Research Report

EKSPRESI BONE MORPHOGENETIC PROTEIN-2 (BMP-2) PADA SEL

OSTEOBLAS YANG DITANAM DALAM NANO CHITOSAN-CARBONATE
APATITE SCAFFOLD

THE EXPRESSION OF BONE MORPHOGENETIC PROTEIN-2 (BMP-2) ON OSTEOBLAST

CELL PLANTED IN NANO CHITOSAN-CARBONATE APATITE SCAFFOLD

Maretaningtias Dwi Ariani*, Bambang Agustono*, Raissa Tryantakarina Neysa*

*Staf Pengajar Departemen Prostodonsia Fakultas Kedokteran gigi Universitas Airlanggga, Surabaya - Indonesia
**Mahasiswa Profesi Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga, Surabaya - Indonesia

ABSTRACT
Background: Scaffold is a synthetic graft function as fillers on the part that is defective and increase bone regeneration.
Some polymer materials, which have been developed in tissue engineering is chitosan. Chitosan in the form of nanoparticles
is neutral, not toxic, and have a constant stability. To further enhance the bone regeneration properties of graft substitution,
nano chitosan-carbonate apatite scaffold combined with bone morphogenetic protein-2 (BMP-2). Purpose: to observe the
enchancement of BMP-2 expression on osteoblast cells which is planted in nano-chitosan scaffold as bone regeneration.
Method: The increased expression of BMP-2 performed by immunohistochemistry method that has been previously done
planting osteoblast cells 2 x 106 in nano-chitosan scaffold, thereafter, incubating with autoclave 37°C for 1, 3 and 7 days.
Paraffin blocks were carried out on the sample and observe the paraffin block on day 1,3, and 7. Results: The results of
data analysis using Anova test results obtained by p < 0.050. This shows there is a difference between the significance of
day 3, 5, and 7. Conclusion: An increase in the expression of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) in the osteoblast cells
planted in nano-carbonate apatite chitosan scaffold on day 3, 5 and 7. The combination of chitosan nano-carbonate apatite
scaffold structure and have good retention for osteoblast cells proliferation.

Keywords: Scaffold, Chitosan, Carbonate Apatite, Nano Chitosan-Carbonate Apatite Scaffold, Bone Morphogenetic
Protein-2, Osteoblast Cells

ABSTRAK
Latar Belakang: Scaffold adalah sebuah graft sintetis yang berfungsi sebagai pengisi pada bagian yang cacat dan
meningkatkan regenerasi tulang Beberapa bahan polimer, yang telah dikembangkan dalam rekayasa jaringan adalah
chitosan. Chitosan dalam bentuk nanopartikel bersifat netral, tidak toksik, dan memiliki stabilitas yang konstan. Untuk lebih
meningkatkan sifat regenerasi tulang dari subtitusi graft, nano chitosan-carbonate apatite scaffold dikombinasikan dengan
bone morphogenetic protein-2 (BMP-2). Tujuan: Untuk mengetahui peningkatan ekspresi BMP-2 pada sel osteoblas yang
ditanam dalam nano-chitosan scaffold sebagai regenerasi tulang. Metode: Peningkatan ekspresi BMP-2 dilakukan dengan
metode imunohistokimia yang sebelumnya telah dilakukan penanaman sel ostoblas 2 x 10 6 dalam nano-chitosan scaffold,
kemudian dilakukan inkubasi dengan autoklaf 37°C selama 3,5, dan 7 hari. Sampel dilakukan blok paraffin dan pengamatan
dilakukan terhadap blok paraffin tersebut pada hari ke 3,5, 7. Hasil: Hasil analisa data menggunakan uji Anova didapatkan
hasil p<0.050. Hal ini menunjukkan terdapat perbedaan signifikasi antara hari ke-3, 5, dan 7. Kesimpulan: Terjadi
peningkatan ekspresi bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) pada sel osteoblas yang ditanam dalam nano chitosan-
carbonate apatite scaffold pada hari ke 3, 5 dan 7. Kombinasi dari nano chitosan-carbonate apatite scaffold memiliki
struktur dan retensi yang baik untuk proliferasi sel osteoblas.

