TECNICAS BIOTECNOLOGICAS APLICADAS AL MEJORAMIENTO GENETICO DE PLANTAS Carlos Mufoz Schick Nicole Hewstone Oliger Blotecnologia Vegetal Centro Regional de investigacién La Platina Instituto de Investigaciones Agropecuarlas Santiago, Chile INTRODUCCION realizado por el hombre desde antes del conocimiento de las leyes de la genética, Sus objetivos basicos han sido aumentarlosren- dimientos, bajar los costos de produccién, mejo- rarla calidad de los productos e Incorporar éreas conlimitactones al cultivo productivo, E: mejoramiento genético de plantas ha sido Para cumplr con estos objetivos los mejoradores generaimente utlizan una metodologia que tle- ne las siguientes etapas: 1. Coleccién y/o creacién de la variabilidad. En la noturaleza existe casi toda la varlabilidad que el hombre necesita para el mejoramiento, sin ‘embargo, ella esta geograticamente dispersa, lo que hace necesario reuniria en colecciones 0 bancos de getmoplasma desde los cuales el mejorador puede tomarlay utilzarla en mejora- miento. Cuando no existe variabllidad, ella pue- de ser cteada, recuttiendo a técnicas mutagé- nicas. 2, Combinacién de la varlabilidad existente. La variabilidad presente en diferentes individuos, hay que combinarla en uno solo. Para ello se rea- lizan cruzamlentos sexuales entre individuos con caracteristicas agronémicas especificas, con la ‘esperanza de que en alguno de los descendien- tes aparezcan los caracteres de interés combl- nados, 3, Seleccién de los individuos con caracteres agronémicos de interés, La seleccién se hace en poblaciones relativamente grandes, de dificil manelo, por observacién directa de los caracte- 198 de interés, 91 4, Multipicactén de los Individuos selecctonados. Para que los individuos selecclonados puedan ser tiles, ellos deben ser multiplicados y puestos a disposicién de los agricultores a través del pro- cesode, 5, Distibucién y comercialzacién de las nuevas varledades generadas. La blotecnologia puede ser utilizada en cada una de las etapas descritas, con el objeto de acelerat el proceso de produccién de nuevas variedades 0 de facilitar su multiplicacién y comercializacién, porlo tanto, ella no reempla- za. cl mejoramiento genético tradicional, sino que esun complemento cada vez més indispensable deéste. A continuaci6n se describe. resumidamente, de qué manera la blotecnologia puede ser utliza- da en cada una de las etapas del proceso de produccién de nuevas vatiedades, COLECCION Y/O CREACION DELA VARIABILIDAD Intercambio de Germoplasma Las técnicas de cultivo de telidos han facilitado, ‘enoimemente el Intercambio de germoplasma, Parlicularmente en especies de propagacién vogetativa, Esto se debe a que las técnicas de cultivo in vitto, porlo general, garantizan la sani= dad del material, especialmente en cuanto asu contaminacién con honges y bacterios, disminu- yendo el rigor de las medidas cuarentenarias de post-entrada, Una de las primeras especies en Que se reallz6 Intercambio de germoplasma in Vitro fue en esparrago (Kahn, 1976). El CentroIntemactonal de la Papa, utliza esta técnica en formacas! rutinaria para intercamblo de germo- plasma, asegurando asia disttibucién de mate- ‘lal libre de enfermedades (Withers, 1983). En Chile se ha utlizado la técnica para el intercam- blo de gemmoplasma de ajo (Muroz et al, 1988), Conservacién de Germoplasma La conservacién in vitro de gemmoplasma es un método més eficiente para la conservacién de algunas especies, ya que tiene un costo més re- ducido, se pueden manejar colecclones més grandes, porque ocupan menos espacio yson de més facil acceso para los mejoradores (Withers, 1983). La conservacién de geroplasma Puede hacerse a temperaturas bajas, en solu- clones nutritivas de mantencién (Wilkins ef aI., 1982; Bhat y Chandel, 1993), 0 puede recurirse a la ctiopreservacién, que es la conservacién a ul- tra boja temperatura (Steponkus, 1985), Todas estas técnicas estén particularmente adaptadas para especies de propagacién vegetative. Im- portantes centros intemacionales estén traba: Jando en ia conservacién de gemoplasmas ba sic0s usando estas técnices (el CIAT en cassava: el CIP en papa y camote, etc.). La