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    2 pH y soluciones amortiguadoras ACIDOS Y BASES Definiciones Acidos y bases. El concepto moderno de acidos y bases desarrollado por Brénsted, Lowry y otros define un dcido como un donador de protones y una base como un aceptador de protones. Por lo tanto, cada dcido tiene una base conjugada. Acido == Base+ H* Alcali, El término dlcali se reserva para aquellos compuestos que al disociarse generan iones hidréxilo. KOH —— K’+OH™ Anfolitos. Algunas especies iénicas pueden actuar como acidos y bases (tabla 2.1) y se conocen como anfélitos 0 se dice que son anfotéricos. Tabla 2.1 Algunos ejemplos de dcidos y bases Acido Base conjugada HCI > H* + Cl” CH; COOH 2 H* + CH;COO™ NH,* ¢ H* + NH H, CO; 2 H* + HCO3~ HCO; H* + CO, H,02 Ht +OH- H30*2 H* + H,0 24 22 Bloquimica practica ‘Aun cuando es conveniente escribir el equilibrio 4cido-base en la forma indicada arriba, el protén no existe como tal sino que esté solvatado. Por ejemplo, en medio acuoso el hidrogenién existe como ién hidronio (H3 0"). H'+H,O —— H;0°. Fuerza lénica Acidos o bases fuertes. En solucién, estos compuestos estén completamente jonizados en forma tal que la concentracién de H’ 6 OH” es la misma que la concentracién de dcido o base. Acido fuerte (4cido nitrico) HNO; ——> H’ +NO3 Base fuerte (Hidr6xido de sodio) NaQH ——> Na’ +OH™ Acidos o bases débiles. Estos compuestos se disocian sélo parcialmente y la concentracién de H’ y OH” depende de los valores de sus constantes de diso- ciacién. Acido débil (4cido formico) HCOOH —— H*+HCOO™ Base débil (anilina) C,H;NH, +H’ === C,H,NH3 La capacidad del solvente de combinarse con el hidrogenion afecta la capacidad de disociacién de un Acido o base y asi, un mismo compuesto puede actuar como acido débil en un solvente y como Acido fuerte en otro. Por ejemplo, el Acido acético es un dcido débil en medio acuoso, pero fuerte en amoniaco liquido, debido a que sus protones se combinan més facilmente con este tiltimo solvente. La fuerza idnica de un dcido depende de qué tan fuerte sea su base conjugada, asi como de la constante dieléctrica del medio. Sin embargo, los sistemas biolégicos funcionan en un medio acuoso y en este libro la fuerza del Acido se calcula tomando el agua como solvente. CONCENTRACION DE HIDROGENIONES Y pH Definicién de pH La concentracién de hidrogeniones en la mayoria de las soluciones es demasiado baja y para evitar el uso de ntimeros con varias cifras decimales Sgrenson introdujo en 1909 el termino pH como una forma muy adecuada para expresar la concentracién de hidrogeniones. El pH se define como el logaritmo negativo de la actividad de hidrogeniones, pero en la practica se toma generalmente la concentracién de hidrogeniones ya que la concentra- pH y soluciones amortiguadoras 23 cién y actividad son précticamente las mismas, excepto en soluciones fuerte- mente dcidas. Esto puede ilustrarse usando como ejemplo sangre humana. La sangre tiene normalmente una concentracién de hidrogeniones de 0.000 000 025 mol/I, lo cual puede expresarse en forma més conveniente como pH 7.4 Plasma [H‘] = 0.000 000 025 = 2.5 x 10°? mol/l, 1. pH del plasma = —log(2.5 x 1077) = 7.4. Disociacién del agua Derivacién de K,,. Por medio de medidas de conductividad se ha demostrado que el agua se ioniza débilmente y a 25° C la concentracién de hidrogeniones es de s6lo 10°? mol/l. H,O == H‘'+OH- La constante de equilibrio para la disociacién del agua est dada por (H"] [OH] (H, 0] Puesto que la concentracién del agua es para todos los propésitos précticos constante, se puede escribir: = [H*][OH7]. El producto iénico del agua a 25° C es 10°'* , asi que el pH del agua puraa 25°C es 7. [H*] = (OH"] = 1077, pH = —log; 9 [H*] = 7. Temperatura y Ky . El pH neutro no es 7 a cualquier temperatura, puesto que K, cambia con la temperatura (tabla 2.2). Un pequefio cambio en la temperatura, por ejemplo de 37 