Kata Kunci: Scaffold, Chitosan, Carbonate Apatite, Nano Chitosan-Carbonate Apatite Scaffold, Bone Morphogenetic
Protein-2, Sel Osteoblas
PENDAHULUAN proses regenerasi jaringan, salah satunya bone
Kehilangan gigi dapat menyebabkan resorbsi morphogenetic proteins (BMPs)5.
tulang alveolar. Ketika sifat osteoblastik tidak Bone Morphogenetic Protein (BMP) adalah
seimbang dengan osteoklastik, tulang menjadi kelompok faktor pertumbuhan dan sitokin yang
resorbsi atau berkurang massanya yang dapat dilihat dikenal karena kemampuan mereka untuk
jelas pada lingir alveolus. Salah satu cara untuk menginduksi pembentukan tulang dan tulang
mencegah resorbsi tulang alveolar adalah dengan rawan6. (BMPs) yang termasuk dalam superfamily
bone graft. Terdapat berbagai macam bone graft, dari transforming growth factor beta (TGF-β),
yaitu autograft yang merupakan graft ideal karena memiliki sifat osteoinduktif. Khususnya, BMP-2
berasal dari jaringan tulang yang berasal dari menunjukkan aktivitas osteoinduktif yang sangat
individu yang sama, xenograft merupakan jaringan kuat7. BMP-2 menjadi osteoinduktif growth factor
tulang yang berasal dari spesies berbeda, allograft yang digunakan secara klinis pada regenerasi8
merupakan jaringan tulang dari individu yang tulang. BMP-2 telah banyak diteliti untuk
berbeda, serta alloplastic graft merupakan jaringan meningkatkan penyembuhan fraktur karena sifatnya
tulang yang menggunakan tulang sintetis1. yang pleotropik. BMP-2 menguatkan stem cells
Kapasitas regenerasi jaringan dari bone graft pada tulang yang fraktur, mendukung angiogenesis
ini diukur dalam hal potensi osteogenik, dan menyebabkan differensiasi stem cells ke
osteokonduktif dan osteoinduksi2. Potensi osetoblas9.
osteogenik dari Chitosan merupakan natural polymers yang
bone graft ditentukan oleh sel yang mendukung mempunyai sifat biokompabilitas dan
pembentukan tulang, yaitu mesenchymal stem cells biodegradabilitas. Chitosan dalam bentuk
(MSCs), osteoblas dan osteosit. Osteokonduktif nanopartikel bersifat netral, tidak toksik, dan
merujuk pada scaffold yang menstimulasi bone cells memiliki stabilitas yang konstan. Chitosan
untuk tumbuh pada permukaannya3. Osteoblas meningkatkan pertumbuhan dan diferensiasi sel
berproliferasi dan diferensiasi dari preosteoblas oleh osteoblas pada kultur sel, memiliki karakteristik
osifikasi intramembranosa pada hari ke-3, lalu pada menguntungkan seperti bakteriostatik, hemostatik,
hari ke-7 terdapat puncak proliferasi sel pada dan penurun kolesterol10.
osifikasi intramembranosa4. Carbonate apatite (CA) merupakan bahan
Scaffold adalah sebuah graft sintetis yang biokeramik yang banyak dikembangkan dan
berfungsi sebagai pengisi pada bagian yang cacat dipelajari untuk menjadi material pilihan sebagai
dan meningkatkan regenerasi tulang. Scaffold sering bahan pengganti struktur tulang. Karena memiliki
dikombinasikan dengan sel dan growth factor untuk sifat bioresorpsi yang bagus, carbonate apatite
mendukung osteoinduktivitas dan penunjang dalam menjadi bahan pilihan untuk bedah rekonstruksi
tulang. Kombinasi antara chitosan dengan
carbonate apatite memiliki tingkat proliferasi sel dengan cara dianginkan. Kemudian diamati
yang tinggi, penambahan carbonate apatite pada menggunakan mikroskop cahaya dengan
chitosan meningkatkan luas permukaan dari pembesaran 1000x.
material untuk perlekatan sel. Pada penelitian ini HASIL
digunakan nano chitosan-carbonate apatite Dari hasil pengamatan dengan menggunakan
scaffold, karena material pada skala nano diketahui imunohistokima didapatkan hasil rata-rata
memiliki fungsionalitas sel yang lebih baik11. peningkatan ekspresi BMP-2 pada sel osteoblas
Berdasarkan penjelasan latar belakang tersebut, yang ditanam dalam nano chitosan-carbonate
penulis ingin meneliti tentang peningkatan ekspresi apatite scaffold pada hari ke-3, 5, dan 7.
bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) sel
osteoblas yang ditanam dalam nano chitosan- 18 Evaluasi Ekspresi BMP-2 pada Sel Osteoblas
carbonate apatite scaffold. 16 yang Ditanam dalam Nano Chitosan-
Carbonate Apatite Scaffold
14

