UJI ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETIL ASETAT

DAUN MANGROVE (Rhizopora mucronata)

DENGAN METODE DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)

Baihaqi Wisnumurti Wiharno, 23021015004

Program Studi Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
Universitas Padjadjaran
Jl. Raya Bandung Sumedang KM.21, Jatinangor, Kabupaten Sumedang,
Jawa Barat 45363
Email : baihaqiwi@gmail.com

ABSTRACT

Rhizopora mucronata is one of the mangrove species that have secondary metabolites, which
can be utilized in the field of pharmacology. Secondary metabolites have antioxidant benefits
as one of them. To determine the antioxidant activity in Rhizopora mucronata, necessary to
test the antioxidant activity. Antioxidants are chemical compounds that can donate one or
more electrons to free radicals. Antioxidant activity can be detected with DPPH method test.
The study aims to determine the major activity of antioxidants found in ethyl acetate extracts
of Rhizopora mucronata’s leaves and comparing it with antioxidant activity criteria by
DPPH method. In the test the antioxidant activity with DPPH absorbance was measured
using a spectrophotometer with a wavelength of 517 nm. Absorbance was measured for
calculating the percent inhibition. Value curbs free radical activity is expressed by IC50
(Inhibitory Concentration). IC50 value is defined as the concentration of test compounds that
can reduce free radicals by 50%. Ethyl acetate extracts of Rhizopora mucronata’s leaves of
IC50 value with concentrations of 5, 10, 100, 500, and 100 ppm is 985.104 ppm compared
with the antioxidant activity criteria by DPPH method is >500 does not have antioxidants
activity. The alkaloid compounds in the leaves of R. mucronata are less active but still potent
as antioxidants.
Keywords : Antioxidant, IC50, Rhzipora mucronata ,Vitamin C

PENDAHULUAN
Antioksidan merupakan senyawa senyawa tersebut (Sunardi, 2007; Sadeli,
pemberi elektron (electron donor) atau 2016).
redukan. Senyawa ini mampu Berdasarkan mekanisme kerjanya,
menginaktivasi berkembangnya reaksi antioksidan diklasifikasikan menjadi dua
oksidasi, dengan cara mencegah kategori, yaitu antioksidan pencegah dan
terbentuknya radikal. Antioksidan juga antioksidan pemutus rantai. Antioksidan
dapat didefinisikan sebagai senyawa yang pencegah bekerja dengan menghambat
apabila dalam konsentrasi rendah berada pembentukan reactive oxygen species
Bersama substrat yang dapat teroksidasi, (ROS), seperti enzim katalase,
dapat menunda atau menghambat oksidasi peroksidase, superoksida dismutase, dan
transferrin. Antioksidan pemutus rantai
merupakan senyawa yang menangkap dalam persen inhibisi, yang dihitung
radikal oksigen kemudian memutus dengan rumus :
rangkaian rantai reaksi radikal, contohnya 𝑎𝑏𝑠 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜−𝑎𝑏𝑠 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
% inhibisi = x 100%
vitamin C, vitamin E, asam urat, bilirubin, 𝑎𝑏𝑠 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜

polifenol, dan sebagainya. Praktikum ini bertujuan untuk

Metode DPPH metupakan metode mengetahui besar aktivitas antioksidan
yang cepat, sederhana, dan tidak yang terdapat pada ekstrak etil asetat daun
membutuhkan biaya tinggi dalam Rhizopora mucronata serta
menentukan kemampuan antioksidan membandingkannya dengan kriteria
menggunakan radikal bebas 2,2-diphenyl- aktivitas antioksidan dengan metode
1-picrylhydrazyl (DPPH). Metode ini DPPH
sering digunakan untuk menguji senyawa
METODOLOGI
yang berperan sebagai free radica
Praktikum uji antioksidan ekstrak
scavengers atau donor hidrogen dan
etil asetat daun mangrove Rizhopora
mengevaluasi aktivitas antioksidannya,
mucronata dengan metode DPPH
serta mengkuantifikasi jumlah kompleks
dilakukan di Gedung 4 Laboratorium
radikal-antioksidan yang terbentuk.
Bioproses dan Bioprospeksi Bahan Alam
Metode DPPH dapat digunakan untuk
FPIK UNPAD. Waktu Pelaksanaan
sampel yang berupa padatan maupun
dilakukan pada hari Selasa, 7 November
cairan (Prakash, Rigelholf, dan Miller,
2017.
2001; Sadeli, 2016).
Alat yang digunakan yaitu tabung
Uji aktivitas antioksidan dengan
reaksi sebagai wadah uji antioksidan,
metode DPPH dilakukan pengukuran
mikropipet untuk mengambil larutan
absorbansi larutan blanko dan sampel
antioksidan dan DPPH, vortex untuk
dengan spektrofotometer panjang
menghomogenkan sampel. Dan
gelombang 517 nm. Larutan blanko
spektrofotometer untuk mengukur nilai
adalah larutan yang tidak mengandung
absorbansi sampel uji. Bahan yang
analit untuk dianalisis. Larutan blanko
digunakan yaitu, alumunium foil, larutan
digunakan dalam suatu percobaan sebagai
DPPH, larutan vitamin C, ekstrak etil
nilai 100% transmitter. Absorbansi diukur
asetat daun mangrove, dan methanol.
untuk melakukan perhitungan persen
Prosedur yang dilakukan dalam
inhibisi. Aktivitas antioksidan dinyatakan
praktikum kali ini adalah pertama
membuat larutan stok, larutan stok 5 ppm Tabel 1. Data shift 2 hasil uji antioksidan
Vitamin C ingin diambil senyak 3 ppm Pengulangan
Nilai
(kelompok 7) dengan V2 sebesar 2 ml. Konse %
N Samp Absorbansi
ntrasi inhi
o el Spektrofotomet
Dicari dengan rumus pengenceran yaitu: (ppm) bisi
eri
1 2 3
V1. N1 = V2. N2
Blangk 0.2 0.2 0.5
1
V1. 5 = 2. 3 o 01 80 33
0.1 0.1 0.1 69.7
2 5
V1 = 1.2 ml Daun
61 47 38 %
0.1 0.1 0.4 74.1
Diambil 1.2 ml dari larutan stock (5 3 Rhizo 10
38 38 09 1%
pora
0.8 0.0 0.8 84.9
ppm) ditambah dengan 0.8 pelarut 4 mucro 100
81 80 93 9%
nata
methanol. Kemudian dimasukkan vitamin 0.1 0.4 0.2 70.5
5 500
57 44 90 4%
C 1.2 ml ke dalam tabung reaksi 0.8 0.3 0.2 45.4
6 1000
73 17 91 %
menggunakan mikropipet 1000 µl (1000 + 1
Blangk 0.7 0.1 0.1
o 30 11 11
200 µl). Kemudian dimasukkan lagi 0.7 0.2 0.0 67.5
2 1
42 37 67 %
methanol 0.8 ml (800 µl). Dihomogenkan Vitam
0.0 0.0 0.0 91.2
3 in C 2
dengan menggunakan vortex. 64 60 61 3%
(Asam
0.7 0.1 0.6 83.6
4 askorb 3
Dimasukkan larutan DPPH sebanyak 1 ml 64 19 49 9%
at)
0.0 0.0 0.0 91.5
5 4
dengan menggunakan mikropipet (1000 59 62 59 1%
0.0 0.0 0.2 90.9
µl). Lalu ditutup kepala tabung reaksi 6 5
66 66 54 5%
dengan alumunium foil dan
Ekstrak daun Rhizopora mucronata
dihomogenkan larutan dengan
dibuat dengan konsentrasi masing –
menggunakan vortex. Selanjutnya
masing 5, 10, 100, 500, dan 1000 ppm.
inkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit.
Sedangkan dengan antioksidan
Selanjutnya diukur nilai absorbansi
pembanding yaitu vitamin C (asam
larutan dengan menggunakan
askorbat) yang telah kita ketahui sebagai
spektrofotometer UV-Visible pada
antioksidan dengan konsentrasi 1, 2, 3, 4,
panjang gelombang 517 nm. Setelah itu
dan 5 ppm. Pada tabel nilai absorbansi
dicatat nilai yang tertera pada layar
yang digunakan yaitu nilai yang diberi
spektrofotometer. Nilai absorbansi yang
warna font merah. Larutan blangko pun
didapat kemudian digunakan untuk
dibuat dengan penambahan 2 ml methanol
menghitung % inhibisi.
dan 1 ml DPPH. Pengulangan tiga kali
HASIL DAN PEMBAHASAN
untuk mencari nilai absorbansi yang
Data praktikum uji antioksidan shift
terbaik serta menyesuaikan dengan
2 tertera pada tabel 1 dibawah ini.
konsentrasi sebelumnya. Setelah itu
dihitung nilai % inhibisi yang dicari 0.0286x = 28.174
dengan rumus: x = 985.104 ppm.
𝑎𝑏𝑠 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜−𝑎𝑏𝑠 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 Nilai R2 yang didapatkan yaitu
% inhibisi = x 100%
𝑎𝑏𝑠 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜
0.7158. Nilai R2 yang dapat ditoleransi
Didapatkanlah nilai %inhibisi dari yaitu 0,9-0,99 yang berarti data yang
masing – masing sampel dari berbagai didapatkan tidak begitu baik. Nilai IC50
konsentrasi. Kemudian dibuat grafik ekstrak R. mucronata yang didapat dari
untuk mendapatkan persamaan linear dan praktikum ini adalah 985.104 ppm.
mencari nilai IC50. Grafik hubungan Berdasarkan kriteria aktivitas antioksidan
konsentrasi ekstrak etil asetat daun R. pada Tabel 2, IC50 sebesar 985.104 ppm
mucronata dengan % inhibisi dapat dilihat menempati kriteria tidak memiliki
pada gambar 1 dibawah ini. antioksidan. Adanya aktivitas antioksidan
Hubungan Konsentrasi Ekstrak Etil Asetat
Daun R. mucronata dengan % inhibisi ditandai dengan perubahan warna larutan
100 84.99
74.11 dari ungu menjadi kuning, dengan warna
80 69.7 70.54
larutan awal larutan DPPH ungu. Hasil
% Inhibisi