a 40°C, causa un incremento de 8% en Tabla 2.2 El producto iénico del agua y pH de neutralidad a diferentes temperaturas pH de °c Ky neutralidad 0 0.12 x 10714 = 1907 14-94 197 25 1.08 x 107!4 = 19-1400 7.00 37 2.51 x 10714 = 19-13-60 6.80 40 2.95 x 10-14 = 19-13-53 6.77 15 16.9 x 10714 = 19-12-77 6.39 100 48.00 x 10-14 = 19-12-32 6.16 24 Bioquimica practica hidrogeniones y en iones hidréxilo, Asi pues, una pequefia elevacién o descenso de temperatura puede producir un cambio biolégico profundo en organismos vivos sensibles a la concentracién de hidrogeniones. ‘Medicines exactas del pH El método més conveniente y confiable para medir pH es mediante el uso de un medidor de pH cominmente denominado potenciémetro, que mide la fuerza electromotriz (f.e.m.) de una celda formada por un electrodo de referencia, la solucién problema, y un electrodo de vidrio sensible a hidro- geniones. Electrodo de vidrio. Consta de un tubo de vidrio grueso y resistente.en cuyo extremo posee un pequefio orificio de aproximadamente 0.1 mm de didmetro. Dentro del bulbo hay una solucién de Acido clorhidrico (0.1 mol/1) conecta- da aun alambre de platino por un electrodo de plata-cloruro de plata rever- sible en presencia de hidrogeniones (figura 2.2). Al sumergir el bulbo en la solucién se genera una diferencia de potencial a través de la delgada pared de vidrio del bulbo proporcional al pH de la solucién en la que esta sumergido. Este potencial no es facilmente alterado por sales, proteinas o agentes 6xido- reductores y por lo tanto el aparato puede ser usado en muchos medios diferentes. : El electrodo de vidrio y la solucién problema forman media celda y el circuito se completa con un electrodo de referencia que no es sensible a hidrogeniones. Electrodo de Calomel. El electrodo de referencia que se emplea con més fre- cuencia es el electrodo de Calomel semejante al que se muestra en la figura 2.2. El electrodo de Calomel es estable, facil de construir y su potencial con respecto a un electrodo patrén de hidrégeno se conoce con precisiOn. Medidor de pH Un potenciémetro ara medir f.¢.m, ‘ag.Agcil HcI(0.1 mot/t) [Vidrio | Sotucion |) KCI eat) | Hg2Cly He ee ee problema Electrodo de vidrio Electrodo de referencia de Calomel Figura 2.1. Celda voltaica formada durante la medicién del pH PH y soluciones amortiguadoras 25 So ‘Al medidor de pH ELECTRODO. | ELECTRODO DE DE | ‘VIDRIO {__ REFERENCIA DE CALOMEL Alambre de Pt Alambre de Pr Tubo grueso de vidrio FA— ket saturado Mercurio Pasta de Calomel HCI dituido (0.1 mot/t) Ag.Agcl Bulbo delgado de vidrio sensible @ H* Cristales de KCI Tapon poroso SOLUCION PROBLEMA CON CONCENTRACION DESCO: NOCIDA DE H+ Figura 2.2 Sistema de electrodos para medicién de pH Medidor de pH. La f.e.m. de la celda completa (E) formada al conectar los dos electrodos es: B= Ev — Evarios donde E;er es el potencial del electrodo de referencia o Calomel, (el cual a temperatura ambiente es + 0.250 V) y Eviarie es el potencial del electrodo de vidrio que depende del pH de la solucién problema (pH,). E. 0.342 — 0.058 pH,. videto = Asi E = 0.250 — (0.342 — 0.058 pH,) = —0.092 + 0.058 pH,. 26 Bloquimica préctica Esta relacién puede variar debido a la presencia de otros potenciales en la celda, que, sin embargo, son usualmente constantes y pueden corregirse al calibrar el instrumento. El electrodo de vidrio tiene una resistencia muy alta (10° - 108 &2), por lo tanto se necesita un potenciémetro de valvula con una impedancia de entrada alta para medir el potencial. Ms adelante en este capitulo se dan algunas instrucciones sobre el cuidado y la operacién de un medidor de pH. Algunos medidores de pH tienen electrodos de vidrio y electrodos de referencia combinados en una sola unidad y no estan separados como se muestra en la figura 2.2. Indicadores de pH Teoria. Si se quiere téner una idea aproximada del pH de una solucién se pueden usar indicadores. Estos son