Jumlah Ekspresi
BAHAN DAN METODE 12
Jenis penelitian ini adalah eksperimental 10

laboratoris dengan rancangan penelitian post test 8

only control group design. Sampel yang digunakan 6

adalah sel osteoblas dari femur tikus jantan, nano 4

chitosan-carbonate apatite scaffold. 2

Dilakukan penanaman sel osteoblas 2 x 106 0

hari ke-3 hari ke-5 hari ke-7
pada nano chitosan-carbonate apatite scaffold. Lalu
Gambar 1. Hasil pengamatan ekspresi BMP-2 sel
sampel diinkubasi selama dalam inkubator selama 3,
osteoblas yang ditanam dalam nano chitosan-
5, dan 7 hari. Setelah diinkubasi, sampel dibuat blok
carbonate apatite scaffold hari ke 3, 5 dan 7
parafin. Sebelum dilakukan pengamatan
menggunakan imunohistokimia (IHC), sampel
dicuci dengan larutan PBS pH 7.4, lalu diinkubasi
dengan menggunakan antibodi monoklonal anti-
BMP2 selama 60 menit. Setelah itu, diinkubasi
kembali dengan mengggunakan anti rabbit HRP
conjugated selama 40 menit. Sampel dicuci dengan
menggunakan dH2O, selanjutnya dilakukan Counter
staining menggunakan Meyer Hematoxilen yang
diinkubasi selama 10 menit dan dicuci
menggunakan tap water. Sampel dikeringkan
Gambar 2. Gambaran imunohistokimia (IHC) berwarna merah kecoklatan terlihat adanya
ekspresi BMP-2 pada hari ke-3 peningkatan.
Tabel 1. Hasil uji Oneway Anova
Sum of df Mean F Sig.
Squares Square

Between 83.429 2 41.714 9.522 .002

Groups

Within 78.857 18 4.381

Groups

Total 162.286 20

Uji Anova untuk mengetahui ada tidaknya

Gambar 3. Gambaran imunohistokimia (IHC)
perbedaan yang signifikan antara hari ke 3, hari ke 4,
ekspresi BMP-2 pada hari ke-5
dan hari ke 5. Statistik uji yang digunakan adalah P-
value atau Asymp. Sig atau Sig. dalam SPSS.
Apabila nilai Sig. kurang dari 0.05 maka H0 ditolak
yang berarti terdapat perbedaan yang signifikan
antar kelompok perlakuan. Sebaliknya, jika Sig.
lebih besar dari 0.05 maka H0 diterima yang artinya
tidak ada perbedaan yang signifikan antar kelompok
perlakuan. Dari hasil uji Anova didapatkan p < 0.050
pada hari ke 3, 5, dan 7 yang berarti terdapat
perbedaan signifikasi.

