một điện áp trong một thời gian xác định. Kết quả cho thấy, các đoạn lớn được
phân tách tốt hơn ở gel 1%, trong khi các đoạn nhỏ thích hợp với gel 2%.

2.3. Cấ u hình của DNA

Các DNA dạng vòng đóng, vòng đứt và mạch thẳng có cùng một kh ối lượng
phân tử sẽ dich
̣ chuyể n trên agarose gel ở các tố c đô ̣ khác nhau.
DNA của các plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của plasmid
cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng.

Dạng vòng đứt

Dạng vòng đóng

DNA mạch vòng DNA mạch thẳng

Hình 4. Kết quả điện di với plasmid mạch vòng bên trái và plasmid cùng loại
mạch thẳng ở bên phải.

5
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

2.4. Thành phần base và nhiệt độ

Điê ̣n di của DNA trong agarose gel không bi ̣ảnh hưởng rõ bởi thành phầ n
base của DNA hoă ̣c nhiê ̣t đô ̣ . Trong agarose gel , tính linh động điện di tương đối
của các đoạn DNA có kích thước khác nhau không thay đổi trong kho ảng từ 4 oC
đến 30 oC. Nói chung, agarose gel thường đươ ̣c cha ̣y ở nhiê ̣t đô ̣ phòng.

3. Phương pháp điện di

3.1. Thiết bị điện di

Hình 5. Cấu trúc thiết bị điện di agarose gel

Thiết bị điện di agarose gel gồm 3 bộ phận cơ bản: nắp, khay vận hành và
buồng điện di.
+ Nắp: trên nắp có đầu ra của dây cáp điện nối điện cực trên buồng điện di
với nguồn điện.
+ Khay vận hành bao gồm: khay đổ gel, khuôn đổ gel, lược.

6
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

+ Buồng điện di: là nơi đặt gel trong quá trình điện di. Buồng có rãnh để cài
lược, hai điện cực tạo ra điện trường trong dung dịch.

3.2. Đê ̣m pH
Một số đệm điện di DNA thích hợp là Tris-acetate-EDTA (TAE), Tris-
borate-EDTA (TBE) và Tris-phosphate-EDTA (TPE) ở nồng độ khoảng 50 mM và
pH 7,5-7,8. Trong đó, TAE sử du ̣ng nhiề u nhấ t , nhưng khả năng đê ̣m la ̣i thấ p . Đê ̣m
TBE và TPE đề u có khả năng hòa tan tố t các đoa ̣n DNA và khả năng đê ̣m cao hơn .
Các đoạn DNA sẽ dịch chuyển với các tốc độ hơi khác nhau trong ba loại đệm trên.
Đệm giúp thiết lập một giá trị pH, cung cấp các ion để hỗ trợ cho độ dẫn.

Bảng 2. Các loại đệm sử dụng phổ biến trong điện di

Nồng độ dung dịch sử

Đệm Dung dịch stock (1 lít)
dụng
(50)
40 mM Tris
Tris-acetate- 242 g Tris base
20 mM acetic acid
EDTA(TAE) 57,1 mL glacial acetic acid
1 mM EDTA
100 mL EDTA 0,5 M (pH 8,0)
(10)
89 mM Tris
Tris-borate- 108 g Tris base
89 mM boric acid
EDTA (TBE) 55 g boric acid
2 mM EDTA
40 mL EDTA 0,5 M (pH 8,0)
(10)
80 mM Tris- phosphate
Tris-phosphate- 108 g Tris base
2 mM EDTA
EDTA (TPE) 15,5 mL H3PO4 85%
40 mL EDTA

3.3. Quy trình điê ̣n di

3.3.1. Chuẩn bị agarose gel
Có nhiều loại agarose khác nhau thích hợp để chạy điện di , loại agarose dùng
tố t nhấ t trong thí nghiê ̣m là type -II-agarose có nô ̣i thẩ m thấ u thấ p (low-endo-
osmotic). Nó dễ dàng chảy ra và ta ̣o thành mô ̣t dung dich
̣ trong suố t , kế t quả là gel
đàn hồ i thâ ̣m chí ở các nồ ng đô ̣ thấ p . Tuy nhiên , type-II-agarose dễ bi ̣bẩ n b ởi
sulphate polysaccharides (SP), hơn nữa SP còn ức chế các enzyme như ligase ,
polymerase và RE . Vì thế, các đoạn DNA dung ly từ những gel như thế phải được
làm sạch cẩn thận trước khi chúng được dùng như là các khuôn mẫu hoặc cơ chất
cho các enzyme này .