compuestos orgénicos de origen natural 0 sintético cuyo color depende del pH de la solucién. Los indicadores son generalmente dcidos débiles que se disocian en solucién. Indicador = Indicador™ + H*. Si se usa la ecuacién de Henderson—Hasselbalch, entonces, Undicador ] HH = pK jp + logyp ——. SS naicedorl Las dos formas del indicador tienen colores diferentes y como aparecera claroal observar la tiltima ecuacién, el color de la solucién dependeré del pKin y del pH. El mayor cambio de color se obtiene alrededor del pK; ,y éste es el intervalo de pH donde el indicador es més util. Por ejemplo, si una solucién tiene un pH de aproximadamente 6, entonces el purpura de bromocresol, que tiene un pK, de 6.2, es el mejor indicador para el caso. Sin embargo, debidoa que el cambio de color ocurre en un rango amplio de pH, los indicadores dan tan sélo una medida aproximada del pH. Otra desventaja de los indicadores consiste en que son afectados por agentes oxidantes, agentes reductores, concentraciones de sal y de proteina, y, por lo tanto, estos factores se deben tener en cuenta cuando se empleen indicadores. Ademis, al usarlos, se debe tener precaucién de agregar slo pequefias cantidades a la solucién que se examina, 0 de lo contrario, el equilibrio 4cido-base de la muestra puede desplazarse y el pH cambiar. El uso més importante de los indicadores es quizas la determinacién del punto final de una titulacién. Algunos de los indicadores usados comtinmente se dan en la tabla 2.5, la cual hace parte de las instrucciones de un experimento para determinacién de pH por medio de indicadores (experimento 2.1). En las titulaciones, se selecciona un indicador que cambie de color en el punto de equivalencia, el cual, por supuesto, depende de la titulacién que se PH y soluciones amortiguadoras 27 esté efectuando. Por ejemplo, cuando se titula Acido acético con hidréxido de sodio, el dcido es transformado completamente en sal alrededor de pH 9; por lo tanto debe usarse fenolftaleina como indicador. En la misma forma, el rojo de metilo se usa cuando se titula amoniaco con Acido clorhidrico, puesto que el punto final de titulacién es aproximadamente pH 5. Este aspecto se ilustra més detalladamente en el experimento 2.2, el cual incluye la titulacién de una mezcla de un dcido fuerte y un acido débil. DISOCIACION DE ACIDOS Y BASES Acidos fuertes Son compuestos que se disocian completamente en hidrogeniones y en sus bases conjugadas; por lo tanto, la concentracién de hidrogeniones ser la misma que la del acido. E] pH de estas soluciones se puede calcular facilmente en la siguiente forma: (a) 0.01 mol/l HCI, pH = —log, (10°?) = 2; (b) 0.1 mol/l HCl, pH = —log; (107!) = 1; 14 Ku 30" gas [OH7] 107 : PH = log; 9 (10™!?) = 12. (c) 0.01 mol/l NaOH, [H*} = Acidos débiles Ecuacién de Henderson-Hasselbalch. Los acidos débiles en solucién se ioni- zan sélo ligeramente y se obtiene por tanto un verdadero equilibrio entre el Acido y la base conjugada. Si HA representa un acido débil, entonces: HA —— H*+aA. De acuerdo con la ley de accién de masas, la constante de disociacién K, se define como: _ OLA) (Ha) = _ KalHA] H oe [A] 28 — Bloquimica practica Sacando los logaritmos negativos, ) ' (HA Hoe oH = “torso Ke + (Fos o a [A] PH = pK, + logo yay” En términos generales, : [Base conjugada] HH = pK, + logigo —_, , 7 PH = pK, + 10810 Ta a0] Las actividades de A” y HA no son siempre. conocidas y por lo tanto es conveniente expresar A> y HA en términos de concentraciones. Asi, _ | pH = pK, + log—*— + log, Cua faa donde fx y fuason los coeficientes de actividad de A y HA respectivamen- te. Toda vez que log (fx fu.) es constante para un Acido dado, estos coefi- cientes de actividad pueden incorporarse al término pK, para dar una constante de disociacién aparente, pK,. ' Ca pH = pK; + log. Cua Esta relacién se conoce con el nombre de ecuacién de Henderson-Hasselbalch y es valida para un