zanahoria, (Daucus carota) ha sido la planta modelo util- zada para desarrollar ios métodos de crlopre- servacién (Roca, 1986), pero yase ha extendido eluso de esta técnica a muchas especies tales como Solanum spp., Pisum sativum, Asparagus officinalis, Cichorlum intybus L., |pomoea bata- fa, Allium tuberosum y muchas otras especies horficolas (Engelmann, 1991) y fruticolas (Withers, 1992), \Variabilidad Somacional Las plantas propagadas in vitrono slempre son Iguales a la planta madre, lo cual es una des- ventaja desde el punto de vista de la micropro- pagacién, pero una ventaja para ia creaclén de nuevas varledades. Esta variabliidad repre- senta una nueva forma de mutagénes’s, pero que difiere en cuanto al tipo de variabllidad que es posible lograr mediante radiaciones lonizantes 0 mutagénesis quimica, En este caso, se trata de rescatar la varlablidad naturalmente existente ‘en.un telido determinado y que se produce du- rante el proceso de diferenciacién, a medida ue se van acumulando errores durante la du- plicacién del material genético (Scowcroft y 92 Larkin, 1982), Esta varlabilidad, sumada a aqué- lia producida por el efecto mutagénico de algu- nos componentes del medio de cultivo, constitu- ye la llamada varlabilidad somactonal (Larkin et i, 1985). Esta varlabilidad oftece la posibilidad. de obtener cambios en uno 0 pocos caracteres de un buen cultivar, sin alterar el resto del geno- tipo. Desgracladamente, en algunos casos no es heredable (Rao et al., 1993) En glo (Alllum sativum) se hai estudiado la varia bldad somacional como un interesante método de mejoramiento genético, ya que se producen poliploides y aneuploides como resultado del cuttivo in vitro (Novak, 1984). Eltomate (Lycoper- sicon esculentum) ha sido una de las especies en que se ha tratado de establecer las bases genéticas de Ia varlacién somacional (Evans, 1984), donde las varlantes se han usado para el mejoramiento (Barden et al., 1986; Evans, 1987) y donde se han hecho estudios comparando la va~ tlabllidad somacional con la mutagénesis quim!- ca inducida (Gavazzl et al., 1987). Estudios simi- lares aos realizado en tomate se han efectua- do en papa (Evans ef al, 1986; Ramulu, 1986: Jones, 1987), En aplo (Apium graveolens) por otra parte, se ha utllzado Ia variabilidad somacional para buscar resistencia a Fusarium oxysporum (Heath-Pagliuso ef al., 1988; Toth y Lacy, 1991), en zanahorla se ha encontrado resistencia a Altemaria dancl (Ougdale et al., 1993) y en to- mate, a cancer bacterial Bulk ef al, 1993). Mutagénesis in vitro Lamutagénesis convencional tiene la desventa- Ja que muchas veces se producen quimeras (indi- viduos compuestos de células de composicin genética dlstinta), que deben separarse en sus distintos componentes antes de poder utilizar el material generado, Debdo a que tanto Ia orga- nogénesis como la embriogénesis in vitro tienen Un orlgen unicelular, el quimerismo noes un pro- blema con la mutagénesis in vitro, por o cual la técnica tiene una clara ventaja sobre la muta- génesis tradicional (Broerties, 1982). Las especies en que la mutagénesis In vitroha sido empleada exitosamente Incluyen al apo (Apium graveolens) (Merrick y Colin, 1981; Orton, 1985) y ala papa (Solanum tuberosum) (Glime- lius, 1988), especiaimente pora obtener resisten- cla a enfermedades. En tomate, Evans (1984) ‘obtuvo nuevas lineas con mayor pigmentacién.Poliploidia Un ejemplo del uso de la ploicia es en la produc- clén de sandias (Citrullus lanatus) tiploldes, las cualesno poseensemillas. Esta caracteristica se Obtiene al cruzar individuos diploldes con tetra- ploldes.Los triploldes podrian micropropagarse directamente, pero el procedimiento es costoso. Por otra parte, la propagacién de los tetraploldes porsemiiias es difcil,ya que se producen pocas semillas y con bajo vigor y viabllidad, El cultivo in vitro puede usase para la clonacién de genotl- postetraploldes ya obtencién de éstos median- te tratamientos con colchicina de los individuos diploides (Ng, 1986). En melon (Cucumis melo) se puede proceder de Igual forma y, de hecho, se han obtenido individuos tetraploides por embrtio- génesis somatica, los que serén