7
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

Cách tiến hành: Cho 1% type-II-agarose vào 100 mL đê ̣m 0,5 TAE. Đun
trong nồi khử trùng hoă ̣c lò vi sóng cho đế n khi agarose tan hoàn toàn . Nế u quá
trình đun mất nước quá nhiều thì phải thêm nước cho đủ 100 mL. Để nguô ̣i khoảng
60oC và đổ vào bu ồng điê ̣n di có cài s ẵn lươ ̣c. Chiề u dày gel khoảng 5 mm là thích
hơ ̣p. Sau 30-40 phút, khi gel đã đông cứng, gỡ lươ ̣c ra.

3.3.2. Đặt mẫu DNA vào giếng

Tùy thuộc vào từng mục đích điện di khác nhau có thể sử dụng nồng độ DNA
cao hoă ̣c thấ p. Chẳ ng ha ̣n theo tỷ lê ̣ sau:

DNA (1 g/1 µL ) : 1 L

Đê ̣m màu bromophenol (10 loading dye):1 L

Nước cấ t 2 lầ n: 9 L

Tổng số : 11 L

Dùng micropipette hút 11 L dung dich

̣ trên cho vào giế ng.

Thường đă ̣t mẫu sau khi đã đổ dich

̣ đê ̣m 0,5 TAE vào buồng điê ̣n di cho ngâ ̣p
gel, ít khi đă ̣t mẫu trước rồi đổ đệm sau . Thường dùng micropipette loại 20-200 L
và đặt bu ồng điê ̣n di trên bàn có nề n đen . Khi tăng điện thế của quá trình điện di,
các đoạn DNA lớn thường dịch chuyển nhanh hơn so với các đoạn nhỏ. DNA dịch
chuyể n từ cực âm đế n cực dương . Quan sát sự d ịch chuyể n bằ ng màu bromophenol
để biết lúc nào cầ n ngừng điê ̣n di.

3.3.3. Nhuộm DNA bằ ng EtBr

Phương pháp quan sát DNA trong agarose gel thuâ ̣n lơ ̣i nhấ t là dùng thuố c
nhuô ̣m huỳnh quang EtBr . Sau khi cha ̣y điê ̣n di xong lấ y nhe ̣ bản gel ra khỏi khuôn
và ngâm vào dung dịch EtBr nồ ng đô ̣ 0,5 g/mL, trong thời gian 30-45 phút, tố t nhấ t
trên một máy lắ c nhe ̣ (đô ̣ 10 vòng/phút ). Đổ dịch nhuộm EtBr vào một bin
̀ h riêng để
xử lý và rửa bản gel bằng cách ngâm trong nước cất hai lần, mỗi lầ n 15-20 phút. EtBr
thường pha sẵn ở da ̣ng đâ ̣m đă ̣c 5 mg/mL và giữ ở 4oC trong tố i.
EtBr đươ ̣c dùng để phát hi ện DNA sơ ̣i đôi và RNA sơ ̣i đơn . Tuy nhiên, ái lực
(affinity) của thuố c nhuô ̣m đố i với nucleic acid sơ ̣i đơn là tương đố i thấ p và có hiê ̣u

8
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

suấ t huỳnh quang không cao . Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của
nucleic acid và cho phép phát hiện dễ dàng chúng ở trong gel.
Thường EtBr (0,5 g/mL) đươ ̣c đưa vào trong agarose gel đ ể phản ứng nhuộm
xảy ra trong suốt quá trình điện di. Mă ̣c dù tính linh đô ̣ng điê ̣n di của DNA sơ ̣i đôi
mạch thẳng giảm khi có mặt thuốc nhuộm (khoảng 15%), nhưng khả năng xác đinh
̣
gel trực tiế p dưới ánh sáng UV trong suố t quá trin
̀ h đi ện di hoă ̣c ở giai đoa ̣n cuố i có
ưu thế rõ rê ̣t . Tuy nhiên , nế u cầ n có thể ch ạy điện di gel không có EtBr và chỉ
nhuô ̣m DNA ho ặc RNA sau khi điê ̣n di xong . Gel đươ ̣c ngâm trong đê ̣m điê ̣n di
hoă ̣c H2O chứa EtBr (0,5 g/mL)/45 phút ở nhiệt độ phòng.