intervalo de pH entre 4 y 10 en el que los hidrogeniones y jos hidréxilos no contribuyen significativamente a la concentracién iénica total. pK,. Tal como se definio previamente, el pK, es el logaritmo negativo de la constante de disociacion de un Acido débil. Otra forma de definir pK, seria el pH al cual la concentracién del acido y su base conjugada son iguales oel pH al cual se ha titulado la mitad del acido. . pH = pK, +log1 0, PH = pK,. pH y soluciones amortiguadoras = 29 Debe recordarse que el pK’jes la constante de disociacién aparente que esta relacionada con la constante termodindmica de disociacién pK, asi: PK, = pK, + log fa/fia)- Por lo tantoel pK, podraser afectado hasta cierto punto por la fuerza iénica de lasolucién (J) que se define como I = ¥ ¢,2;? , donde z; es lacarga deliéniy ¢; es su concentracion. Curvas de titulaci6n Cuando se mezcla una base fuerte con una solucién de un acido y se mide el pH, se puede hacer un grafico del pH obtenido en funcién de la cantidad de base afiadida y esto se conoce con el nombre de curva de titulacién. En la figura 2.3 se ilustran varias de estas curvas y como puede observarse todas tienen la misma forma con excepci6n de la del Acido fuerte HCI. Curvas semejantes pueden obtenerse cuando se titula una base con dcido fuerte. Acido fuerte y base fuerte. Al ir afiadiendo base se producen tan sélo pequefios cambios en el valor de pH hasta cuando se obtiene la neutralizacién completa; pero en este punto un ligero exceso de base causa un cambio brusco en el pH. En efecto, el Acido fuerte esta impidiendo el cambio en el pH 0, puesto de otra forma, est4 actuando como una solucién amortiguadora. Ejemplo 1. Supongamos que se titulan 10 ml de HCL0.1 mol/lcon NaOH 0.1 mol/l. (a) Valor inicial del pH [H’] = 0.1=1x 10"! mol/l pH=1. (b) Después de agregar 5 ml de NaOH 0.1 mol/l. Al agregar 5 ml de base fuerte se neutralizan 5 ml de la solucién de HCI quedando 5 ml de HCI 0.1 mol/] en un volumen total de 15 ml. Molaridad del HCI= (5/15) x 0.1 = 3.33 x 107, pH = —log, 9 (3.33 x 10-?) = —[log; 9 3.38 + (—2)] = —(0.523 — 2) = 1.48. 30 Bloquimica préctica Punto medio de titulacién PKe pK. 4.7 CH,COOH == CH,COO~ +H" Mutiitcos de NaOH 0.1 mol/! Figura 2.3 Curvas de titulacién para 20 ml de soluciones de algunos Acids 0.1 mol/I (c) Después de agregar 9.9 ml de NaOH 0.1 mol/l Alagregar 9.9m! de la base fuerte se neutralizan 9.9 ml de la solucion de HCI quedando 0.1 ml de HCI 0.1 mol/l en un volumen total de 19.9 ml. Molaridad del HCl= (0.1/19.9) x 0.1 = 5.03 x 10%, pH = “log, 9(5.03 x 107+) = —[log: 9 5.03 + (—4)] = —(0.702 — 4) = 3.30. (a) Después de agregar 10.1 ml de NaOH 0.1 mol/l. Al agregar 10.1 ml de base fuerte, se neutraliza todo el HC! dejando 0.1 ml de NaOH 0.1 mol/l en un volumen total de 20.1 ml. Hy soluciones amortiguadoras 31 Molaridad del NaOH= (0.1/20.1) x 0.1 = 4.98 x 10°, [OH™] = 4.98 x 10-4, pry =k = 107!4 [OH] 4.98 x 10~* pH = “log; 9 (2.00 x 107") = —[log; 9 2.00 + (—11)] —(0.302 — 11) = 10.70. = 2.00 x 107, Usando este procedimiento se puede hacer la curva de titulacién y ésta debe ser comparable con los valores obtenidos en la practica. Acido débil y base fuerte. Todas las curvas de titulacién de bases o dcidos débiles titulados con bases 0 4cidos fuertes son similares. La razén es, que en este caso tenemos soluciones amortiguadoras cuyo pH cambia segtin la ecuacién de Henderson-Hasselbalch. Los valores de PK, son diferentes para cada dcido, pero la forma general de la curva es la misma en todos los casos. SOLUCIONES AMORTIGUADORAS Teoria Solucién amortiguadora es aquella que se opone a los cambios de pH cuando se agrega Acido o dlcali. Tales soluciones se usan en muchos experimentos bioquimicos en los cuales se necesita controlar exactamente el pH. De la ecuacién de Henderson-Hasselbalch se puede deducir que el pH de una solucién amortiguadora depende de dos factores; uno es el valor del