PENUNTUN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI LAUT

“ PERHITUNGAN DAN PENGAMATAN KOLONI

MIKROORGANISME”
LANDASAN TEORI :
A. Perhitungan Bakteri
1. Metode Mikroskopik Langsung (Hemasitometer)

Ada berbagai macam jenis hemasitometer yang biasa digunakan sebagai

ruang hitung mikroorganisme. Penghitungan secara langsung dapat dilakukan
secara mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah sel bakteri dalam satuan isi
yang sangat kecil.
Hemasitometer adalah metode perhitungan secara mikroskopis. Ruang hitung
terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu kotak besar di tengah, dibagi
menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi
menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400
kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang
tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri
per satuan volume dapat diketahui.

(Hansen, 2003).

Rumus :
(Jumlah Sel)
Bilangan Mikroba/mL = Volume Daerah Kotak x pengenceran

𝑫𝒊𝒎𝒂𝒏𝒂: Volume daerah kotak = Luas Kotak 𝐱 Tinggi Kotak

2. Metode Hitungan Cawan
Prinsip dasar perhitungan dengan menggunakan metode ini adalah anggapan
bahwa setiap sel yang mampu bertahan hidup akan berkembang dan membentuk
satu koloni. Jumlah koloni yang muncul pada cawan merupakan satu indeks bagi
jumlah organisme yang dapat hidup yang terkandung dalam sampel. jika sel
mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba
tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat lansung
dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Pertumbuhan mikroorganisme yang
membentuk koloni dapat dianggap bahwa setiap koloni yang tumbuh berasal dari
satu sel, maka dengan menghitung jumlah koloni dapat diketahui penyebaran
bakteri yang ada pada bahan
Teknik yang harus dikuasai dalam metode ini ialah mengencerkan sampel dan
mencawankan hasil pengenceran tersebut. Setelah inkubasi, jumlah koloni
masing-masing cawan diamati. Untuk memenuhi persyaratan statisik, cawan yang
dipilih untuk perhitungan koloni ialah yang mengandung antara 25 – 250 koloni
Karena jumlah mikroorganisme dalam sampel tidak diketahui sebelumnya, maka
untuk memperoleh sekurang-kurangnya satu cawan yang mengandung koloni
dalam jumlah yang memenuhi persyaratan tersebut, harus dilakukan sederetan
pengenceran dan pencawanan. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal
ditentukan dengan menggunakn jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor
pengenceran pada cawan yang bersangkutan. Jumlah organisme yang terdapat
dalam sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk
dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan.
Rumus:

𝑫𝒊𝒎𝒂𝒏𝒂 ∶
N = Jumlah koloni produk, dinyatakan dalam koloni per ml atau koloni per gr
∑C = Jumlah koloni pada semua cawan yang dihitung
𝑛1 = Jumlah cawan pada pengenceran pertama yang dihitung
𝑛2 = Jumlah cawan pada pengenceran kedua yang dihitung
d = Pengenceran pertama yang dihitung
 Hasil analisis mikrobiologi dengan cara hitungan cawan digunakan standar
yang disebut Standar Plate Count (SPC) sebagai berikut :

a. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung 30 dan 300
koloni.
b. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan satu kumpulan
koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan dapat dihitung
sebagai satu koloni.
c. Satu deretan rantai koloni yang terlihat sebagai satu garis tebal dihitung
sebagai satu koloni.
d. Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidah
dihitung.
e. Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni.