Vị trí gắn lược Dung dịch agarose gel Lược

Giếng

Băng dính

a. Khuôn đổ gel b. Gắn lược và đổ agarose gel c. Lấy lược ra khỏi khuôn gel
vào khuôn

Nguồn điện di

Micropipette Cable

Đệm điện di

Nắp

Buồng điện di

d. Nạp mẫu DNA vào giếng e. Chạy điện di

Hình 6. Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel

3.3.4. Quan sát và chụp ảnh

Bản gel sau khi nhuộm EtBr được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ( = 302
nm). Dùng thiế t bi ̣chuyên du ̣ng đ ể phân tích và lưu trữ hình ảnh DNA (Gel
Documentation System).

9
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

(a) (b)

Hình 7: Quan sát DNA dưới ánh sáng tử ngoại (a) và hình ảnh điện di DNA
trên agarose gel (b)

3.4. Một số phương pháp thu hồ i DNA từ agarose gel
a) Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp
Mẫu agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp chứa đoạn DNA quan tâm được cắt
ra khỏi bản gel và cho vào trong đệm với tỷ lệ 1:1, bổ sung muối đến nồng độ 0,5 M,
sau đó được nóng chảy ở 70oC để hòa tan hoàn toàn trong đệm. Dung dịch gel có DNA
được chiết bằng phenol/chloroform và kết tủa. Lưu ý DNA được tách chiết bằng
phương pháp này không thích hợp cho mọi phương thức thao tác tiếp theo, do sự hiện
diện của các nhân tố ức chế trong agarose.

Agarose gel có nhiệt Cho vào trong đệm

độ nóng chảy thấp với tỷ lệ 1:1

Cắt

Bổ sung muối đến

Đoạn DNA quan
nồng độ 0,5M
tâm
70oC
Dung dịch gel có
DNA

Chiết bằng
phenol/chloroform
và kết tủa

Hình 8. Sơ đồ tóm tắt quá trình thu hồi DNA quan tâm
bằng cách dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp
10
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

b) Ly tâm
Mẫu agarose gel có chứa băng DNA quan tâm được cắt ra và cho vào đệm
chiết, làm nóng để hòa tan hoàn toàn, sau đó cho dung dịch gel lên trên một lớp
bông thủy tinh đã silicon hóa đặt trong một cột lọc nhỏ loại 0,5 ml. Cột này được
cho vào một tube vi ly tâm loại 1,5 mL và được ly tâm ở tốc độ cao 10.000-15.000
rpm trong 10-15 phút. DNA sẽ liên kết với màng còn dung dịch đệm sẽ đi qua lớp
bông thủy tinh vào tube vi ly tâm. Cho đệm rửa vào cột và rửa cột vài lần bằng cách
ly tâm nhanh. Thay tube vi ly tâm mới, cho đệm hòa tan DNA vào cột và ly tâm để
dung ly (elution) DNA ra khỏi màng vào tube. Dung dịch DNA thu được có thể
được tinh sạch thêm nếu cần. Cũng có thể đông lạnh mẫu gel trước khi dùng phương
pháp ly tâm để cải thiện hiệu suất thu hồi DNA.

agarose gel chứa cho vào tube ly tâm

băng DNA

Cắt
ly tâm ở 10.000-
Đoạn DNA quan 15.000 rpm trong
tâm 10-15 phút.