pK,y el otro es la proporcién de sal a acido. Esta proporcién se considera igual alas cantidades de sal y dcido mezcladas en el intervalo de pH entre 4 y 10dondela concentracién de hidrogeniones e hidréxilos es muy baja y se puede ignorar. Tomemos por ejemplo los amortiguadores de acetato que estén compuestos de una mezcla de dcido acético y acetato de sodio. CH;COOH 2— CH;COO° +H’, CH;COONa ——> CH3COO™ + Na’. Puesto que el Acido acético est4 tan slo débilmente disociado, la concentra- cién de dcido seré casi la misma que se agregé a la mezcla; en la misma forma la concentracién de iones acetato puede ser considerada como igual a la 32 Bloquimica practica concentracién de acetato de sodio afiadido a la mezcla, ya que la sal estarA completamente disociada. Ejemplo2. ;Cudles el pH de una mezcla de 5 ml de acetato de sodio 0.1 mol/l y 4 ml de dcido acético 0.1 mol/l? Concentracién de CH; COO” = § x 0.1 mol/l, Concentracién deCH3 COOH = § x 0.1 mol/l, pK, del Acido acético a 25°C = 4.76. Por lo tanto, pH = 4.76 + log § = 4.76 + (+0.097) = 4.86. Ejemplo 3. {Cudl es el cambio que ocurre en el pH al agregar a la mezcla anterior 1 ml de HCI 0.1 mol/l? La adicién de HCI suministra H* que se combina con los iones acetato para producir acido acético. Esto reduce la cantidad de iones acetato presentes, e incrementa la cantidad de acido acético no asociado, originando un cambio en la proporcién de sal a acido y por lo tanto un cambio en el pH. Concentracién de CH; COO” = 5 x 0.1 — 75 x 0.1 = 0.04 mol/l, Concentracién de CH; COOH = #5 x 0.1 + Jy x 0.1 = 0.05 mol/l, pK, = 4.76. Por lo tanto, H = 4.76 + log 24 = 4.76 + log —— , ¥ 0.05 = 4.76 + (-0.097) = 4.66. El pH de la solucién ha disminuido de 4.86 a 4.66, un cambio des6lo 0.2uni- dades, mientras que.si se hubiese agregado HCI al agua destilada, el pH obtenido seria de 2. La solucion ha actuado por lo tanto como un amorti- guador, resistiendo los cambios de pH producidos por la adicién del dcido. Valor amortiguador §. Las soluciones amortiguadoras difieren en su capa- cidad para resistir los cambios en el pH, por lo que Van Slyke introdujo el término valor amortiguador para comparar diferentes soluciones amortigua- pH y soluciones amortiguadoras 33 doras. Cuando se agrega un dlcali o un acido a una solucién amortiguadora se obtiene una curva de titulacién (figura 2.3). La pendiente de esta curva est dada por dB/d(pH) donde dB es el incremento de Acido o base fuerte agre- gados en mol/l y d(pH) es el incremento en el pH. Esta pendiente es el valor amortiguador 8 que es siempre positivo, puesto que dB es negativo. Esto Gltimo se debe a que cuando se agrega Acido produciré un cambio negativo en el pH. Tal como puede apreciarse en las curvas de titulacion que se muestran en (figura 2.3), el valor amortiguador es m4ximoen elpK, yenla practica las soluciones amortiguadoras se usan en un intervalo de pH de + 1 alrededor del valor del pK,. Amortiguadores usados en biologia Algunas de las soluciones amortiguadoras que se usan mds frecuentemente en el laboratorio se muestran en la tabla 2.3. Como se dijo anteriormente, el intervalo util para la mayoria de los amortiguadores es de una unidad de pH por encima o por debajo del valor del pK,. El amortiguador que se escoja para un experimento dado debe selec- cionarse con cuidado, ya que los resultados experimentales pueden deberse a efectos especificos de los iones utilizados y no al pH. Algunos amortiguadores que producen reacciones desfavorables son: borato, citrato, fosfato y tris. Borato. Por ejemplo, este compuesto forma complejos con diferentes sustancias tales como azticares. Citrato. Este ién se combina facilmente con calcio y por lo tanto no se debe usar en presencia de Ca‘* En muchos experimentos biolégicos el pH debé mantenerse entre 6-8, pero s6lo pocos amortiguadores son efectivos en este intervalo, especialmente alrededor de pH 7.4. Tabla 2.3 Amortiguadores usados en investigaciones biolégicas Acido o base pKa pK, pKa 4cido fosférico 12 12.3 4cido citrico 48 54 Acido carbénico 0.3 glicil glicina 8.1 Acido acético Acido barbitérico tris * HEPES + REeRemep Pee mbmne ' ' * Tris = N-tris (hidroximetil) aminometano + HEPES = Sulfonato de N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etano. 