Gambar 4. Gambaran imunohistokimia (IHC)

ekspresi BMP-2 pada hari ke-7

Dari yang terlihat pada gambar mikroskopis

pengamatan dengan IHC terlihat pewarnaan sel
ostoblas yang berwarna biru, ekspresi BMP-2
Tabel 2. Hasil uji Post Hoc Tukey HSD dengan BMP-2 hari ke 5 tidak terdapat perbedaan
(I) (J) Mean Std. Sig. 95% Confidence signifikasi.
Kelo Kelo Differenc Error Interval
mpok mpok e (I-J) PEMBAHASAN
Lower Upper
Chitosan meningkatkan pertumbuhan dan
Bound Bound
differensiasi osteoblas pada kultur sel dan memiliki

BMP2 -2.85714* 1.11879 .050 - -.0018 karakteristik menguntungkan seperti bakteriostatik,

Hari 5.7125 hemostatik dan penurun kolesterol. Carbonate

BMP2 ke-5 apatite memiliki kelebihan dibandingkan dengan
Hari hydroxyapatite. Pada carbonate apatite yang
ke-3 BMP2 -4.85714* 1.11879 .001 - -2.0018 diproses dengan suhu rendah memiliki tingkat
Hari 7.7125 kristal yang rendah seperti tulang sehingga diyakini
ke-7 dapat diresorbsi oleh tubuh dalam prosesnya12.
BMP2 2.85714* 1.11879 .050 .0018 5.7125 Selain itu carbonate apatite juga memiliki tingkat
Hari osteokonduktivitas yang tinggi, sehingga diharapkan
BMP2 ke-3 dapat merangsang pertumbuhan tulang baru13.
Hari Carbonate apatite-chitosan scaffold memiliki
ke-5 BMP2 -2.00000 1.11879 .202 - .8553
struktur tiga dimensi dengan pori yang saling
Hari 4.8553
berhubungan, baik bentuk tidak rapuh serta
ke-7
memiliki kemampuan untuk mendukung
BMP2 4.85714* 1.11879 .001 2.0018 7.7125 perkembangan dan diferensiasi osteoblas14. Dimensi
Hari dan bentuk pori merupakan faktor penting terjadinya
BMP2 ke-3 proses osteointegrasi. Namun pada penelitian ini
Hari digunakan nano chitosan-carbonate apatite scaffold
ke-7 BMP2 2.00000 1.11879 .202 -.8553 4.8553
karena material berskala nano memiliki
Hari
fungsionalitas yang lebih baik, dan lebih mudah
ke-5
teresorbsi. Pada penelitian Levengood and Zhang,
2014, scaffold dengan kekuatan mekanis yang tinggi
Pada uji ini dilakukan perbandingan antara 2 lebih efektif dalam mendukung proliferasi sel
kelompok perlakuan. Pada beberapa perbandingan osteogenik, maka dari itu dilakukan penambahan
antara 2 kelompok perlakuan terdapat perbedaan carbonate apatite pada nano-chitosan scaffold
signifikasi (lampiran 3). Namun pada BMP-2 hari ke berfungsi meningkatkan luas permukaan untuk
5 dengan BMP-2 hari ke 7 dan BMP-2 hari ke 7 perlekatan sel osteoblas2.
 Ekspresi BMP-2 meningkat pada awal, pertumbuhan massa tubuh, termasuk pertumbuhan
kemungkinan untuk membantu proses differensiasi tulang dan metabolisme nitrogen18.
sel prekusor menjadi kondrogenik atau osteogenik. Pada saat pengambilan kultur sel, kultur dibagi
BMP-2 merupakan prototype subgroup dari BMPs menjadi 9 plate dari 2 ml. Kemudian, sampel
yang memicu diferensiasi multipotent mesenchymal diinkubasi dalam inkubator selama 3, 5, dan 7 hari.
progenitor cell lines menjadi osteogenic lineage15. Setelah itu kultur ditanam dalam nano chitosan-
Pada penelitian ini dilakukan evaluasi carbonate apatite scaffold, digunakan partikel nano
6
peningkatan BMP-2 pada sel osteoblas 2x 10 yang karena keuntunganya yang dapat menghantarkan
ditanam dalam nano chitosan-carbonate apatite senyawa obat dengan baik sampai ke unit-unit