DNA liên kết với

cho vào đệm chiết, màng
làm nóng hòa tan
hoàn toàn
rửa cột vài lần

thủy tinh đặt trong

một cột lọc
dung ly DNA ra
khỏi màng

Hình 9. Sơ đồ tóm tắt quá trình thu hồi DNA quan tâm
bằng cách dùng ly tâm
c) Điện di vào bẫy
* Cách 1: Một cái rãnh nhỏ được cắt trong agarose gel ngay phía trước của
băng DNA quan tâm. Rãnh này được làm đầy bằng glycerol và gel được điện di
nhanh trở lại để chuyển DNA từ gel vào trong dung dịch glycerol (quá trình điện di

11
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

có thể được kiểm soát bằng UV). Dung dịch glycerol-DNA sau đó được chiết bằng
pipette.
* Cách 2: sau khi điện di, một khe nhỏ được cắt trong gel ngay phía trước băng
DNA quan tâm và đặt trong khe một mẫu giấy loại NA-45. Gel sau đó được điện di
trở lại và băng DNA quan tâm sẽ dịch chuyển vào trong mẫu giấy. Mẫu giấy sau đó
được rửa và DNA được dung ly trong đệm bằng cách đun nóng mẫu giấy tới 70oC.
DNA sau đó có thể được tách chiết bằng phenol và kết tủa.

Cắt một rãnh nhỏ trước

băng DNA quan tâm

Cắt một rãnh nhỏ phía trước

băng DNA quan tâm Đặt trong khe một mẫu
giấy loại NA-45

Làm đầy bằng glycerol

Điện di nhanh trở lại để
chuyển DNA từ gel vào
mẫu giấy
Điện di nhanh trở lại để chuyển DNA
từ gel vào trong dung dịch glycerol
Rửa mẫu giấy và dung
ly DNA trong đệm
Chiết dung dịch glycerol-DNA
bằng pipette
Tách chiết DNA bằng
phenol
và kết tủa

(a) (b)

Hình 10. Sơ đồ tóm tắt quá trình thu hồi DNA quan tâm bằng cách dùng
điện di vào bẫy. (a): cách 1, (b): cách 2

d) Dùng hạt thủy tinh

Mẫu gel quan tâm được hòa tan trong dung dịch muối NaI ở nồng độ khoảng 4
M. Sau đó, các hạt thủy tinh được bổ sung vào dung dịch để liên kết hiệu quả với
các đoạn DNA được phóng thích ở nồng độ đã cho của NaI. RNA, protein và các
tạp chất khác không liên kết với các hạt thủy tinh. Tiếp theo, tiến hành rửa và kết tủa
tiểu thể, DNA tinh sạch được dung ly khỏi hạt thủy tinh trong đệm muối thấp. Tuy
nhiên, phương pháp này mặc dù nhanh và hiệu quả nhưng lại có phạm vi tối ưu hẹp.
Thu hồi các đoạn DNA nhỏ (500-800 bp) là không hiệu quả lắm và các đoạn lớn

12
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

(>15 kb) có thể liên kết với các hạt thủy tinh khác nhau và các sợi DNA có thể bị
phá vỡ trong suốt các chu kỳ rửa.

Hòa tan gel trong dung dịch

muối NaI (4 M). Rửa và kết tủa tiểu thể

Bổ sung hạt thủy tinh Dung ly DNA ra khỏi hạt thủy

vào dung dịch tinh trong đệm muối thấp

DNA liên kết với hạt thủy Tách chiết DNA bằng phenol
tinh và kết tủa

Hình 11: Sơ đồ tóm tắt quá trình thu hồi DNA quan tâm bằng cách dùng
hạt thủy tinh.

4. Ứng dụng của điện di agarose gel

Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt
hạn chế (ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng…).
Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử hoặc
in dấu di truyền…).
Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích Southern,
hoặc RNA trước khi thẩm tích Northern.

5. Ưu điểm và nhược điểm

* Ưu điểm của phương pháp này là gel được rót dễ dàng, không gây biến tính
mẫu và bền vững vật lý hơn polyacrylamide. Mẫu cũng dễ thu hồi.

* Nhược điểm là agarose gel có thể bị nóng chảy trong quá trình điện di, đệm
có thể bị tiêu hao, và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không ổn định.

II. ĐIỆN DI POLYACRYLAMIDE GEL

Acrylamide là một monomer có cấu trúc như sau: CH2 = CH C NH2

Khi có mặt các gốc tự do, được cung cấp bởi ammonium persulphate và ổn
định bởi TEMED (N, N, N', N'-tetramethylathylene-diamine), phản ứng chuỗi

13
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

bắt đầu khi các acrylamide monomer được polymer hoá thành một chuỗi dài.