34 — Bloquimica practica Fosfato, Puede actuar como un inhibidor enzimético, o en algunos experi- mentos como metabolito. Los metales pesados se precipitan facilmente como fosfatos y por lo tanto este amortiguador tiene poca capacidad por encima del pH 75. Tris. Este amortiguador se puede usar con metales pesados, pero puede actuar como inhibidor en algunos sistemas. Su mayor desventaja consiste en que ‘varia con la temperatura, factor que con frecuencia no se tiene en cuenta. Un amortiguador de tris cuyo pH a temperatura ambiente es de 7.8, tiene un pH de 8.4 a 4° C y de 7.4 a 37°C. Por lo tanto la concentracién de hidrogeniones aumenta 10 veces cuando el reactivo se prepara a 4°C y luego se mide el pH a37°C. El tris tiene una capacidad amortiguadora muy pequefia por debajo del pH 7.5. Amortiguadores Zwitterion. Otros amortiguadores biolégicos tales como el HEPES han sido discutidos por Good y colaboradores, quienes han fijado los criterios para el uso efectivo de amortiguadores cercanos a la neutralidad (Good y otros., 1966). EL pH Y LA VIDA La mayoria de las células pueden funcionar tnicamente dentro de limites estrechos de pH y requieren por lo tanto sistemas amortiguadores que se opongan a los cambios de pH que de otra forma ocurririan a causa del metabolismo. Los tres principales sistemas amortiguadores en los materiales vivos son las proteinas, el bicarbonato y el fosfato (figura 2.4). La importancia relativa de cada uno depende del tipo de célula y del organismo. Animales El sistema amortiguador més importante en el plasma de los mamiferos es el bicarbonato: H,CO, == HCO, +H’. Sistema pK, proteina Her === OMY + Pro 14 bicarbonato H,CO, == HT+HCOs 61 fosfato HjPO; == HY + HPO.” 72 Figura 2.4 Principales sistemas amortiguadores en mami- feros pH y soluctones amortiguadoras 35 Segun la ecuacién de Henderson-Hasselbalch, pH = pK, + log, -ACO2 1, . (H, C03] Por lo tanto, el pH del plasma depende de la relacién de bicarbonato a 4cido carbénico y no de sus concentraciones absolutas. Cualquier tendencia a cambiar el pH es amortiguada y se puede corregir ajustando esta relacién. Por ejemplo, los acidos formados durante el metabolismo normal reaccionan con el bicarbonato para formar Acido carbonico débilmente disociado, en forma tal que los hidrogeniones son practicamente removidos. Al mismo tiempo, el Acido carbénico es eliminado en los pulmones en forma de diéxido de carbono, manteniendo constante el pH del plasma. Los rifiones también juegan un papel importante en el mantenimiento del balance Acido-base, regulando la excrecién de dcido o base en la orina, y por esto en los humanos el pH de la orina varia normalmente de 4.8 a 7.5. El fluido extracelular es por lo general ligeramente alcalino (pH 7.4), mientras que el pH citoplasmatico promedio de muchas células animales es aproximadamente 6.8 que a 37°C es neutro (tabla 2.2). Es casi seguro que el pH en las organelas es diferente a 6.8 y el pH en la superficie de la mayoria de las membranas es mas bajo debido a la absorcién de H’ sobre la superficie cargada negativamente. He (p molt) 6 OR Sarees seecetenstsee 16 \Variaciones normales en personas sa 40 Ws SO oi SOOO SSeS USNS 100 Soe 250 Figura 2.5 Limites del pH en el plasma sanguineo humano 36 Bloquimica practica La importancia de controlar el pH se ilustra muy bien en el caso de la sangre humana que debe mantenerse dentro de limites muy estrechos para que se conserve la vida y atin més estrechos para mantener la salud (figura 25). Plantas El pH citoplasmatico promedio de las plantas es semejante