usados para pro- ducit melones tiploides, sin semilla (Adelberg et l,, 1993). COMBINACION DE LA VARIABILIDAD ‘Cruzamientos Distantes La naturaleza ha creado una serie de barreras que Impiden el cruzamiento entre especies dis- tintas, lo que Imposibilita el lite flujo de genes de ung especie a otra. Muchas veces, sin em- bargo, los mejoradores necesitan transferir genes de una especie a otra para poder traspasar caracteres de Importancia agronémica. Existen ‘actualmente una serie de técnicas que faclitan de manera considerable el traspaso de genes entre especies y atin entre géneros distintos, lo que abre nuevas posibilidades al mejoramiento genético de algunas especies, Algunos de estos técnicas son: (a) Rescate de Embriones Inmaduros CConsiste en cultivar in vitro el embrién reclén for- mado en un medio nutitive especifice. Con ello es posible llevar hasta la madurez plantas que bajo conaiclones naturales estarian destinadas @ abortar (Raghavan y Stivastava, 1982). Se ha usado esta técnica ena obtencién de resisten- cia a virosis al hibridizar especies resistentes con especies susceptibles de mayor valor econémi- co, como en Lycopersicon peruvianum x L. escu- lentum, donde se obtuvo resistencia al virus del mosalco del tabaco (TMV) (Laterrot, 1973). En. Vigna mungox V. radiatase obtuvo resistencia. al virus del mosaico amarillo de la remolacha (BYMV) (Gosal y Bajaj. 1983) y en el caso de 93 Cucurbita ecuadorensisx C. pepo se logt6 tras- pasar resistencia a 3 virus (CMV, WMV, ZYMV) (Dumas de Vaulx y Pitrat, 1980). Otro uso impor- tante de esta técnica hasido en el mejoramien- to genético para la obtencién de plantas ha- ploides,a través de [a eliminaclén de los cromo- somas de uno de los progenitores, en especies donde el cultivo de anteras 0 polen no ha sido ‘exitoso, 0 hasido muy dependlente del genotipo. Especiolmente se ha usado esta técnica ence- reales. tigo x maiz, parala obtencién de haplol- des de trigo (Triticum aestivum) (Laurie y Bennett, 1987; Laurie y Bennett, 1988; Suenaga y Nakall- ma, 1989) y cebada (Hordeum vulgare L.) cru- z4ndola con Hordeum bulbosum (Pickering, 1989; Chen y Hayes, 1989). (b) Fusion de Protoplastos Los protoplastos son células vegetales desprovis- tas de pared celular. Protoplastos de especies distintas, cultivados en un mismo medio, pueden serinducidos a unirse mediante el uso de impul- sos elécticos (electroporacién) o utlleando Polie- tilenglicol (PEG) (Glimelius, 1988). Estas células unidas pueden, en algunos casos, dividitse ylle- gar a regenerar una planta completa, forman- do lo que se conoce como un hibrido siméttico. En ottos casos, durante las divisiones sucesivas de Ios protoplastos unidos, se van eliminando to- tal o parcialmente los cromosomas de uno de los padres, dando orlgen alos llamados hibridos asimétricos, Estos ultimos son de gran utilidad tanto en el mejoramiento de plantas (lineas de adicién), como en estudios conducentes al mapeo de genes (Rao, 1982; Giimelius, 1988). También, utlizando la fusi6n de protoplastos, se pueden obtener los llamados cibridos, que son, Individuos con el citoplasma de una especie yel niicleo de otra dlstinta, Estos cibridos tienen par- ticular utilided para combinar genes extranu- cleares, es decir, aquéllos que se encuentran en 0s mitocondrios y plastidios (Lefrancols et al., 1993). Uno de estos genes es el responsable de la macho esterlidad citoplasmética, caracterst!- cade mucha utlidad ena obtencién de hibri- dosF1 (Galun, 1982). Algunos cruzamientos interespecificos obtenidos ‘mediante la fusién de protoplastos son: Solanum sisymbiifollumx S, melongena donde se obtuvo resistencia a nematodos para esta ultima espe- ole (Gleddle ef al., 1986). Para la obtencién de cllridos, se cruz6 Lycopersicon esculentum x L. Pennelllipretendiendo traspasar de este titimolamacho esterilidad citoplasmética al tomate (O'Connell y Hanson, 1985). En Solanum tubero- sum. S, brevidensy S, tuberosum. $, phurejase obtuvo resistencia a PLRV y a Phythophtora infestans, respectivamente (Glimelius, 1988; Xuy Pehu, 1993; Polgar etal, 1993), En citicosse han ‘obtenido hibridos sométicos entre Citrus sinensis x