CONH2 CONH2 CONH2

S2O42- SO4- + nCH2 = CH nCH2 CH CH2 CH

TEMED

Khi bisacrylamide (N, N'-methylenebisacrylamide) được bổ sung trong phản

ứng polymer hoá, các chuỗi sẽ liên kết chéo để tạo thành dạng gel. Độ xốp của gel
được xác định bởi chiều dài của chuỗi và mức độ liên kết chéo. Mức độ liên kết
chéo sẽ xác định kích thước lỗ, từ đó phân tách các phân tử protein với kích thước
khác nhau. Kích thước trung bình của các lỗ gel được điều chỉnh bằng cách thay đổi
tỷ lệ acrylamide và bisacrylamide.

Hình 12. Hình thành liên kết chéo

Hình 13. Hình thành polyacrylamide gel

14
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

1. Nguyên tắc điện di polyacrylamide gel

Dùng để phân tách các phân t ử protein, các đoa ̣n DNA , kể cả RNA và
DNA/RNA. Gel phải đươ ̣c rót vào giữa hai tấ m kính đươ ̣c ngăn cách bởi các miế ng
đệm (gel spacers) để ngăn không cho polyacrylamide tiế p xúc vớ i không khí . Gel có
thể dài từ 10-100cm tùy thuô ̣c vào yêu cầ u phân tích và chúng thường đươ ̣c cha ̣y trong
phương thẳ ng đứng .
Có thể đúc bản gel ở các nồng độ khác nhau của polyacrylamide từ 3,5%-
20% tùy thuộc vào kích thước của phân tử protein hoặc đoa ̣n DNA quan tâm . Nồng
độ thấp tạo ra các lỗ có kích thước lớn hơn và vì thế có thể phân tách các phân tử
lớn hơn Liên kết chéo của các monomer và các tác nhân liên kết có thể được điều chỉnh để
kiểm soát mức độ xốp của khuôn gel. Điều này cho phép tối ưu hóa một khuôn gel để phân
tách một phạm vi kích thước đặc biệt của các phân tử protein.

Hình 14. Polyacrylamide gel

2. Điện di acid nucleic

Điện di polyacrylamide gel đươ ̣c dùng để phân tić h và thu h ồi các đoa ̣n DNA
có chiều dài từ 5-2.000 bp. Nồng độ polyacrylamide gel được sử dụng trong khoảng
từ 3,5-20% tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA quan tâm.
Hai loa ̣i polyacrylamide gel thường đươ ̣c sử du ̣ng là:
- Polyacrylamide gel không biế n tin
́ h dùng đ ể phân tách và tinh sạch các
đoa ̣n DNA sơ ̣i đôi.
- Polyacrylamide gel biế n tính b ằng urea và formamide dùng để phân tách và
tinh sa ̣ch các đoa ̣n DNA sơ ̣i đơn.

15
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

Trong đó, polyacrylamide gel không biến tính là loại gel hay được sử dụng
nhất. Hiê ̣u quả của sự phân tách DNA trong lo ại gel này phu ̣ thuô ̣c vào nồ ng đô ̣ của
acrylamide, kích thước và điện tích của DNA.

Bảng 2. Hiêụ quả của sự phân tách DNA trong

polyacrylamide gel không biế n tính

Acrylamide (% w/v) Hiêụ quả phân tích

(nucleotide)

3,5 1.000-2.000

5,0 80-500

8,0 60-400

12,0 40-200

15,0 25-150

20,0 6-100

Hình 15. Cấu trúc thiết bị điện di polyacrylamide gel

16
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

2.1. Phương pháp điện di polyacrylamide gel không biến tính

2.1.1. Chuẩn bị polyacrylamide gel không biến tính

Kích thước phổ biến của tấm kính đổ gel thường là 20 cm40 cm. Miế ng
đệm dày khoảng 0,5 mm-2,0 mm. Các gel dày hơn thường nóng lên trong quá
trình điện di nên sẽ làm nhòe các băng DNA , vì thế ng ười ta thường sử dụng các
gel mỏng . Tuy nhiên , khi khi cha ̣y mô ̣t lươ ̣ng lớn DNA (>1 g/băng) thì cần
chuẩ n bi ̣gel dày .
2.1.2. Các bước tiến hành:
a) Chuẩn bị dung dịch: 30% acrylamide (gồ m bis-acrylamide), 1 TBE, 10%
ammonium persulphate.