60 45.4
40 y = -0.0286x + 78.174 pengujian antivitas antioksidan ekstrak
R² = 0.7158
20 ethil asetat daun R. mucronata
0
0 500 1000 1500
menunjukkan perubahan warna kuning
Konsentrasi ekstrak (ppm) pada konsentrasi 1000 ppm saja. Jika
Gambar 1. Hubungan konsentrasi ekstrak
daun R. mucronata dengan % inhibisi dibandingkan dengan hasil penelitian
Nilai IC50 ekstrak daun R. Kasitowati dkk. (2017) bahwa hanya pada
mucronata dapat ditentukan melalui konsetrasi 250 ppm ekstrak etil asetat
persamaan regresi linier yang terdapat daun R. mucronata terbentuk perubahan
pada gambar 1. Persamaan yang didapat warna kuning. Tidak adanya kandungan
adalah y = -0.0286x + 78.174. Variabel x antioksidan ini dikarenakan pembuatan
merupakan nilai IC50 yang dicari. y=50 konsentrasi yang dibuat pada rentang yang
karena yang akan ditentukan adalah terlalu jauh dalam rangkaian
konsentrasi ekstrak untuk meredam 50% praktik/eksperimen (5 – 1000 ppm)
radikal bebas pada praktik kali ini yaitu terlihat dari grafik absorbansi yang
DPPH. Berikut perhitungannya. fluktuatif. Sedangkan jika dibandingkan
y = ax + b dengan penelitan Kasitowati dkk. (2017)
50= -0.0286x + 78.174 bahwa pada konsetrasi 31.25, 62.5, 125,
0.0286x = 78.174 - 50 dan 250 ppm dan mendapatkan
antioksidan yang bersifat lemah. Tetapi Hubungan Konsentrasi Asam Askorbat Dengan
% Inhibisi
walalupun tergolong lemah, ekstrak etil 91.23 91.51 90.95
100 83.69
asetat daun R. mucronata memiliki 80 67.5