C, reticulata plantas tetraploides de Ia fusién de distintas especies de Citrus, paraila produc- ci6n de triptoides sin semilia (Grosser ef al, 1992; Louzada ef al., 1992). (©) Polinizacién in vitro En aquellos casos en que Ia Incompatibllidad Interespecifica o intergenérica se maniflesta a nivel de prefertiizacién, es posible recurrir a esta técnica. Consiste en poner en contacto directo el polen y los évulos de especies distintas con ta esperanza de que ocurra Ia fertlizacién. Para ello, se puede recurtl, por ejemplo, a la inyec- clén de polen enlacavidad ovérica o al cultivo In vitro de polen y 6vulos en un medio liquido (Rangaswamy, 197), Las especies de Solanum han sido las Gnicas especies horticolas en que se han hecho polinizaciones in vitro (Shivanna, 1982). (B) Cultivo de Anteras y de Polen Mediante esta técnica es posible fa obtencién de plantas haploides, es decir, ndividuos conia mitad de la dotacién cromosomal de Ia especte. ‘Aeestas plantos, se les duplica el niimero de cto- mosomas, mediante el uso de colchicine, obte- niéndose las plantas conocidas como doble- haploides, Los doble-haploides tlenen unaserie de usos y ventajas en genética y mejoramlento vegetal. En primer lugar, se obtiene un individuo 100% homocigoto; porlo tanto, se expresan los genes recesivos, ya que no hay dominancia, yes posible hacer seleccién directa de estos genes. Estos Individues, o lineas puras, son utilzados en, Ia obtenclén de hibridos FI, de uso tan corlente hoy dia en horticuttura (Riggs, 1988). En segundo lugar, ia homocigosis se obflene en una genera- ccién,sin tener que reallzar autocruzas sucesivas, Se han obtenido resultados positivos con esta técnica en mas de 80 especies, siendo el espé- trago (Asparagus officinails) una de las primeras ‘especies horticolas en que la técnica se aplicé exitosamente, Esta es una especie dioica y pe- rene; por lo tanto la haploldizacién es la unica poslbllidad de obtener material homocigético en corto tlempo, La planta masculing es heieroga- 94 méticay. a través del cultive de anteras. es po- sible obtener plantas supermachos, es deci, plan- tas homocigotas para todos sus caracteres: por lo tanto, al usarr estas plantas como padres ia FI ‘es completamente mascullna (Doré, 1987: Colby yPelice, 1988) Enberengena (Solanum melongend) el cultivo de anteras ha permitido la obtenclén de lineas FI de haploldes duplicados, que han sido de gran utilldad en los programas de mejoramlento, al Igual que en otras especies de Solanum ingsity Hanneman, 1987), En Brassica oleraceay B. campestris se han ob- tenido resultados positives en varias de las sub- especies al cultivar anteras © polen in vitro Deng ef al., 1982; Ockendon, 1984; Leluy Bollon, 1985: Biddington et ci, 1988). En pimentones (Capsicum annum), ha sido im- pPortante el cultive de anteras y el uso de hapiol- des en el estudio de ia resistencia a enfermeda- des (Dumas de Vaulx y Pochard, 1986). (@) Ingenieria Genética Esta es una de las técnicas que tendré mayor Impacto en el mejoramiento genético vegetal en el futuro, En este caso no se recure al azar para Ingertar un gene en el genoma de laplanta hués- ped, como ocurre en el mejoramlento tradicio- nal, sino que es posible insertar una secuencia ‘specifica de nucledtidos con la esperanza que ésta se exprese fenotipicamente. En el estado ‘actual de desarrollo de esta técnica, es gene- ralmente necesaria la utllizacién de vectores para introducir en las plantas de Interés, genes que han sido previamente identificados, clona- dos y modificados, Los vectores més utlizados son los plasmidios (ADN extra cromosomal presente enalgunas bacterias) ylos virus. Ademés, no s6lo es necesaria la introduccién del gen estructural (aquél que codifica para el caracter de inte- 16s), sino que es necesario dotar a éste de las secuenclas de nucleétidos que permitan su in- sercién y expresién ena planta huésped. Por Ultimo, estos llamados genes quiméricos deben contener uno o mas genes que permitan selec- cclonar las plantas transformacias. El gen més am- pllamente utilzado coro marcador es el NPT-I, que conflere resistencia clertos antibiéticos, en tonto que dentro de los