Pembagian kuadran pada cawan petri agar mudah dalam pengamatan dan
perhitungan:

3. Metode Most Probable Number (MPN)

MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data
dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri
tabung yang ditanam dari sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan
jumlah sampel atau diencerkan menurut tingkat seri tabungnya sehingga
dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme yang diuji dalam nilai MPN/satuan
volume atau massa sampel.
Metode MPN digunakan medium cair di dalam tabung reaksi, dimana
perhitungan dilakukan berdasarkan pada jumlah tabung yang positif yaitu yang
ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu.
Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya
kekeruhan, atau timbulnya gas di dalam tabung kecil (tabung Durham) yang
diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik pembentukan gas. Untuk
setiap pengenceran pada umumnya digunakan tiga tau lima seri tabung. Lebih
banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi, tetapi
alat gelas yang digunakan juga lebih banyak.
Rumus:
1
MPN sampel = Nilai MPN dari tabel ×
pengenceran tabung tengah
 Asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah :

a. Bakteri terdistribusi sempurna dalam sampel

b. Sel bakteri terpisah-pisah secara individual, tidak dalam bentuk rantai
atau kumpulan (bakteri coliform termasuk E. coli terpisah sempurna tiap
selnya dan tidak membentuk rantai).
c. Media yang dipilih telah sesuai untuk pertumbuhan bakteri target dalam
suhu dan waktu inkubasi tertentu sehingga minimal satu sel hidup
mampu menghasilkan tabung positif selama masa inkubasi tersebut.
d. Jumlah yang didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup (viable)
saja. Sel yang terluka dan tidak mampu menghasilkan tabung positif
tidak akan terdeteksi
4. Metode Perhitungan Massa Sel (Standard McFarland)
Standar kekeruhan McFarland digunakan untuk standarisasi perkiraan jumlah
bakteri dalam suspensi cair dengan visual membandingkan kekeruhan suspensi uji
dengan kekeruhan standar McFarland. Standar McFarland disusun dengan
menambahkan barium klorida untuk asam sulfat untuk mendapatkan endapan
barium sulfat. Dengan menyesuaikan volume dari kedua reagen tersebut, standar
berbagai tingkat kekeruhan dapat dipersiapkan untuk mewakili beberapa
konsentrasi yang berbeda dari bakteri. Standar yang paling umum digunakan di
laboratorium mikrobiologi klinis untuk tes kerentanan antimikroba rutin (1,2)
adalah 0,5 yang mewakili 1,5 x 108 (umumnya, kisaran 1,0 sampai 2,0 x 108 x 108
bakteri/mL. Standar McFarland yang secara komersial tersedia dari beberapa
sumber sebagai alternatif standar barium sulfat tradisional.
Dalam mikrobiologi, standar McFarland digunakan sebagai acuan untuk
menyesuaikan kekeruhan suspensi bakteri sehingga jumlah bakteri akan berada
dalam kisaran tertentu.
Asli standar McFarland mencampur jumlah tertentu dari barium klorida dan
asam sulfat bersama-sama. Pencampuran dua senyawa membentuk endapan
barium sulfat, yang menyebabkan kekeruhan dalam larutan. 0,5 standar
McFarland disiapkan dengan mencampur 0,05 mL 1,175% barium chloride
dihydrate (BaCl2 • 2H2O), dengan 9,95 mL 1% asam sulfat (H2SO4). Sekarang
ada standar McFarland dibuat dari suspensi partikel lateks, yang memperpanjang
umur simpan dan stabilitas suspensi. Standar ini dapat dibandingkan secara visual
dengan suspensi bakteri dalam saline steril atau kaldu nutrisi. Jika suspensi bakteri
terlalu keruh, dapat diencerkan dengan pengencer lebih. Jika suspensi tidak cukup