% Inhibisi
potensi sebagai antioksidan karena di 60 y = 4.718x + 70.822
40 R² = 0.5243
dalamnya terkandung senyawa
20
antioksidan yaitu alkaloid (Kasitowati
0
dkk, 2017). Molyneux (2004) dalam 0 2 4 6
Konsentrasi (ppm)
Nuryana (___) menambahkan bahwa Gambar 2. Hubungan konsentrasi vitamin C
suatu zat mempunyai sifat antioksidan bila dengan % inhibisi

nilai IC50 kurang dari 200 ppm. Bila nilai Nilai IC50 vitamin C dapat
IC50 yang diperoleh berkisar antara 200- ditentukan melalui persamaan regresi
1000 ppm, maka zat tersebut kurang aktif linier yang terdapat pada gambar 2.
namun masih berpotensi sebagai zat Persamaan yang didapat adalah y = 4.718x
antioksidan. + 70.822. Variabel x merupakan nilai IC50
yang dicari. y=50 karena yang akan
Tabel 2. Kriteria Aktivitas Antioksidan
ditentukan adalah konsentrasi vitamin C
dengan metode DPPH (Nuryana dkk,
untuk meredam 50% radikal bebas pada
___)
praktik kali ini yaitu DPPH. Berikut
Kriteria Nilai IC50
Sangat kuat >50 ppm perhitungannya.
Kuat 50-100 ppm y = ax + b
Sedang 101-250 ppm
Lemah 251-500 ppm 50 = 4.718x + 70.822
Tidak - 4.718x = 70.822-50
memiliki >500 ppm
antioksidan -4.718x = 20.822
x = -4.413 ppm
Kemudian, untuk vitamin C juga Vitamin C merupakan kontrol positif
dibuat grafik untuk mencari persamaan yang digunakan pada praktikum ini.
linearnya pada gambar 2 dibawah ini. Tetapi hasil yang didapatkan malah
sebaliknya yaitu bernilai tidak terdifinisi
antioksidan. Hal ini disebabkan karena
perbandingan konsentrasi yang diberikan.
Konsentrasi yang digunakan yaitu 1, 2, 3,
4, dan 5 ppm. Sedangkan jika
dibandingkan dengan penelitan yang
dilakukan oleh Kasitowati dkk (2017) pada reagen DPPH, dari ungu menjadi
bahwa pada konsetrasi 2, 4, 6, dan 8 ppm kuning (Lupea, et al. 2006).
didapatkan nilai IC50 4.419 ppm. Diduga
penentuan konsentrasi awal menjadi
penyebab nilai IC50 vitamin C tidak
terdefinisi antioksidan. Kesalahan
terbesar umumnya yaitu pada saat
Gambar 3. Reaksi radikal DPPH dengan
pengenceran. antioksidan (sumber : Prakash, Rigelhof, dan
Miller, 2001)
Sayangnya dalam praktikum kali
Telah diketahui juga bahwa ekstrak
ini, data yang dihasilkan diragukan
etil asetat daun mangrove R. mucronata
keakuratan datanya. Dibuktikan dengan
mengandung senyawa antioksidan
adanya nilai regresi dari grafik liner
alkaloid pada penelitian Kasitowati dkk.
hubungan antara konsentrasi ekstrak
(2017). Alkaloid memiliki rumus senyawa
maupun vitamin C terhadap % inhibisi
yang memiliki atom hidrogen didalamnya.
yang tidak mencapai 0,9-0.99 atau 90%.
Ini mungkin dikarenakan adanya
kesalahan dalam proses pembuatan
larutan stok ataupun proses pengenceran