al de los animales, pero el contenido celular de la mayoria de las plantas terrestres es acido y su pH est entre 5.2 y 6.5. Algunos jugos de plantas son muy écidos (naranja y tordnja). pH 3, pero el dcido parece estar confinado a las vacuolas y por lo tanto estd separado del resto del citoplasma. Bacte: El pH de las bacterias estudiadas parece ser aproximadamente neutro; sin embargo, muchas especies crecen bien a un pH 6 6 9, que implica una diferencia de tres 6rdenes de magnitud en la concentracién de hidrogeniones. Los tiobacilos crecen a un pH 0, lo cual corresponde a acido sulfarico 1 mol/l: en cambio algunos hongos crecen a un pH 11. Como es de esperar, la mayoria de los organismos patogénicos para el hombre presentan un pH 6ptimo para su crecimiento entre 7.2 — 7.6. A pesar de que un organismo pueda crecer dentro de limites amplios de pH, frecuentemente desarrolla enzimas adapta- tivas que tratardn de dirigir el pH externo hacia valores cercanos a la neutra~ lidad. Por ejemplo, es posible deaminar aminodcidos para producir el correspondiente acido carboxilico, o decarboxilarlos para producir la amina Si se cultiva E. coli a un pH entre 7 y 8, se sintetiza una deaminasa que produce dcido, mientras que a un pH 4.5 y 6 predomina una decarboxilasa, lo que da como resultado la produccién de base. ‘Asi pues, parece claro que las formas ms simples de vida pueden sobrevi- vir en medios externos cuyo rango de pH puede variar ampliamente sin que el pH interno sufra variaciones. EJERCICIOS PRACTICOS Cuidado y uso del medidor de pH El método de operacién de un medidor de pH depende del modelo, asi que en este libro no se dan instrucciones detalladas para el efecto. Sin embargo, se da una idea general del uso y cuidado de los electrodos por considerarlo de bastante utilidad. 1. Electrodos nuevos de vidrio. Los electrodos nuevos deben remojarse en HCI 0.1 mol/l 0 en agua destilada durante varias horas antes de usarse. pH y soluciones amortiguadoras 37 2, Mezcla. La sclucién debe agitarse vigorosamente antes de medir el pH y esto idealmente se puede hacer pasando a través de ella una corriente de nitrégeno puro. Sin embargo, un agitador magnético es quizds una forma mas conveniente para el trabajo de laboratorio, pero esto produce corrientes en los electrodos, especialmente en el compensador de temperatura. No se deben usar varillas de agitar, pues se corre el riesgo de romper los electrodos que son bastante frdgiles. 3. Temperatura. La temperatura del recipiente debe estar controlada, puesto que el Ky, el pK y el pH de la solucién patrén varian con la temperatura. E] compensador de temperatura que tiene el instrumento no corrige esos factores, sino tnicamente los cambios en f.e.m. producidos por las variaciones de tempz2raturas en la unidad de los electrodos. 4.-Contaminacién de los electrodos. Los electrodos deben lavarse con agua destilada antes y después de usarse y nose deben tocar con la mano. Deben ser lavados cuidadosamente, especialmente después de medir el pH de una solucién con una concentracién alta de macromoléculas biolégicas, ya que éstas se adhieren al vidrio y alteran posteriores mediciones de pH a menos de que se remuevan completamente. 5, Estandarizacién. El medidor de pH se calibra antes de usarse con una solucién patrén. En el Reino Unido se recomienda el uso de un patrén de ftalato potasico monobdsico; a 15° C una solucién 0.05 mol/I tiene un pH de 4.000. El pH a otras temperaturas (0 a 60° C) puede obtenerse de la ecuacién siguiente: : 38)" HH = 4.000 + a ( 100 El medidor debe calibrarse con una solucién cuyo pH sea cercano al de la muestra. En la tabla 2.4 se dan varios de los patrones que pueden usarse para el efecto. 