b) Lau sa ̣ch hai tấ m kính dùng làm khuôn gel và miế ng đê ̣m bằ ng
KOH/methanol hoă ̣c ethanol. Xử lý bề mă ̣t của hai tấ m kin
́ h bằ ng dung dich
̣ silicon
để ngăn gel dính chặt vào hai tấm kính gây rách gel lúc lấy nó ra khỏi khuôn sau khi
điê ̣n di xong.

c) Tính toán thể tích của các dung dịch dùng đ ể tạo polyacrylamide gel trên
cơ sở kích thước tấ m kính, đô ̣ dày của miếng đệm.

Bảng 3. Dung tích của các chấ t dùng cho polyacrylamide gel

Số mL của các nồ ng đô ̣ (%) khác nhau

Dung dich
̣ để chuẩn bị gel

3,5% 5,0% 8,0% 12,0% 20,0%

30% acrylamide
11,6 16,6 26,6 40,0 66,6
(bao gồ m bis-acrylamide)

Nước 67,6 62,7 52,7 39,3 12,7

5 TBE 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0

10% ammonium persulphate 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7

d) Bổ sung 35 L TEMED vào mỗi 100 mL dung dich

̣ ta ̣o polyacrylamide
gel, trô ̣n hỗn hơ ̣p bằ ng cách vortex . Rót dung dịch tạo gel vào giữa hai tấm kính .

17
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

Gắ n nhanh lươ ̣c vào , tránh bọt khí ở răng lược (giế ng). Đỉnh của răng lươ ̣c phả i hơi
cao hơn mép gel. Nế u cầ n, bổ sung mô ̣t it́ dung dich
̣ ta ̣o gel để làm đầ y mép gel.
e) Cho phép acrylamide polymer hóa trong khoảng 60 phút ở nhiệt độ phòng,
bổ sung thêm dung dich
̣ ta ̣o gel nế u thấ y gel co vào nhiề u .
f) Sau khi polymer hóa hoàn toàn , rút lược cẩ n thâ ̣n , tháo băng dính ra khỏi
đáy khuôn gel . Gắ n khuôn gel vào bu ồng điê ̣n di và làm đầ y bu ồng điê ̣n di bằ ng
đệm 1 TBE, dùng Pasteur pipette để phá các bọt khí ra khỏi đáy gel và các giếng
bằ ng đê ̣m 1 TBE.
g) Trô ̣n các mẫu DNA với m ột lươ ̣ng thić h hơ ̣p của đê ̣m 6 gel-loading dye.
Đặt mẫu vào trong giếng bằng micropipette hoặc Hamilton syringe .
h) Nố i buồ ng điê ̣n di với bô ̣ nguồ n . Polyacrylamide gel không biế n tính
thường chạy điện di trong khoảng 1 V/cm đế n 8 V/cm. Chạy gel cho đến khi thuốc
nhuô ̣m chỉ thi ̣dich
̣ chuyể n đế n vi ̣trí mong muố n . Tắ t nguồ n, lấ y khuôn gel ra và đă ̣t
lên bàn . Tháo tấm kính nhỏ ở mặt trước ra , tấ m kính lớn ở phí a sau được dùng làm
giá đỡ và chuẩn bị nhuộm gel.

Hình 16. Các bước chuẩn bị điện di

18
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

2.2. Phát hiện DNA trong polyacrylamide gel

2.2.1. Nhuộm bằ ng ethidium bromide
̣ nhuô ̣m (0,5 g/mL EtBr trong 1 TBE). Sau
Ngâm nhe ̣ gel trong dung dich
30-45 phút, lấ y gel và tấm kính đỡ ra, cẩ n thâ ̣n thấ m khô bề mă ̣t gel b ằng giấ y thấ m
Kimwipe. Phủ lên bề mặt gel bằng gi ấy nylon (Saran wrap ), tránh tạo ra bọt khí
hoă ̣c nế p gấ p của Saran wrap. Quan sát và chụp ảnh trên máy soi tử ngoa ̣i.
Polyacrylamide có thể là m mấ t huỳnh quang của EtBr , do đó không thể phát
hiê ̣n các băng DNA bằ ng phương pháp này nế u hàm lươ ̣ng của nó thấ p hơn 10 ng.