scaffold hari ke 3, 5, dan 7. Proses penempelan sel terkecil dari tubuh, meningkatkan efisiensi
osteoblas ke permukaan nano chitosan-carbonate distribusi, serta obat tepat target, sehingga
apatite scaffold berlangsung selama beberapa jam, meningkatkan efek terapeutik dan mengurangi
kemudian sel menyebar ke permukaan nano toksisitas.
chitosan-carbonate apatite scaffold. Proses Evaluasi menggunakan imunohistokimia
penempelan sel osteoblas ke seluruh permukaan membuktikan bahwa proses pertumbuhan yang
material bone graft bergantung pada kompabilitas berkaitan dengan proliferasi sel dan jaringan terbaca
dari permukaan material bone graft dan ekspresi dari hari ke-3, 5, dan 7 terlihat peningkatan BMP-2.
dari komponen biologis adhesif, yang meliputi Dari hasil penelitian terjadi peningkatan BMP-2
sekresi ECM (Extra Cellular Matrix) serta hasil karena proliferasi sel osteoblas, hal ini dikarenakan
penempelan sel dengan permukaan material. Proses penambahan carbonate apatite pada chitosan
ini dimediasi oleh formasi fokus adhesi dan scaffold memperluas area yang digunakan untuk
pembentukan plak yang tersusun dari integrin perlekatan sel.
transmembran yang menghubungkan antara Pada penelitian ini didapatkan rata-rata jumlah
sitoskeleton dengan ECM hasil sekresi antara ekspresi BMP-2 pada hari ke-3 sebesar 9.14, hari
material dengan sel16 ke-5 sebesar 12, dan hari ke-7 sebesar 14. Pada hari
Pengambilan kultur sel osteoblas menggunakan ke-3 dan 5 terdapat peningkatan yang pesat daripada
primary cells dari femur jantan, digunakan tikus hari ke-5 dan 7, karena BMP-2 mempunyai
jantan karena laju pertumbuhan tikus jantan lebih pengaruh induksi yang sangat besar dalam
cepat dari tikus betina. Pada hewan laju diferensiasi sel osteoblas secara in vitro dan formasi
pertumbuhan juga dipengaruhi oleh hormon, tidak tulang secara in vivo. Kemampuan BMP-2 dalam
hanya hormon pertumbuhan, tetapi juga hormon menginduksi diferensiasi sel osteoblas, dimonitori
androgen, glukokortikoid, insulin, dan tiroid17. oleh produksi ALP dan ekspresi osteocalcin yang
Hormon-hormon tersebut mempengaruhi digolongkan dari awal hingga akhir marker
diferensiasi19
 Banyak BMP-2 yang berasal dari substrat
osteokonduktif yang mengandung mineral tulang
untuk meningkatkan osteogenesis. Penelitian yang
menggunakan BMP-2 dengan kombinasi
hydroxyapatite-chitosan scaffold menunjukkan
peningkatan ALP20, hal ini berkaitan dengan
penelitian yang digunakan saat ini BMP-2 dengan
kombinasi nano chitosan-carbonate apatite scaffold
juga mengalami peningkatan yang signifikan.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat
disimpulkan bahwa terjadi peningkatan ekspresi
bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) pada sel
osteoblas yang ditanam dalam nano chitosan-
carbonate apatite scaffold pada hari ke 3, 5 dan 7.
DAFTAR PUSTAKA
1. Jameson, W. S. "Fabrication and Use of a Metal
Reinforcing Frame in a Fracture-Prone Mandibular
Complete Denture." J Prosthet Dent 83, no. 476
(2000).
2. Polo-Corrales, Liliana, Magda Latorre-Esteves,
and Jaime E. Ramirez-Vick. "Scaffolds Design for
Bone Regeneration." J. Nanosci Nanotechnol 14,
no. 1 (January 2014): 15-56.
3. Myeroff, C., and M. Archdeacon. "Autogenous
Bone Graft: Donor Sites and Techniques." J. Bone