sehingga konsentrasi larutan yang
didapatkan tidak sesuai dan
mempengaruhi hasil dari pengukuran %
inhibisi dan IC50.
Gambar 4. Struktur alkaloid
Prinsip metode uji antioksidan (sumber : https://www.doterra.com)
DPPH didaasarkan pada reaksi
KESIMPULAN
penangkapan atom hidrogen oleh DPPH
Hasil praktikum uji antioksidan
(reduksi DPPH) dari senyawa antioksidan.
ekstrak etil asetat daun R. mucronata
Reagen DPPH berperan sebagai radikal
disimpulkan bahwa tidak adanya aktivitas
bebas yang diredam oleh senyawa
antioksidan dengan konsentrasi 5, 10, 100,
antioksidan yang terkandung dalam
500, dan 100 ppm dengan nilai IC50
sampel. Selanjutnya DPPH akan tereduksi
985.104 ppm yang dibandingkan dengan
menjadi senyawa diphenyil picryl
kriteria aktivitas antioksidan dengan
hydrazine (DPPH-H). Reduksi menjadi
metode DPPH yaitu >500 tidak memiliki
DPPH-H menyebabkan perubahan warna
antioksidan. Senyawa alkaloid dalam Sadeli. 2016. Uji Aktivitas Antioksidan
daun R. mucronata kurang aktif namun dengan Metode DPPH (1,1-
Diphenyl-2-Picrylhydrazy)
masih berpotensi sebagai zat antioksidan.
Ekstrak Bromelain Buah Nanas
(Ananas comosus (L) Merr.).
DAFTAR PUSTAKA
Skripsi Program Studi Farmasi.
Dottera. Part 6: Phytochemistry-Alkaloids. Universitas Sanata Dharma:
Link : Yogyakarta.
https://www.doterra.com/US/en/b
otany-plant-phytochemistry-plant- Sunardi, K.I., 2007. Uji Aktivitas
alkaloids (13 November 2017). Antioksidan Ekstrak Belimbing
Wuluh (Averrhoa blimbi, L.)
Kasitowati, dkk. 2017. Potensi terhadap 1,1-Diphenyl-2-
Antioksidan dan Skrining Picrylhidrazyl (DPPH). Seminar
Fitokimia Ekstrak Daun Mangrove Nasional Teknologi, 1-9.
Rhizopora mucronata, Pilang
Probolinggo. Jurnal Penelitian
Universitas Brawijaya. Link
jfmr.ub.ac.id/index.php/jfmr/articl
e/download/34/24 (13 November
2017).
Lupea, A.X., et al. 2006. Short
Communication Improved DPPH
Determination for Antioxidant
Activity Spectrophotometric
Assay. Chem Pap 3: 214-216.
Molyneux. 2004. The use of the stable free
radical diphenyl picrylhydrazil
(DPPH) for estimating antioxidant
activity. Journal Science and
Technology.
Nuryana, dkk. ___. Aktivitas Antibakteri
dan Antioksidan Daun Bruguiera
hainesii dari Pulau Tunda. Jurnal
Program Studi Ilmu Kelautan
FPIK UNPAD.
Prakash, A/. Rigelhof, F., and Miller, E.
2001. Antioxidant Activity:
Medallion Laboratories,
Analithycal Progress, 19(2), 1-4.
 LAMPIRAN

No Gambar Keterangan
1 Perlakuan akhir dengan penambahan
DPPH terbentuk warna larutan kuning
pada konsentrasi 1000 ppm.

2 Pengukuran nilai absorbansi sampel

dengan menggunakan
spektrofotometri UV-Visible pada
panjang gelombang 517 nm.

3 Menghomogenkan larutan
menggunakan vortex.