genes que permiten la expresién del gen estructural ha sido el promotor del virus del mosaico de la colifior (CaMV 35S) el més usado (Jenes ef al., 1993).Los métodos més utilzados para la transferencla de genes en especies vegetaies son: ©) Bombardeo de genes: Esta técnica es similara la mictoinyecelén, pero mas eficiente en plan- tas. Con una ‘pistola' se disparan microproyec- tiles de oro o tungsteno recublertos con ADN (Klein etal, 1987). Este sistema ha sido usado comin- mente en monocotlledéneas, donde el uso de vectores ha sido mas dificil (Chilstou, 1992). Asi se han obtenido plantas transgénicas de caha de aziicar (Bower y Birch, 1992) tigo resistente Gherbicidas (Weeks et al., 1993; Mortlsh ef al., 1998). b) Uso de vectores: Como ya se mencioné, los vectores més cominmente usados son los plas- midios, particularmente aquellos derivados del Agrobacterium tumefaciens (plasmidios 11) (Grimsley et al., 1986) y los derivados de virus Gleat ef al, 1986). Existen numerosos ejemplos de transformaciones que se han realizado exitosamente en plantas de cultivo utlizando alguna de las técnicas an- tes mencionadas. La resistencia a antibisticos (kanamicina) que se utiliza con fines de selec clén (Owens ef al, 1988): a resistencia a herb cldas como el glifosato (Comal ef al., 1985) 0 Basta (Schroeder ef al, 1993); fa resistencia a vi- rus através de proteccién cruzada con virus no Infectivos (se inserta s6lo lasecuencia que codi- fica para la cubierta proteica de los virus, que sla que confiere la resistencia) o mediante ta utilzacién de RNA-satélite (pardsitos de los virus que pueden reducirla tasa de multiplicacién y la expresion de sintomos) (Kerr, 1987); la resisten- clad insectos, utlizando la toxina que produce 1 Bacillus thuringiensis (Woolhouse, 1987; Perlak et al, 1993); retardo en la maduracién de frutos, lucker, 1990; Klee, 193; Redenbaugh y Hiatt, 1993) 0 cambios en el metabolismo de los Gcidos grasos (Hildebrand ef al, 1998),son cigunos ejem- los de transformacion genética que hoy se co- nocen, Laposibllidad de insertor gones especificos usan- do la ingenieria genética, puede tedricamente ampliarse a una serle de offos caracteres, como podiian ser la mejora de la calidad proteica de algunos cultives (papas, tiigo, maiz, ete,), lare- sistencia a otras enfermedades distintas de los vitus, la resistencia a condiciones de estrés (resis- tencia a ftio, salinidad, alta temperatura), etc. 95 Lautiizactén de técnicas de ingenleria genética esta actuoimente limitada por el desconocimien- to existente sobre los mecanismos de acclén de genes especificos, de modo de poder aislatlos y Caracterizarios para luego modificarlos,transm- tirlos y hacer que ellos se expresen en la planta huésped. Debido a ésto, la tarea més importan- te de los préximos afios ser, precisamente, la Identificacién y caracterlzacién de genes que tengan importancia agronémica. SELECCION DE LA VARIABILIDAD ‘Acontinuacién se mencionan las metodologias de seleccién de nuevas varledades dentro del marco de la Biotecnologia. Seleccién in vitro Consiste en aplicar técnicas microbiolégicas de seleccién a plantas superiores, Para ello se ulll- zan suspensiones de células, las que son someti- das a diferentes presiones de selecclén, a partir de las cuales es luego posible la regeneracién de plantas completes. Con ello es posible utilizar poblaciones inmensamente grandes, que no pueden ser utlizadas s se usan plantas comple- tas, Como criterio de selecclén se ha utilzado la resistencia. salinidad, ita temperatura, atox- nas producidas por hongos y bactetios, etc.,con resultados muy promisorios para algunos casos, particulamente la resistencia a toxinas produc!