2.2.2. Nhuộm bằng thuốc nhuộm bạc:

Thuốc nhuộm bạc sử dụng hiệu quả để phát hiện cho phép phát hiện một
lượng protein ở dạng vết trong polyacrylamide gel và một lượng nhỏ nucleic acid
(pg), nhạy gấp 1.000-10.000 lần phương pháp nhuộm bằng EtBr.
Hai phương pháp nhuộm bạc thường được sử dụng là: 1) Dùng các dung
dịch diamine silver hay ammoniacal silver cho thấm vào gel và pha loãng các dung
dịch acid của formaldehyde. 2) Thấm dung dịch silver nitrate vào gel trong môi
trường acid yếu và dùng formaldehyde khử có chọn lọc các ion bạc thành bạc kim
loại dưới điều kiện kiềm. Phương pháp diamine kiềm kém nhạy hơn nhưng thích
hợp đối với các gel dày, trong khi phương pháp acid nhanh và bắt màu tốt hơn đối
với các gel mỏng.
Quá trình nhuộm bao gồm các bước sau:
- Cố định nucleic acid trong acetic acid 7,5% tối thiểu 5 phút để ngăn cản sự
khuếch tán của các phân tử nucleic acid đã được phân tách trong gel, loại bỏ và
trung hòa các hóa chất không mong muốn (urea và đệm).
- Rửa gel trong nước khử ion tối thiểu 2 phút để loại bỏ acetic acid, các chất
bẩn dạng vết và phần thừa của các thành phần gel hòa tan sau khi cố định.
- Nhuộm gel trong dung dịch bạc với sự có mặt của formaldehyde để cải
thiện độ nhạy và độ tương phản. Thời gian nhuộm tối ưu khoảng 20 phút. Tuy nhiên,
đối với loại gel có tấm đỡ polyester (8×10 cm) chỉ cần 10 phút để có chất lượng
hình ảnh cao mà không làm giảm độ nhạy.
- Rửa gel sau khi nhuộm bạc để loại bỏ thuốc nhuộm thừa có thể gây ra kết
tủa màu nâu trong quá trình phát triển màu.

19
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

- Phát triển màu của gel bằng hỗn hợp dung dịch sodium carbonate (4g/L),
sodium thiosulfate (4 µM) và formaldehyde để giảm các background không đặc hiệu
một cách hiệu quả. Nhiệt độ rửa thích hợp từ 8-10 oC, thời gian rửa thay đổi tùy vào
thành phần của dung dịch phát triển màu trong khoảng từ vài giây đến vài phút.
- Dừng phản ứng phát triển màu khi thu được hình ảnh tối ưu càng nhanh
càng tốt bằng cách dùng acetic acid lạnh 7,5%.

Hình 17. Phát hiện DNA bằng thuốc nhuộm bạc

2.2.3. Phóng xạ tự ghi:

DNA có thể được phát hiện bằng đồng vị phóng xạ 32P. Cố định nucleic acid
trong acetic acid 7,5%. Sau đó, tiến hành rửa gel trong nước khử ion . Dùng giấy
thấ m Kimwipe để thấ m khô bề mă ̣t gel . Tiếp theo, đánh dấu phóng xạ và sấy gel ở
80oC trong điều kiện chân không từ 1-2 giờ. Ủ phim phóng xạ khoảng 24 giờ. Quan
sát kết quả.

20
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

Hình 18. Hình ảnh điện di DNA có đánh dấu 32P trên polyacrylamide gel ở phim X-quang.