keruh, bakteri dapat ditambahkan.
B. Pengamatan Morfologi Koloni Mikroorganisme
Pengamatan bakteri dapat dilakukan secara individual, satu per satu, maupun
secara kelompok dalam bentuk koloni. Bila bakteri yang ditumbuhkan di dalam
medium yang tidak cair, maka akan terjadi suatu kelompok yang dinamakan
koloni. Bentuk koloni berbeda-beda untuk setiap spesies, dan bentuk tersebut
merupakan ciri khas bagi suatu spesies tertentu.
Bakteri dapat ditumbuhkan dalam suatu medium agar dan akan membentuk
penampakan berupa koloni. Koloni sel bakteri merupakan sekelompok masa sel
yang dapat dilihat dengan mata langsung. Semua sel dalam koloni itu sama dan
dianggap semua sel itu merupakan keturunan (progeny) satu mikroorganisme dan
karena itu mewakili sebagai biakan murni. Penampakan koloni bakteri dalam
media lempeng agar menunjukkan bentuk dan ukuran koloni yang khas, dapat
dilihat dari bentuk keseluruhan penampakan koloni, tepi dan permukaan koloni.
Koloni bakteri dapat berbentuk bulat, tak beraturan dengan permukaan cembung,
cekung atau datar serta tepi koloni rata atau bergelombang dsb. Pada medium agar
miring penampakan koloni bakteri ada yang serupa benang (filamen), menyebar,
serupa akar dan sebagainya.
Tujuan Praktikum :
1. Praktikan dapat mengetahui jenis-jenis metode perhitungan bakteri yaitu
metode mikroskopik langsung (hemositometer), metode hitungan cawan,
metode Most Probable Number (MPN) dan perhitungan McFarland.
2. Praktikan dapat mengetahui morfologi koloni mikroba berdasarkan warna,
elevasi, bentuk dan pinggirannya.
3. Praktikan dapat mengetahui cara perhitungan koloni mikroba
menggunakan metode hitungan cawan.
Alat :
 Masker
 Loop
 Spidol non Permanen
 Sarung Tangan
 Kalkulator
Bahan :
 Bakteri yang telah diinokulasi menggunakan metode agar tuang
 Tabel morfologi
Prosedur Kerja :
a. Metode Hitungan Cawan
 Menyiapkan alat yang akan di gunakan dalam praktikum dan bahan berupa
bakteri yang telah diinokulasi dan diinkubasi selama 2x24 jam (waktu
normal inkubasi).
 Melakukan pembagian kuadran dalam cawan berisi bakteri agar mudah
dalam pengamatan dan perhitungan koloni mikroba, sebagai berikut :
 Untuk cawan pengenceran 10-1 dan 10-2, lakukan pembagian cawan
menjadi 4 kuadran.
 Cawan pengenceran 10-3, lakukan pembagian cawan menjadi 3 kuadran.
 Cawan pengenceran 10-4, lakukan pembagian cawan menjadi 2 kuadran.
  Melakukan perhitungan koloni mikroba secara langsung pada cawan berisi
mikroba dengan menggunakan loop atau kaca pembesar.
 Memberikan tanda pada koloni mikroba yang telah dihitung menggunakan
spidol non permanen agar tidak terjadi pengulangan perhitungan koloni .
 Mencatat hasil perhitungan lalu analisi dan hitung jumlah koloni mikroba
per mL dengan menggunakan rumus hitungan cawan (Standard Plate
Cout)
b. Pengamatan Morfologi Koloni Bakteri
 Pilihlah salah satu koloni mikroba dari beberapa koloni yang telah
dihitung dalam cawan petri kemudian berikan tanda.
 Mengamati morfologi koloni mikroba tersebut dengan menggunakan loop
berdasarkan bentuk, elevasi, tekstur, dan warna. Kemudian catat dan
masukkan ke dalam tabel pengamatan morfologi yang telah di siapkan.

NOTE:
 MEMBAWA SPIDOL BIASA HITAM/BIRU PER ORANG
 PRINT MASING-MASING TABEL PENGAMATAN MORFOLOGI
KOLONI BAKTERI
 PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI LAUT
“ PERHITUNGAN DAN PENGAMATAN KOLONI
MIKROORGANISME”

NAMA :
NIM :
KELOMPOK :
ASISTEN :

Tabel Pengamatan Morfologi Koloni Bakteri :

Bakteri Bentuk Elevasi Pinggiran Tekstur Permukaan Warna