- das por algunos patégenos (Behnke, 1980), Seleccién precoz Consiste en buscar o identificar genes de interés ‘agronémico que estén ligados a un marcador bloguimico como son las isoeneimas, RFLP (poll- morfismo de fragmentos de restriccién) (Flavell 1982), RAPD (amplificacién de polimortismo de DNA ai azar). En tomate (Lycopersicon escu- lentum), por ejemplo, se ha descublerto una Isoenzima que esta ligada al gen de laresisten- claa nematodes, lo que posibllitala seleccién de los individuos resistentes sin necesidad de evaluar las selecciones bajo condiciones de campo (Pineda ef al,, 1993). Esto facilita la se- lecclén y boja los costos de! proceso de mejora- miento. Los RFLP pueden utlizarse en fa misma forma y con losmismos efectos, por ejemplo, RFLP ligados a coracteres cuantitativos, como sélidos solubles en tomate (Beckmann y Soller, 1986).MULTIPLICACION DE VARIEDADES Micropropagacién La micropropagacién representa una técnica muy vallosa para la multipticacién masiva de materiales escasos, como podria ser el caso de la clonacién de padres en a obtenclén de hibr- dos F1 (Riggs, 1988).0 parala clonacién de pa- dres en |a obtencién de semilla botdnica de papas (Malagamba, 1988). La técnica también se ha utlizado exitosamente para la multiplica- clén rapida de genotipos escasos de especies como lechuga (Lactuca sativa), endivia (Cycho- rium Intybus) (Dor6, 1984) y tomate (Lycopersicon esculentum) con esterlidad nuclear (Riggs, 1988), parala propagacién de plantas élites de algu- as especies frutales (Jordén ef al, 1993) 0 para la muttipiicacién de plantas libres de virus. En especies con ginoecia, como Cucumis sativus, la micropropagacién ha sido importante en la man- tencién de lineas con flores pistiladas solamente (Ng. 1986). Cultivo de Apices Meristeméticos En|as especies de propagacién vegetativa, tas, ‘enfermedades virosas representan un problema slempre vigente ya que, enla generalidad de los casos, su transmisi6n ocurre junto con la pro- Pagacl6n, Por esta raz6n es muy importante sa- near el material antes de distribuirlo para su uso por los agricultores. Eicultivo de épices meriste- maticos (punto de crecimiento con células en, divisi6n que carecen de coneccién vascular con, el resto de Ia planta), junto a la termoterapia (cultivo de plantas a alta temperatura para Inactivar los virus) son herramlentas muy dtiles pard efectuar este soneamiento inicial Wang y Hu, 1980). En as siguientes especies esta técnica ha sido usada exitosamente: Allium sativum (Walkey ef al, 1987), Ipomoea batatas (Frison y Ng. 1981), Cynara scolimus (Pécaut y Dumas de Vaulx, 1983), Allium cepa (Hussey, 1978, Havel y Novak, 1986), Fragarla x annanassa (Nish y Oosawa, 1973). Embriogénesis somatica El desarrollo de técnicas conducentes a fa em- brlogénesis somnaitica (Ammirato, 1989) ha perml- tide la clonacién masiva del germoplasmna y el so de estos embriones paratla produccién de la llamada semilia sintética (Chen et al., 193: Janick, 1993), Para ello, los embriones son recu- % blertos 0 encapsulados en geles de distintana- juraleza, Se halogrado la encapsulacién de em- briones sométticos en aplo (Apium graveolens) (Redenbaugh et ai., 1988), camote (Ipomoea batata)(Chee y Cantliffe, 1992), berengena (Solanum melongena)(Marianl et al, 1993),ce- bada (Datta y Potrykus, 1989) y zanahoria (Dau- cus carota) (Woke et al., 1992) para usarlos como semilla artificial, aunque la técnica atin no esta disponible comercicimente. La embriogénesls somética se utiliza también en. forma tutinaria para la regeneracién de plantas partir de protoplastos (Bulteveld ef al., 1993). CCOMERCIALIZACION DE LAS NUEVAS. VARIEDADES GENERADAS Eluso de marcadores moleculares como RFLP, RAPD y otros, permite la Identificacién de cuitl- vares. Se han descrito técnicas de Identificaclén de cultivares en papas (Debener et al., 1990), tomates (Bonietbale ef al, 1988) ttigo (Barriga et 1., 1983), vid Bowers et al, 1993), Ademas, usan- do esta técnica es posible el control de la legit midad de los cruzamientos (Gebhardt ef al., 1989); Ia. determinaclén del sistema de poliniza- cl6n, la estimacién de la estructura genética (Rivard ef al., 1989, Xuy Pehu, 193) y la varlabl- lidad de las poblaciones naturales, y optimizar el manejo de los recursos genéticos (Flavell, 1982). LUTERATURA CITADA ‘ADELBERG, JW: RHODES, BB. and SKORUPSKA, HT, 1993 Generating tetraploid melonsin tissue culture, Acta Horo. 36: 373-380. BARDEN, K.A.; SMITH, 8.5. and MURAKISHI, H.H. 1986. Regeneration and screening of tomato somaclones to resistant fo tobacco mosaic Vins. 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