6. Medicién de valores extremos de pH. La exactitud del electrodo de vidrio se mantiene hasta valores de pH muy bajos, pero en alcali fuerte el pH medido Tabla 2.4 Patrones primarios para calibracién de un medidor de pH pH 25°C 37°C 1. Ftalato monobisico de potasio 0.05 mol/I 4.01 4.02 2. Fosfato de potasio monobsico 0.025 mol/1 Fosfato de sodio dibdsico 0.025 mol/1 6.86 6.84 3. Tetraborato sédico 0.01 mol/I 9.18 9.06 38 Bloquimica préctica es con frecuencia més bajo que el real, debido a la interferencia de otros iones, especialmente el sodio. Por ejemplo, en una solucién que contiene'Na’ 0,1 mol/I el error alcalino es aproximadamente de ~0.4 de unidad a pH 12. Cuando se usa vidrio de litio, este error se reduce considerablemente, pero los electrodos de vidrio ordinario nose pueden usar por encima de pH 10. Cuando se titula a valores de pH altos, lo mejor es usar KOH y no NaOH, y se reco- mienda usar una bureta que tenga una trampa de hidroxido de calcio para absorber el COs. 7. Conservacién del aparato. Cuando el medidor de pH no esté en uso, el botén de pH debe estar en cero, pero el interruptor del aparato debe estar prendido. Luego de usarse, los electrodos deben mantenerse en agua destilada y nunca se debe permitir que se seque. Si esto ocurre, los electrodos deben sumergirse en agua y calibrarse varias veces antes de proceder a hacer las mediciones. Curvas de titulacion Limites practicos de las curvas de titulacién. Sienla titulacion se usan dcidos fuertes o bases fuertes 0.1 mol/I, las curvas se aproximan asintoticamente al pH 1 0 pH 13, después de producirse 1a neutralizacién completa. En forma similar, los limites para las soluciones 0.01 mol/l serén pH 20 pH 12, y por lo tanto valores de pK, por debajo de 20 por encima de 12no pueden ser determi- nados usando soluciones 0,01 mol/1. Correccién por solvente. Se deben corregir las curvas experimentales de titulacién para tomar en cuenta la cantidad de dcido o base usados en la titulacién del solvente, que generalmente es agua destilada. Esto se haceen la forma siguiente: 1. Dibuje las curvas de titulacién para los mismos voltimenes de muestra y de agua. 2. Seleccione un valor cualquiera de pH en la curva para la muestra y anote el volumen de dcido'o base usada; denomine esto X ml. En la misma forma, anote la cantidad de dcido o base consumida para llevar el agua al mismo valor de pH; denomine esto Y ml. . La cantidad neta de dcido consumida en la titulacin de la muestra esta dada por (X— Y) ml. Repita esto para varios valores de pH y haga la curva correcta de titulacién. Py Determinacién de pK,. Los valores de pK, pueden obtenerse de los datos de titulacién por tres métodos diferentes: 1. El pH en el punto de inflexion es el valor de pK, y se puedeleer directa- mente. Una forma més conveniente consiste en hacer el grafico de dB/ d(pH), que es el valor amortiguador en funcién del pH y cuando se obtiene un maximo, éste corresponde al pK,. pH y soluciones amortiguadoras 39 2. Por definicién, el valor de pK, es igual al pH en el que se ha tituladola mitad del acido. El pX, puede, por lo tanto, obtenerse conociendo el punto final de la titulacion. 3. El cociente sal/acido puede calcularse experimentalmente y se puede hacer un grafico de log» sal/Acido en funcién de pH. Elintercepto sobre el eje es el valor de pK,. EXPERIMENTO 2.1 Determinacién del pH mediante el uso de indicadores Materiales 100 1. Indicadores (soluciones en etanol acuoso de los indica- dores de la tabla 2.5. Estos se consiguen en el comercio). 100 ml 2. Muestras (saliva, jugo de naranja, limonada, clara de huevo) diluidas 1 a 10. 11 Método En un tubo de ensayo pipetee 1—2 ml de cada muestra, agregue dos gotas de indicador de rojo de metilo y observe el color. Repita el experimento con otros indicadores hasta obtener el pH aproximado comparando los colores de las muestras con las formas acida, intermedia y basica del indicador (tabla 2.5). En un tubo de ensayo pipetee 2 ml de agua destilada y determine el pH usando los indicadores tal como se describié previamente.

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