2.3. Phân lập các đoa ̣n DNA từ polyacrylamide gel

Phương pháp tố t nhấ t để phân lâ ̣p DNA từ polyacrylamide gel là kỹ thuâ ̣t của
Maxam và Gilbert (1977). Ưu điểm của phương pháp:
+ DNA thu đươ ̣c có đô ̣ tinh sa ̣ch cao
+ Phân lâ ̣p cả hai loa ̣i DNA sơ ̣i đôi và sơ ̣i đơn từ các polyacrylamide gel
không biến tiń h và biến tính.
Phương thức sau đây đươ ̣c cải tiến từ kỹ thuâ ̣t của Maxam và Gilbert (1977):
- Chạy điện di polyacrylamide gel. Xác định vị trí của DNA quan tâm bằng
phóng xạ tự ghi hoặc bằng EtBr quan sát dưới ánh sáng UV.
- Dùng dao cắt mảnh gel chứa băng DNA quan tâm . Không loa ̣i bỏ Saran wrap
khỏi gel trước khi cắ t , cắ t cả gel l ẫn Saran wrap, sau đó bóc mảnh gel nhỏ có chứa
DNA quan tâm ra khỏi Saran wrap.
- Chuyể n gel vào trong E -tube (eppendorf tube), dùng tip của micropipette để
ép mảnh gel theo thành của tube.
- Tính toán thể tích thích hợp của mảnh gel và bổ sung1-2 thể tić h của đê ̣m chiế t
vào E-tube.
- Đóng tube và ủ ở 37oC kèm theo lắ c vòng nhe ̣ . Đoa ̣n DNA nhỏ (<500 bp)
đươ ̣c dung ly trong khoảng 3-4 giờ, đoa ̣n lớn hơn mấ t khoảng 12-16 giờ
- Ly tâm 12.000 vòng trong 1 phút ở 4oC. Chuyể n thể nổ i vào E-tube sa ̣ch.

21
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

- Bổ sung thêm 0,5 thể tích đê ̣m chiế t vào E -tube cũ có mảnh polyacrylamide
gel, vortex nhanh và ly tâm. Trô ̣n hai thể nổ i la ̣i với nhau.
- Bổ sung hai thể tích ethanol ở 4oC, bảo quản dung dịch trên đá tuyết 30 phút.
Thu hồ i DNA bằ ng cách ly tâm 12.000 vòng trong 10 phút ở 4oC.
- Hòa tan trở la ̣i DNA trong 200 L đê ̣m TE (pH 7,6) và bổ sung 25 L của 3 M
sodium acetate và kết tủa DNA.
- Rửa cẩ n thâ ̣n tiể u thể với ethanol 70% và hòa tan trở lại DNA trong đê ̣m TE
(pH 7,6) tới thể tić h cuố i cùng là 10 L.
- Kiể m tra số lươ ̣ng và chấ t lươ ̣ng của đoa ̣n DNA bằ ng điê ̣n di polyacrylamide
gel. Lấ y mô ̣t th ể tích nhỏ tối thiểu trô ̣n với 10 L TE (pH 7,6), bổ sung thêm 2 L
gel-loading dye. Nạp mẫu và chạy điện di polyacrylamide gel ở nồng độ thích hợp.

Chạy điện di Ly tâm 12.000 vòng/phút

polyacrylamide gel ở 4ºC, lấy thể nổi

Xác định vị trí DNA Kết tủa DNA bằng ethanol ở

4ºC trong 30 phút
Cắt băng DNA ra khỏi gel,
chuyển vào eppendorf tube Ly tâm 12.000 vòng trong
10 phút ở 4ºC để thu hồi
Bổ sung đệm chiết DNA

ủ ở 37ºC kèm lắc nhẹ Hòa tan trở lại DNA trong
200 L đệm TE (pH 7,6)

Hình 19. Sơ đồ tóm tắt phương pháp cải tiến từ kỹ thuật của Maxam và Gilbert (1977)

22
Mạc Văn Trọng
trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com

KẾT LUẬN
Phương pháp điện di giúp nhận biết, phân tích và tinh sạch DNA. Nhờ
phương pháp này mà người ta ứng dụng để phân tích giải trình tự DNA, ứng dụng
trong các nghiên cứu về DNA rất hiệu quả.

Có nhiều loại khuôn đỡ được áp dụng cho kỹ thuật này. Nhưng mỗi loại phân
tử khác nhau sẽ phù hợp đối với loại khuôn đỡ khác nhau. Điện di agarose gel là
phương pháp tối ưu nhất đối với DNA còn polyacrylamide gel điện di được cả
nucleic acid và protein. Nói chung mỗi phương pháp đều có những ưu và nhược
điểm riêng, tùy vào từng trường hợp để tiến hành điện di theo cách nào là tốt nhất.

23