Joint Surg. Am. 93, no. 23 (December 2011): 2227-
36.
4. Dimitriou, R., E. Tsiridis, and P. V. Giannoudis.
"Current Concepts of Molecular Aspects of Bone
Healing." Injury 36, no. 12 (2005): 1392-404.
5. Levengood, Sheeny Lan, and Miqin Zhang.
"Chitosan Based Scaffold for Bone Tissue
Engineering." J Mater Chem B Mater Biol Med 2,
no. 21 (June 2014): 3161-84.
6. Prakash, C. A., J. Parthiban, R. Balakrishnan, B.
Anandh, and B. Lokesh. "Bone Morphogenetic
Prooteins- An Update." Biomedical and
Pharmacology Journal 8 (October 2015): 329-333.
7. Wang, Hai, et al. "Osteogenic Effect of
Controlled Released rhBMP-2 in 3D Printed Porous
Hydroxyapatite Scaffold." Colloid and Surfaces B:
Biointerfaces 141 (2016).
8. Salim, Sherman, and Maretaningtias Dwi Ariani.
"In Vitro and In Vivo Evaluation of Carbonate
Apatite-Collagen Scaffolds with Some Cytokines
for Bone Tissue Engineering." J. Indian
Prosthodont Soc. 15, no. 4 (2015): 349-55.
9. Reves, Benjamin T., Jessica A. Jennings, Joel D.
Bumgardner, and Warren O. Haggard.
"Osteoinductivity Assesment of BMP-2 Loaded
Composite Chitosan-Nano-Hydroxyapatite
Scaffolds in a Rat Muscle Pouch." Materials 4
(2011): 1360-1374.
10. Balicka-Ramisz, A., A. Wojtasz-Pajak, B.
Pilarczyk, A. Ramisz, and L. Laurans.
"Antibacterial and Antifungal Activity of Chitosan."
ISAH 2 (2005): 406-8.
11. Balicka-Ramisz, A., A. Wojtasz-Pajak, B.
Pilarczyk, A. Ramisz, and L. Laurans.
"Antibacterial and Antifungal Activity of Chitosan."
ISAH 2 (2005): 406-8.
12. Leewenburgh, S., et al. "Osteoclastic Resorption
of Biomimetic Calcium Phosphate Coatings In
Vitro." J. Biomed. Mater. Res. 56 (2001): 208-15.
13. Zakaria, Myrna Nurlatifah, and Arief Cahyanto.
"An Introduction to Carbonate Apatite as a
Biocompatible Materials in Dentistry." Pertemuan
Ilmiah Tahunan 8, Prodi Gigi Unjani, 2016: 80-84.
14. Ariani, Maretaningtias Dwi, Ayumu Matsuura,
Isao Hirata, Takayasu Kubo, Koichi Kato, and
Yasumasa Akagawa. "New Development of
Carbonate Apatite-Chitosan Scaffold Based on
Lyophilization Technique for Bone Tissue
Engineering." Dental Materials Journal 32, no. 2
(2013): 317-25.
15. Rizalah, Suci, Muhammad Hasan, and Septa
Surya Wahyudi. "Pengaruh Pemberian Kitosan
Cangkang Udang Putih (Panaeus merguiensis)
terhadap Ketebalan Trabekular Femur Tikus Wistar
Betina Pasca Ovariektomi." e-Journal Pustaka
Kesehatan 4, no. 1 (Januari 2016): 146-51.
16. Liu, X., J. Y. Lim, H. J. Donahue, R. Dhurjati,
A. M. Mastro, and E. A. Vogler. "Influence of
Substratum Surface Chemistry/Energy and
Topography on the Human Fetal Osteoblastic Cell
Line hFOB 1.19: Phenotypic and Genotypic
Responses Observed In Vitro." Biomaterials 28, no.
31 (July 2007): 4535-50.
17. Ganong, F. W. Fisiologi Kedokteran. Jakarta:
EGC, 2008.
18. Soeparno. Ilmu dan Teknologi Daging.
Yogyakarta: Gadjah Mada University Press, 2009.
19. Ogasawara, Toru, et al. "Bone Morphogenetic
Protein-2 Induced Osteoblast Differentiation
Requires Smad-Mediated Down-Regulation of
Cdk6." American Society for Microbiology 24, no.
15 (August 2004): 6560-8.
20. Zuo, Aijun, et al. "BMP-2 Modified
Hydroxyapatite/Chitosan Composite Scaffold for
Bone Engineering." Bioinformatics and
Biomechanical Engineering, 2008: 888-92.
2